nghiên cứu trích ly hoạt chất sinh học từ cây thuốc dòi (pouzolzia zeylanca l benn)

Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích ly .... 29 4.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ CÂY THUỐC DÒI

(POUZOLZIA ZEYLANCA L BENN)

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Cần thơ, 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY HOẠT CHẤT SINH HỌC TỪ CÂY THUỐC DÒI

(POUZOLZIA ZEYLANCA L BENN)

MSSV: C1200650 Lớp: CB1208L1

Cần thơ, 2014

Luận văn đính kèm theo đây với đề tài “Khảo sát hoạt chất sinh học từ cây thuốc

dòi (Pouzolzia Zeylanca L Benn)” do sinh viên Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn thực hiện

và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Cần Thơ, ngày tháng 5 năm 2014 Giáo viên hướng dẫn Chủ tịch hội đồng

PGs.Ts NGUYỄN MINH THỦY

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác

Ngày 20/05/2014 Người hướng dẫn Người viết

PGs.Ts NGUYỄN MINH THỦY HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN

LỜI CẢM ƠN Nhờ sự quan tâm, hướng dẫn của thầy cô và sự giúp đỡ nhiệt tình của bạn bè, tôi đã hoàn thành luận văn tốt nghiệp của mình

Lời đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Cô Nguyễn Minh Thủy Cô luôn quan tâm và nhiệt tình chỉ dẫn, Cô sẵn sàng hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn chị Trần Thị Thùy Linh và bạn Lê Thị Ngọc Mỷ đã đồng hành cùng tôi trong quá trình nghiên cứu Đồng cảm ơn anh Nguyễn Bảo Trương, anh Đinh Công Dinh và anh Nguyễn Ái Thạch đã nhiệt tình giúp đỡ trong suốt thời gian thực hiện

đề tài

Xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình giảng dạy, đã tạo mọi điều kiện

và giúp em rất nhiều trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn các bạn lớp Công nghệ thực phẩm liên thông khóa 38 đã cùng tôi vượt qua những khó khăn và tạo cho tôi nhiều động lực để hoàn thành đề tài luận văn với kết quả tốt nhất cũng như trong suốt khóa học

Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2014

Sinh viên thực hiện

HUỲNH THỊ NGỌC NHẪN

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN ii

LỜI CẢM ƠN iiii

DANH SÁCH HÌNH viii DANH SÁCH BẢNG viiii

TÓM LƯỢC ix

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Sơ lược về cây thuốc dòi 2

2.1.1 Mô tả thực vật 2

2.1.2 Phân bố sinh thái 2

2.1.3 Dược tính 2

2.2 Trích ly 3

2.2.1 Khái niệm trích ly 3

2.2.2 Một số yêu cầu cơ bản đối với các chất trích ly ra từ nguyên liệu thực vật 3 2.2.3 Phương pháp trích ly 4

2.2.3.1 Chọn dung môi 4

2.2.3.2 Cách trích và dụng cụ trích 4

2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly 5

2.2.4.1 Loại dung môi 5

2.2.4.2 Nồng độ dung môi 5

2.2.4.3 Kích thước nguyên liệu 5

2.2.4.4 Nhiệt độ trích ly 6

2.2.4.5 Tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu 6

2.2.4.6 Thời gian trích ly 6

2.3 Hoạt chất sinh học 7

2.3.1 Hợp chất polyphenol 7

2.3.1.1 Tính chất của polyphenol 7

2.3.1.2 Vai trò của các polyphenol 7

2.3.2 Hợp chất anthocyanin 8

2.3.2.1 Cấu trúc anthocyanin 9

2.3.2.2 Tính chất của anthocyanin 10

2.3.2.3 Công dụng của anthocyanin 12

2.3.3 Hợp chất tannin 13

2.3.3.1 Phân loại 13

2.3.3.2 Tính chất của tannin 16

2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của tannin 19

2.3.3.4 Vai trò và ứng dụng của tannin 20

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.1 Phương tiện nghiên cứu 21

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 21

3.1.2 Nguyên liệu 21

3.1.3 Thiết bị và hóa chất 21

3.1.3.1 Dụng cụ và thiết bị 21

3.1.3.2 Hóa chất 21

3.2 Phương pháp thí nghiệm 21

3.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát ảnh hưởng của bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu đến hàm lượng các hoạt chất sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi 22

3.2.2 Thí nghiệm 2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/ nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp xử lý đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 23

3.2.3 Thí nghiệm 3 Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích ly 24

3.2.4 Công thức tính hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học 25

3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong các bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu 26

4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 27

4.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 28

4.2.2 Ảnh hưởng biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 28 4.2.3 Ảnh hưởng phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 29 4.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích 30 4.3.1 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất polyphenol 30 4.3.2 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất tannin 31 4.3.3 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất anthocyanin 36 CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC I

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Các anthocyanin quan trọng nhất trong tự nhiên (Rein, 2005) 9

Hình 2.2 Cấu trúc một số anthocyanin tự nhiên 10

Hình 2.3 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanin theo pH 11

Hình 2.4 Một số dạng của pyogallic tannin 14

Hình 2.5 Một số monomer đơn phân tử 14

Hình 2.6 Acicd meta - digallic 15

Hình 2.7 Acid chebulic và acid hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic hexahydroxydiphenic 15

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình trích ly 22

Hình 4.1 Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 10 phút) 32 Hình 4.2 Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 20 phút) 33 Hình 4.3 Hiệu suất trích ly tannin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 30 phút) 33 Hình 4.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC), thời gian (phút), pH dịch trích 3 đến hiệu suất thu hồi tannin (%) 34

Hình 4.5 Tương quan giữa hiệu suất trích ly tannin lý thuyết và thực tế 35

Hình 4.6 Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 10 phút) 37

Hình 4.7 Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 20 phút) 38

Hình 4.8 Hiệu suất trích ly anthocyanin ở các pH khác nhau (thời gian trích ly 30 phút) 38

Hình 4.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ (oC) và thời gian (phút) ở pH dịch trích là 3 đến hiệu suất thu hồi anthocyanin (%) 39

Hình 4.10 Tương quan giữa hiệu suất trích ly anthocyanin lý thuyết và thực tế 40 Hình A1 Đường chuẩn acid gallic II

DANH SÁCH BẢNG Bảng 2.1 Màu sắc anthocyanin thay đổi theo pH 12 Bảng 4.1 Hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi theo bộ phận và đặc tính nguyên liệu 26 Bảng 4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu

và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 27 Bảng 4.3 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 28 Bảng 4.4 Ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 29 Bảng 4.5 Ảnh hưởng phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học 29 Bảng 4.6 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất polyphenol 30 Bảng 4.7 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi hoạt chất tannin 31 Bảng 4.8 Ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất trích ly hoạt chất anthocyanin 36

TÓM LƯỢC

Nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở khảo sát ảnh hưởng của (i) bộ phận cây (lá non, lá già, thân) và đặc tính nguyên liệu (nguyên liệu tươi, nguyên liệu khô) đến hàm lượng các hoạt chất sinh học polyphenol tổng, tannin, anthocyanin; (ii) tỷ

lệ nguyên liệu thuốc dòi:nước (1:5, 1:10, 1:15, 1:20), biện pháp xử lý nguyên liệu (nguyên cây, cắt nhỏ) và phương pháp xử lý khuấy trộn (không khuấy trộn, khuấy trộn) đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học; (iii) pH (3÷6), nhiệt độ (70÷90 o C) và thời gian trích ly (10÷30 phút) đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học

Kết quả nghiên cứu cho thấy các hoạt chất sinh học tập trung nhiều ở bộ phận lá của cây thuốc dòi và đặc biệt có hàm lượng cao khi nguyên liệu ở trạng thái tươi Hàm lượng polyphenol (17,74%) và tannin (12,75%) tập trung nhiều ở bộ phận lá non của cây, riêng anthocyanin (0,36%) có nhiều trong lá già của cây Ở tỷ lệ thuốc dòi:nước là 1:15, khi cắt nhỏ nguyên liệu kết hợp với phương pháp khuấy trộn cho hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học cao Ở nhiệt độ 90 o C, thời gian 30 phút và

pH 3 cho hiệu suất thu hồi anthocyanin (87,3%) và tannin (64,96%) cao nhất Hiệu suất thu hồi polyphenol cao khi trích ly ở nhiệt độ 90 o C, thời gian 30 phút và dung môi pH 5 (72,14%)

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Ở nước ta, cây thuốc dòi phân bố rộng rãi khắp các tỉnh từ đồng bằng đến trung du

và miền núi Thuốc dòi là loại cây ưa ẩm, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ trong vườn Chúng là loại thân thảo mộc, sống quanh năm có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát

có tác dụng tiêu khát, trừ đờm,…Theo y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại, cây thuốc dòi có tác dụng chữa trị: cảm ho, ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi, đau răng, tiêu viêm, rút mủ Ngoài ra, cây thuốc dòi còn có thể kết hợp với những vị thuốc khác tạo ra vị thuốc chữa trị rất hữu hiệu chẳng hạn khi kết hợp giữa cây công

chúa lá rộng (Canga latifolia) và cây thuốc dòi (Pouzolzia indica) có khả năng

chống lại ung thư Tuy nhiên, cây thuốc dòi chỉ được biết đến với vai trò là vị thuốc dân gian dễ tìm dùng chữa trị một số bệnh Việc tách chiết hay khảo sát các hoạt tính sinh học trong cây thuốc dòi vẫn chưa được các nhà nghiên cứu trong nước quan tâm và thậm chí hiện nay cây được xem như là cỏ dại

Ngày nay cùng với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học kỹ thuật và công nghệ, các biệt dược đi từ nguồn tổng hợp có tác dụng ức chế miễn dịch hiện đang được sử dụng rộng rãi nhưng chúng lại đắt tiền và có nhiều tác dụng phụ gây nguy hiểm Vì vậy, xu hướng hiện nay là tìm các hoạt chất thiên nhiên từ các thảo mộc có tác dụng như thuốc tổng hợp nhưng lại ít độc và dễ dung nạp Đặc biệt với xu hướng hiện đại hóa, xã hội rất chuộng những sản phẩm thực phẩm sinh học vừa đáp ứng nhu cầu ăn uống, vừa có tính năng phòng trị bệnh

Nhằm tận thu nguồn nguyên liệu dồi dào và nâng cao giá trị kinh tế của cây thuốc dòi, nghiên cứu trích ly các hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi để làm cơ sở cho quá trình chế biến nước uống sinh học từ loại nguyên liệu hữu dụng này

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định điều kiện tối ưu cho quá trình trích ly các hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi ở mức độ cao nhất

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về cây thuốc dòi

Tên thường gọi: Bọ mắm, thuốc dòi

Tên khoa học: Pouzolzia zeylanica (L) Benn hoặc Pouzolzia indica Gaud

Họ: Urticaceae (họ gai)

2.1.1 Mô tả thực vật

Thuốc dòi là loài thảo mộc sống quanh năm, thân thẳng đứng hướng lên, đơn giản

và có nhánh Cây cao khoảng 12÷50cm Thân rễ thường có mấu, cành cây thường ngắn có lông Lá mọc so le thỉnh thoảng đối xứng, mép nguyên, hình mác – bầu dục, gốc tròn, đầu nhọn, dài 3÷9cm, rộng 1,5÷2,5cm, có 3 gân tỏa từ gốc, mặt trên đôi khi điểm những đốm trắng, mặt dưới có ít lông ở gân nổi rõ, cuống lá ngắn có lông trắng (Đỗ Huy Bích và cộng sự)

Cụm hoa thường có cả hoa đực và hoa cái Bầu nhụy có dạng elip hoặc hình thoi, đường kính bầu nhụy từ 0,8÷1mm Quả có đường kính 1,5÷1,8mm, có lông măng không dễ thấy, trên quả có 9 đường gân hoặc có 4 cạnh, trên đỉnh quả có 2 nhánh như 2 răng nhọn Quả có màu trắng sáng hoặc màu vàng tối hoặc màu nâu sáng, hình trứng

Cây thuốc dòi ra hoa từ tháng 7 – 8 và bắt đầu có quả từ tháng 8 – 10

2.1.2 Phân bố sinh thái

Thuốc dòi là cây ưa ẩm, hơi chịu bóng, thường mọc lẫn với các loại cây cỏ trong vườn, ven đường đi và nương rẫy

Ở Việt Nam thuốc dòi phân bố rộng rãi khắp các tỉnh từ đồng bằng đến trung du và

cả vùng núi Ngoài ra, còn thấy ở nhiều nước Châu Á khác như Trung Quốc, Lào, Campuchia, Ấn Độ, Thái Lan,…

2.1.3 Dược tính

Cây thuốc dòi có vị ngọt, đắng nhạt, tính mát, có tác dụng tiêu khát, trừ đờm, lợi tiểu, tiêu viêm, rút mủ Người ta thường dùng cả phần trên mặt đất lẫn phần dưới mặt đất của cây thuốc dòi Theo y học cổ truyền và các nghiên cứu hiện đại, cây thuốc dòi thường được sử dụng trị:

 Cảm ho hoặc ho lâu ngày, viêm họng, bệnh về phổi

 Lỵ, viêm ruột

 Nhiễm trùng đường tiết niệu, bí tiểu tiện

 Đau răng

Nấm da cứng

 Dùng ngoài trị đinh nhọt, sâu quảng, viêm mủ da, viêm vú, đụng giập

 Ở Ấn Độ, cây dùng trị giang mai, bệnh lậu và nọc độc rắn

 Ở Malaysia, dịch lá tươi sắc lá dùng uống như là lợi sữa khi có hiện tượng ngưng tiết sữa

Một số bài thuốc trong Đông y:

- Chữa ho lao hay ho lâu ngày: Dùng 40g thuốc dòi sắc uống hoặc nấu cao lỏng pha với mật ong uống mỗi ngày vài lần, mỗi lần từ 15mL đến 20mL

- Chữa trị các bệnh viêm họng, đau răng: dùng lá cây thuốc dòi giã lấy nước uống

- Chữa tắc tia sữa, tiểu gắt, tiểu buốt: dùng 30÷40g cây sắc uống mỗi ngày

Ngày nay trong y học, cây thuốc dòi còn sử dụng kết hợp với những vị thuốc khác nhằm tạo ra những loại thuốc có công hiệu rõ rệt Chẳng hạn như khi nấu thuốc dòi

(Pouzolzia indica) với cây công chúa lá rộng (Canga latifolia) để uống có khả năng

Trích ly là quá trình khuếch tán Trích ly ở nhiệt độ phòng không có đảo trộn xảy ra

do khuếch tán phân tử, khi đun nóng hoặc có khuấy trộn gọi là khuếch tán đối lưu (Tấn Minh Tâm, 1998)

Hiệu số nồng độ các chất hòa tan ở hai pha tiếp xúc nhau là động lực của quá trình Chất tan chuyển dời về phía có nồng độ nhỏ từ pha này sang pha khác (từ pha lỏng này sang pha lỏng khác hoặc từ pha rắn sang pha lỏng) Khi sự chênh lệch nồng độ lớn lượng chất trích ly tăng

2.2.2 Một số yêu cầu cơ bản đối với các chất trích ly ra từ nguyên liệu thực vật

Dù xuất phát từ loại nguyên liệu nào thì các sản phẩm trích ly ra muốn tồn tại trên thị trường cần đạt một số yêu cầu sau:

- Hàm lượng hoạt chất cao và ổn định

- Có tác dụng tốt cho đối tượng sử dụng

- Phải có tính hòa tan chọn lọc, tức là hòa tan tốt các chất cần tách mà không được hòa tan hoặc hòa tan ít các chất khác

- Không có tác dụng hóa học với các cấu tử của dung dịch

- Không phá hủy thiết bị

- Rẻ và dễ tìm

- Đối với trích ly lỏng – lỏng yêu cầu khối lượng riêng của dung môi khác xa với khối lượng riêng của dung dịch (Nguyễn Bin, 2008)

- Không bị biến đổi thành phần khi bảo quản

- Dung môi phải được tách ra sau quá trình trích ly bằng phương pháp đun nóng, chưng cất hoặc sấy Sau khi tách không để mùi vị lạ và không gây độc cho sản phẩm

2.2.3.2 Cách trích và dụng cụ trích

Có nhiều loại thiết bị trích ly: Gián đoạn một bậc hoặc nhiều bậc, liên tục, tổng hợp một số nhóm thiết bị, chúng còn khác nhau về hình dáng, khác nhau về cơ cấu vận chuyển vật liệu và dung môi trong thiết bị, cơ cấu khuấy đảo, mức độ phức tạp của thiết bị Một thiết bị sử dụng để trích ly cần đảm bảo các yêu cầu sau:

- Trích ly triệt để các cấu tử ra khỏi hỗn hợp

- Tổn thất trong bã nhỏ, nồng độ dung dịch cao, chất lượng tốt

- Cấu tạo đơn giản, không phức tạp, dễ lắp ráp sửa chữa, dễ thao tác

Trong thực tế người ta thường sử dụng hai phương pháp trích ly ở nhiệt độ thường

và trích ly nóng

 Trích ly nhiệt độ thường

Có hai phương pháp: trích ly ngấm kiệt và trích ly phân đoạn Phương pháp trích ly ngấm kiệt cho kết quả tốt hơn trích ly phân đoạn do trích ly được nhiều hoạt chất và tốn ít dung môi, giảm sức lao động và tăng năng suất

Ngoài ra còn có những phương pháp trích ly khác như:

- Trích ly ở áp suất thấp trong chân không

- Trích ly ở áp suất cao

- Trích ly với tác dụng của siêu âm

- Trích ly với tác dụng của chất hoạt điện

2.2.4 Các nhân tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

2.2.4.1 Loại dung môi

Quá trình hình thành một dung dịch tùy thuộc vào đặc tính của chất tan và dung môi Để hình thành một dung dịch trước hết phải có sự phá vỡ các cầu nối liên kết trong hợp chất tan và trong dung môi để từ đó hình thành dây liên kết mới giữa chất tan và dung môi

Chính vì thế, dung môi có thể sử dụng để trích ly một chất tan hoặc một nhóm chất tan nào đó ra khỏi nguyên liệu phải phù hợp với bản chất mà ta mong muốn trích ly, phù hợp với độ phân cực của chất muốn trích ly Hay nói cách khác, dung môi khác nhau có hiệu suất trích ly khác nhau Hiệu suất trích ly phản ánh một quá trình trích

ly Quá trình công nghệ trích ly tốt hiệu suất trích ly cao

sử dụng trong quá trình trích ly là yếu tố quan trọng cần xác định để đảm bảo hiệu suất trích ly và hiệu quả kinh tế của quá trình

2.2.4.3 Kích thước nguyên liệu

Với các loại nguyên liệu rắn, cần tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung môi Điều này được thực hiện bằng cách nghiền nhỏ, thái nhỏ, băm nhỏ nguyên liệu Làm nhỏ kích thước nguyên liệu giúp phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu

Kích thước càng nhỏ thì quá trình trích ly càng dễ và hiệu suất trích ly càng cao Tuy nhiên nếu quá mịn sẽ bị lắng đọng trên lớp nguyên liệu, tắc ống dẫn hoặc bị dòng dung môi cuốn vào mixen làm dung dịch có nhiều cặn, làm phức tạp cho quá trình xử lý tiếp theo, tốn chi phí (Lê Bạch Tuyết, 1996)

Kích thước vật liệu quá lớn thì dung môi không đi vào nội phân tử, do diện tích tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu nhỏ nên gây sự hao hụt lớn về lượng chất trích ly ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly

Việc xác định kích thước vật liệu có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly Việc lựa chọn kích cỡ vật liệu trong quá trình trích ly rất quan trọng để đảm bảo hiệu suất, dễ

áp dụng trong sản xuất thực tế

2.2.4.4 Nhiệt độ trích ly

Nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, phân tử chất hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi Khi tăng nhiệt độ trích ly, các phân tử dung môi và chất tan xảy ra sự chuyển động hỗn độn làm tăng vận tốc khuếch tán từ nguyên liệu vào dung môi nhờ vậy mà hiệu suất trích ly tăng Tuy nhiên, nhiệt độ là một yếu tố giới hạn Nhiệt độ quá thấp thì thời gian trích ly dài gây ảnh hưởng hiệu suất trích ly, chi phí cao Nhiệt độ quá cao thì sản phẩm cháy khét, các chất hòa tan bị biến đổi do xảy ra các phản ứng không cần thiết, ảnh hưởng lớn đến sản phẩm, chi phí cao cho phần cung cấp nhiệt Vì vậy, cần xác định nhiệt độ trong quy trình trích ly để đảm bảo sản phẩm đạt hiệu quả về chất lượng và kinh tế

2.2.4.5 Tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu

Nếu tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình trích ly xảy ra không triệt để, hiệu suất trích ly thấp Nếu tỷ lệ này quá lớn gây hao tổn dung môi, tốn chi phí Hiệu suất trích ly sẽ đạt cao nhất tại một tỷ lệ nhất định nào đó và không tăng hoặc tăng không đáng kể khi thêm dung môi Do đó, khi tiến hành trích chất hòa tan nào đó từ nguyên liệu cần cân nhắc giữa chi phí tổn thất cho dung môi và hiệu suất thu được để đạt lợi nhuận cao Đây cũng là giới hạn của quá trình trích ly

2.2.4.6 Thời gian trích ly

Khi thời gian tăng lượng chất trích ly tăng nhưng chỉ ở một giới hạn nhất định Khi

đã đạt được mức độ trích ly cao nhất kéo dài thời gian không mang lại hiệu quả kinh

tế

2.3 Hoạt chất sinh học

2.3.1 Hợp chất polyphenol

Polyphenol là hợp chất mà phân tử của chúng chứa nhiều vòng benzene, trong đó có một, hai hoặc nhiều hơn hai nhóm hydroxyl Dựa vào đặc trưng của cấu tạo hóa học người ta chia các hợp chất polyphenol thành ba nhóm chính:

Nhóm hợp chất phenol C6 – C1: Acid gallic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3: Acid cafeic

Nhóm hợp chất phenol C6 – C3 – C6: Catechin, flavonoid

2.3.1.2 Vai trò của các polyphenol

Các hợp chất phenol là một trong những nhóm sản phẩm trao đổi chất bậc hai chủ yếu của thực vật, rất đa dạng về cấu trúc và chức năng

Polyphenol bảo vệ thực vật trước tia cực tím, chống lại sự oxy hóa, bảo vệ thực vật trước sự tấn công của vi sinh vật gây hại (như vi khuẩn gây thối rễ ở khoai tây) Sự

có mặt của anthocyanin mang lại màu tím cho quả sim, nho, dâu tây, táo và một số màu trung gian của một số loại hoa Bên cạnh đó, flavonoid cũng có vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, phát triển hoa quả, thúc đẩy sự sinh tồn của cây Ong thích màu xanh, màu vàng; bướm thích màu hồng và màu trắng; ruồi thích màu trắng; chim sâu thích màu đỏ Các màu này đều do hợp chất flavonoid tạo nên (Đái Duy Ban, 2008)

Ngoài ra các polyphenol còn có tác dụng ức chế nấm, bình thường trong thực vật tác dụng đó thể hiện tương đối yếu nhưng nó sẽ tăng lên một cách mạnh mẽ trong quá trình polyphenol bị oxy hóa bởi enzyme Tuy nhiên, đóng vai trò quan trọng trong hiện tượng miễn dịch thực vật này không phải chỉ một mình polyphenol mà là

hệ polyphenol – polyphenoloxydase Người ta đã chứng minh rằng trong nhiều cây

bị tổn thương cơ học hay bị nhiễm trùng thì hàm lượng polyphenol và hoạt độ polyphenoloxydase đều tăng lên Ở chỗ mô bị tổn thương bắt đầu tạo thành hợp

chất polyphenol mới và kèm theo sự ngưng tụ oxy hóa trong lớp bề mặt – sản phẩm ngưng tụ tạo thành lớp bảo vệ (Lê Ngọc Tú, 2003)

Là vật liệu góp phần vào độ bền chức của thực vật và sự thẩm thấu của thành tế bào đối với nước và khí Nhiều polyphenol có hoạt tính sinh tố P nghĩa là có khả năng làm tăng độ đàn hồi và chuẩn hóa tính thấm của vi ti huyết quản Trong số đó catechin có hoạt tính vitamin P cao nhất (Lê Ngọc Tú, 2003)

Các hợp chất polyphenol là những chất hoạt động giữ vai trò chủ đạo quyết định hương vị, màu sắc của nhiều sản phẩm thực phẩm và ở mức độ nhất định chúng tham gia vào quá trình tạo ra các cấu tử thơm mới đặc biệt cho sản phẩm Các polyphenol trong trà mang lại vị chát cho trà Các sản phẩm trà đen, trà đỏ, trà vàng, trà xanh,… với sắc nước hương thơm và vị đặc trưng rất khác nhau, phụ thuộc vào mức độ chiều hướng của phản ứng oxy hóa bởi enzyme và phi enzyme các polyphenol trong lá trà L-epigallocatechin (L-EGC) và L-epigallocatechin gallate (L-EGCG) có khả năng tạo thành sản phẩm có màu đỏ tươi đặc trưng của trà đen (Đái Duy Ban, 2008)

Ngoài ra polyphenol còn là chất bảo quản tự nhiên không gây độc hại cho các sản phẩm thực phẩm Trong sản phẩm đồ hộp, để bảo vệ các màu sắc tự nhiên người ta cho thêm các chất chống oxy hóa như: thêm rutin để bảo vệ màu của anh đào và mận, thêm tannin để bảo vệ màu của dâu và anh đào (Lê Ngọc Tú, 2003)

Các hợp chất phenol có khả năng chống oxy hóa mạnh, do đó giúp cơ thể ngăn ngừa stress oxy hóa, ngăn ngừa các bệnh ung thư, tim mạch, các bệnh về mắt, bệnh lão hóa sớm Tannin có khả năng bình thường hóa hoạt động của hệ vi khuẩn có ích trong ruột, ngăn ngừa quá trình thối rữa, sinh hơi và rối loạn khác làm cản trở hoạt động của ruột (Đái Duy Ban, 2008) Đặc biệt, chất chống oxy hóa EGCG (epigallocatechin gallate) là loại polyphenol vô cùng mạnh, nó có công dụng ngăn ngừa các enzyme kích hoạt sự sao chép nhân bản tế bào ung thư

Hợp chất flavonoid có khả năng ngăn ngừa cholesterol xấu, chống tụ máu, chống

xơ cứng động mạch Catechin tạo vị đắng, có công dụng hữu hiệu trong việc tiêu diệt hầu hết những loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm và giải trừ luôn những độc

tố do tiết ra cụ thể là là độc tố veratoxin của Ecoli

(http://www.mayhaiche.vn/article_d/c3-37/tra-xanh-doi-voi-suc-khoe-con-nguoi) 2.3.2 Hợp chất anthocyanin

Các anthocyanin thuộc nhóm các chất màu tự nhiên tan trong nước lớn nhất trong giới thực vật Thuật ngữ anthocyanin bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp, trong đó anthoccyanin là sự kết hợp giữa Anthos – nghĩa là hoa và Kysanesos – nghĩa là màu xanh Tuy nhiên, không chỉ có màu xanh anthocyanin còn mang đến cho thực vật nhiều màu sắc rực rỡ khác như hồng, đỏ, cam và các gam màu trung gian Các

anthocyanin khi mất hết nhóm đường được gọi là anthocyanidin hay aglycon Mỗi anthocyanidin có thể bị glycosyl hóa bởi các loại đường và các acid khác tại các vị trí khác nhau Vì thế, hàm lượng anthocyanin lớn hơn anthocyanidin từ 15–20 lần

2.3.2.1 Cấu trúc anthocyanin

Anthocyanin thuộc nhóm các hợp chất flavonoid, có khả năng hòa tan trong nước

và chứa trong các không bào Về bản chất, các anthocyanin là hợp chất glycoside của các dẫn suất polyhydroxyl và polymethoxyl của 2-phenylbenzopyrylium hoặc muối flavylium

Ngày nay, có 20 anthocyanidin khác nhau được biết đến nhưng chỉ có 6 trong số đó

là phổ biến và quan trọng nhất Các anthocyanidin quan trọng nhất là pelargonidin, cyanidin, delphinidin, peonidin, petunidin, và maldivin (hình 2.1) Những aglycon khác nhau ở số lượng của các nhóm hydroxyl và methoxyl trong vòng B của cation flavylium (Rein, 2005)

Hình 2.1 Các anthocyanin quan trọng nhất trong tự nhiên

(Rein, 2005)

Trong tự nhiên, anthocyanin rất hiếm khi ở trạng thái tự do Nhóm hydroxyl tự do ở

vị trí C-3 làm cho phân tử anthocyanin trở nên không ổn định và làm giảm khả năng hòa tan của nó so với anthocyanin tương ứng Vì vậy, sự glycosyl hóa luôn diễn ra đầu tiên ở vị trí nhóm 3-hydroxyl Nếu có thêm một phân tử đường nữa thì vị trí tiếp theo bị glycosyl hóa thường gặp nhất là ở C-5 Ngoài ra sự glycosyl hóa còn có thể gặp ở vị trí C-7, C-3, C-5

Cyanidin Malvidin Delphinidin

Petunidin Peonidin

Pelargonidin

Loại đường phổ biến nhất là glucose, ngoài ra cũng có một vài monosaccharide (như galactose, ramose, arabinose), các loại disaccharide (chủ yếu là rutinose, sambubiose hay sophoroose) hoặc trisaccharide tham gia vào quá trình glycosyl hóa

Sự methoxyl hóa các anthocyanin và các glucoside tương ứng diễn ra thông thường nhất là ở vị trí C-3’ và C-5’, cũng có thể gặp ở vị trí C-7 và C-5 Tuy nhiên, cho đến nay người ta vẫn chưa tìm thấy một hợp chất nào bị glycosyl hóa hay bị methoxyl hóa trên tất cả các vị trí C-3, -5, -7 và -4’ do cần ít nhất một nhóm hydroxyl tự do để hình thành dạng cấu trúc quinondial bazơ (dạng cấu trúc của anthocyanin thường tồn tại trong không bào thực vật có pH từ 2,5 – 7,5)

(Nguồn: http.//www.hoahocvietnam.com./Home.Hoa-hoc-vui/Mau-cua-la-3.html)

Sự acyl hóa cũng có thể xảy ra ở vị trí C-3 của phân tử đường hay ester hóa ở nhóm hydroxyl C-6 Các nhóm acyl hóa chính là các phenolic acid như cafeic, ferulic hay sinapic acid và một loạt các acid như acid acetic, acid malic, acid malonic, acid succinic

2.3.2.2 Tính chất của anthocyanin

Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH môi trường (hình 2.3) Thông thường khi pH nhỏ hơn 7 các anthocyanin có màu đỏ, khi pH lớn hơn 7 thì có màu xanh Ở pH 1 các anthocyanin thường ở dạng muối oxinium màu cam đến đỏ, ở pH 4÷5 chúng có thể chuyển về dạng bazơ chalcon không màu, ở pH 7÷8 lại về dạng bazơ quinondial anhydro màu xanh (Lê Ngọc Tú, 2005)

Hình 2.2 Cấu trúc một số anthocyanin tự nhiên

Anthocyanin có bước sóng hấp thụ trong miền nhìn thấy, khả năng hấp thụ cực đại tại bước sóng 510÷540nm Độ hấp thụ là yếu tố liên quan mật thiết đến màu sắc của các anthocyanin chúng phụ thuộc vào pH của dung dịch, nồng độ anthocyanin: thường pH thuộc vùng acid mạnh có độ hấp thụ lớn, nồng độ anthocyanin càng lớn

độ hấp thụ càng mạnh

Anthocyanidin hiếm khi tìm thấy trong tự nhiên Chúng xuất hiện trong hoa quả và nhiều trong các loại quả berry chủ yếu ở dạng glycosyl hóa Anthocyanin ổn định và hòa tan trong nước hơn anthocyanidin bởi vì anthocyanin có gốc đường ở vị trí 3’-thường là glucose, sự hiện diện của đường này giúp anthocyanin hòa tan tốt trong nước, nếu đường bị thủy phân hoặc bị mất thì giảm tính hòa tan, làm mất ổn định Các đường phổ biến nhất của anthocyanin là một monosaccharide theo thứ tự: glucose, galactose, arabinose, xylose và các di- và tri-saccharide Tìm thấy hầu hết thường ở anthocyanin là rutinose, sophorose, sambubiose và glucoserutinose

Sự ổn định màu sắc của anthocyanin chịu tác dụng mạnh mẽ bởi các yếu tố như pH, nhiệt độ, dung môi, nồng độ và cấu trúc của anthocyanin, oxy, ánh sáng, enzyme,… Các đơn vị glycosyl và các nhóm acyl liên kết với aglycon, các vị trí của liên kết này có tác động ý nghĩa đến sự ổn định và khả năng phản ứng của phân tử anthocyanin Các dạng thay thế của anthocyanin, số lượng và vị trí của các nhóm hydroxyl và methoxyl trong aglycon cũng ảnh hưởng đến biến đổi hóa học của phân

tử màu

Khi tăng sự oxy hóa trên phân tử aglycon sẽ làm ổn định màu anthocyanidin Tuy nhiên, nếu tăng sự methyl hóa của nhóm hydroxyl sẽ làm suy yếu sự ổn định của anthocyanin Nhóm methoxyl ở vị trí C-4 và C-7 làm giảm ổn định sắc tố so với nhóm hydroxyl ở cùng vị trí (Rein, 2005) Chẳng hạn như trong dung dịch đệm

Hình 2.3 Sự thay đổi màu sắc của anthocyanin theo pH

(Ngồn: http://www.intechopen.com/books/the-mediterranean-genetic-code- grappevine-and-olive)

cyanidin 3-glucoside sẽ ổn định hơn pentunidin 3-glucoside là do có sự thêm nhóm methoxyl ở vị trí C5’ Cũng như peonidin 3-glucoside ổn định hơn malvidin 3-glucoside vì trong phân tử malvidin 3-glucoside có 5’-methoxyl Tuy nhiên, có trường hợp ngoại lệ là malvidin ổn định hơn pelargonidin nhưng kém ổn định hơn anthocyanin và peonidin 3-glucoside ổn định hơn pelargonidin 3-glucoside trong dung dịch đệm

Các nhóm chức methoxyl và hydroxyl không chỉ ảnh hưởng đến sự ổn định của anthocyanin mà còn ảnh hưởng đến sự hiển thị màu sắc Các sắc tố anthocyanin thay đổi từ màu đỏ sang màu xanh theo số lượng các nhóm chức hydroxyl Điều này ngược lại khi các nhóm methoxyl thay thế các nhóm hydroxyl

Các anthocyanin ổn định trong môi trường acid hơn trong môi trường kiềm Tuy nhiên, các anthocyanin được biết đến như một chất chỉ thị màu trong vùng pH từ 1÷14 Trong các môi trường pH khác nhau anthocyanin sẽ thay đổi thành các dạng ion có màu sắc khác nhau được thể hiện ở bảng 2.1

Oxy tạo điều kiện cho sự phân hủy anthocyanin Vì vậy việc loại bỏ oxy sẽ bảo vệ

sự phân hủy anthocyanin Oxy hiện diện cùng với nhiệt độ cao là sự kết hợp đối với màu sắc của anthocyanin, oxy và acid asscorbic có hại đối với sự ổn định của anthocyanin Sự bất ổn định của anthocyanin gây ra bởi oxy tăng khi pH gia tăng

Bảng 2.1 Màu sắc anthocyanin thay đổi theo pH

Màu Đỏ Đỏ Đỏ Đỏ nhạt Đỏ nhạt Tím nhạt Tím Xanh Xanh

Nguồn: Nguyễn Thị Phương Anh và Nguyễn Thị Lan (2007)

2.3.2.3 Công dụng của anthocyanin

Ngày nay, mối quan tâm về sắc tố anthocyanin được đẩy mạnh vì chúng mang lại lợi ích sức khoẻ trong chế độ ăn uống như chất chống oxy hóa Ngoài việc truyền màu sắc thu hút các loại côn trùng giúp cho sự thụ phấn của thực vật diễn ra tốt anthocyanin còn được biết là có tính năng tăng cường sức khỏe khác nhau như chống oxy hóa, chống hoạt động viêm và chống bệnh tiểu đường (Nizamutionva., 2009; Viskelis et al., 2010; Kawanobu et al., 2011)

Anthocyanin trong trái cây được coi là chất chống oxy hóa, chống gây ung thư, chống viêm và bệnh thần kinh nhiễm trùng do vi khuẩn (Kong et al., 2003; Rossi et al., 2003) Anthocyanin cũng có thể nâng cao giá trị dinh dưỡng của thực phẩm chế biến bằng cách ngăn cản quá trình oxy hóa của chất béo và protein trong sản phẩm thực phẩm

Anthocyanin là chất màu thiên nhiên được sử dụng khá phổ biến và an toàn trong thực phẩm, tạo ra nhiều màu sắc hấp dẫn cho mỗi sản phẩm thực phẩm Ngoài ra anthocyanin còn là hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý như: khả năng chống oxy hóa cao nên được sử dụng để chống lão hóa hoặc chống oxy hóa các sản phẩm thực phẩm, hạn chế suy giảm đề kháng; có tác dụng làm bền thành mạch, chống viêm, hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư; tác dụng chống các tia phóng xạ 2.3.3 Hợp chất tannin

Tannin đã được biết đến từ nhiều thế kỷ trước Ban đầu, thuật ngữ “tannin” là của người Tây Âu cổ đại dành cho cây sồi, đây là nguồn khai thác tannin tiêu biểu cho ngành thuộc da Tannin dùng trong ngành thuộc da là một bằng chứng rõ ràng nhất

về tính hoạt động của tannin, có nghĩa là tannin có khả năng tác động qua lại và làm kết tủa protein Do đó, người ta có thể nói rằng tính thuộc da là một tiêu chuẩn cơ bản để xếp các hợp chất vào nhóm tannin Khoảng cuối thế kỷ 18, con người bắt đầu thực hiện công việc phân lập các hoạt chất ra khỏi dung dịch trích ly từ thực vật dùng cho ngành thuộc da Các dung dịch này, lúc đầu người ta gọi là dung dịch thuộc da, sau đó đổi thành dung dịch tannin Khoảng 20 năm trở lại đây, những thông tin về các hợp chất thuộc nhóm tannin ngày càng nhiều

Cho đến bây giờ tannin được coi là hợp chất phenol đa nguyên tử với nhóm chức quan trọng nhất là nhóm phenolic hydroxyl và tính thuộc da được xem như một tiêu chuẩn cơ bản để xếp các nhóm hợp chất khác vào tannin

2.3.3.1 Phân loại

Theo Lê Ngọc Tú (2003), tannin chia thành 2 nhóm: tannin thủy phân và tannin ngưng tụ

Tannin thủy phân

Là loại tannin sẽ bị thủy phân dưới tác dụng của acid nóng, kiềm nóng hay enzyme tannase cho một phần là đường và một phần là các acid phenolic Nhóm tannin này

dễ tan trong nước, thường cho phức màu xanh đậm với dung dịch FeCl3

Khi cất khô ở 180-200oC cho pyrolallol là chủ yếu

Cho tủa bông bởi acetate chì 10%

Dễ tan trong nước, trong cồn

Người ta chia tannin thủy phân thành hai loại nhỏ:

 Pyrogallic tannin (Gallo – Tannin)

Đây là tanosid khi thủy phân sẽ cho:

Phần đường là glucose, một glucose thường nối với nhiều nhóm genin khác nhau

Phần genin là các monomer (hình 2.5) hay oligomer của các acid gallic Các

oligomer của các acid gallic này được tạo thành nhờ dây nối depside (là một loại

liên kết ester đặc biệt) –COOH của acid gallic này sẽ nối với chức –OH (thường ở

vị trí meta so với nhóm –COOH) của một acid gallic kế cận

Nhóm này có trong vỏ lựu, cánh hoa hồng, lá bạch đàn

Các monomer đơn phân tử:

Pyrocatechin Acid pyrocatechin Pyrogalliol Acid galic

Hình 2.5 Một số monomer đơn phân tử

1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucopyranose

2-O-digalloyl-1,3,4,6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyranose

Hình 2.4 Một số dạng của pyogallic tannin

Các oligomer của acid gallic:

Acid meta-digallic (hình 2.6) được hình thành từ hai phân tử acid gallic, chất này giữ vai trò quan trọng trong sự hình thành tannin có tính thuộc da

Các acid gallic và meta-digallic có trong thành phần tannin thủy phân và kết hợp với đường glucose theo kiểu ester phức tạp Ví dụ tannin tìm thấy trong cây hồ đào Trung Quốc là hợp chất ester phức tạp của các acid gallic với đường glucose, trong

đó tất cả các nguyên tử H của nhóm –OH trong phân tử glucose đều được thay thế bằng các gốc của acid meta-digallic

 Tannin ellagic (ellagi – tannin)

Là một tanosid khi thủy phân sẽ cho:

Một phần là đường, một phần là acid ellagic

Dây nối giữa đường và genin thường là liên kết ester nhưng có khi cũng là liên kết glycoside

Acid egallic tồn tại ở hai dạng:

- Dạng depsidon (lacton của acid phenolic)

- Dạng mở rộng: ở dạng này tannin không bị thủy phân bằng enzyme mà bị thủy phân bởi acid mạnh

Các ellagi-tannin dễ kết tinh, khả năng tạo tủa với protein kém

Ngoài ellagic acid, phần genin của ellagic tannin còn là acid chebulic, acid hexahydroxydiphenic (hình 2.7)

Acid chebulic Acid hexahydroxydiphenic

Hình 2.7 Acid chebulic và acid hexahydroxydiphenic Hình 2.6 Acicd meta - digallic

Tannin ngưng tụ

Là loại tannin không bị thủy phân dưới tác dụng của acid, kiềm hay enzyme mà ngưng tụ thành tannin có phân tử lớn hơn (phlobaphene) hay phloba-tannin Phlobaphene rất ít tan trong nước, là sản phẩm của sự trùng hợp kèm oxy hóa Nhưng trong cồn nóng nó rất dễ bị oxy hóa sinh ra anthocyanidin

Về mặt cấu trúc: đây là polymer của các dẫn xuất flavan (thường là flavan-3-ol (catechin) hay flavan-3,4-diol (leicocanthocyanidin) nên còn được gọi là tannin pyrocatechin hay proanthocyanidin Các monomer flavanoid này nối với nhau (thường ở vị trí 4-8 hay 6-8) bằng nối đôi C-C rất bền, do đó nó còn có tannin không thủy phân được

Đặc điểm của tannin ngưng tụ:

 Tan trong cồn, trong acetate

 Khó tan trong nước, khó kết tinh

 Cho tủa bông với nước brôm

 Tạo phức màu xanh rêu với dung dịch FeCl3

Chỉ các trimer (n ≥ 3) mới có tính thuộc da và tính thuộc da của nó mạnh hơn tính thuộc da của tannin thủy phân

Trong thực tế, nhiều loại thực vật chứa cả tannin thủy phân và tannin ngưng tụ Đôi khi còn gặp cả cấu trúc hỗn hợp giữa tannin thủy phân và tannin ngưng tụ

Tannin thủy phân dễ tan trong nước, cho kết tủa bông với acetat chì 10%, cho phức màu xanh đậm với dung dịch FeCl3

Tannin ngưng tụ khó tan trong nước, khó kết tinh, cho kết tủa bông với nước brôm, tạo phức màu xanh rêu với dung dịch FeCl3

Các tannin có trọng lượng phân tử thấp (catechin, epicatechin, dimer) rất dễ tan trong etylacetate trong khi các proanthocyanidin-oligomer và proanthocyanidin-polymer tan rất kém trong dung môi này

proanthocyanidin-Tạo phức tủa bền với các dung dịch của protein (albumin, gellatin,…) nên có tính thuộc da, làm cho da bền, ít thấm nước, không bị trương phồng hay thối rữa

Hấp thụ bước sóng trong vùng tử ngoại từ 280÷320nm (Dai and Mumper., 2010)

có mặt các chất enzyme oxy hóa như polyphenoloxydase và peroxydase kèm theo

sự có mặt của oxy để quá trình oxy hóa xảy ra mãnh liệt và ngưng tụ thành các hợp chất có phân tử lượng lớn Sản phẩm có màu đỏ sau đó chuyển thành màu xám đen hoặc nâu thẫm

 Phản ứng cộng

Trong quá trình oxy hóa nếu có mặt các acid amin thì các orthoquinone mới được tạo thành sẽ kết hợp với các acid amin này để tạo các sản phẩm của phản ứng cộng Tuy nhiên, các sản phẩm này có thể bị oxy hóa trở về các orthoquinone tương ứng

 Phản ứng ngưng tụ

Song song với quá trình oxy hóa các polyphenol thành orthoquinone là sự khử orthoquinone trở lại polyphenol nhờ nguyên liệu hô hấp là glucose Khi quá trình oxy hóa trội hơn quá trình khử thì có sự tích tụ các orthoquinone thành tannin ngưng tụ hay sản phẩm có màu gọi là phlobaphene

Polyphenol +O2 Orthoquinone (1) Orthoquinone + Glucose Polyphenol + O2 + H2O (2)

n (Orthoquinone) Phlobaphene (3)

Trong điều kiện hô hấp bình thường thì phản ứng (1) và (2) chiếm ưu thế Trái lại trong điều kiện sản xuất khi các mô và tế bào thực vật bị phá vỡ thì phản ứng (2) và (3) chiếm ưu thế (quá trình phi enzyme)

Phản ứng giữa tannin với protein phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc điểm của tannin, đặc điểm của protein và điều kiện phản ứng Phức tannin-protein có thể tan hoặc không tan tùy vào điều kiện phản ứng Có bốn loại tương tác có thể xảy ra giữa tannin và protein: liên kết hydro, liên kết kỵ nước, liên kết cộng hóa trị và liên kết ion Hầu hết các điều kiện chỉ có hai loại liên kết hydroxyl bền với nhóm carbonyl của mạch peptid của protein

Ảnh hưởng của đặc điểm tannin (độ lớn, tính đồng nhất của chế phẩm): tương tác giữa tannin-protein chịu ảnh hưởng bởi số lượng nhóm phenol và sự sắp xếp của các nhóm sẵn có Sự ester hóa tăng ái lực của protein với nhóm flavonoid, acid gallic liên kết với protein hiệu quả hơn flavonoid

Ảnh hưởng của đặc điểm protein (độ lớn, cấu trúc, thành phần amino acid, điểm đẳng điện, ): ái lực của protein đối với tannin là một đặc tính của các thành phần amino acid và tính linh động của protein Các protein và mạch polypeptid giàu proline có ái lực lớn bất thường đối với tannin Cấu trúc bậc hai và bậc ba của protein cũng ảnh hưởng đến phản ứng với tannin Proline cản trở sự tạo thành cấu trúc bậc hai như cấu trúc xoắn alpha Kết quả của cấu trúc cuộn ngẫu nhiên là tạo mạch chính peptid có khả năng tương tác với tannin Cấu trúc cầu đặc bao gồm ribonuclease, lysozyme, và sytochrome C có ái lực thấp đối với tannin bởi vì mạch chính peptid không có đủ khả năng tác dụng với tannin

Ảnh hưởng của điều kiện phản ứng (pH, nhiệt độ, thành phần dung dịch, thời gian),

cụ thể như: pH >10, nhóm phenolic, hydroxyl bị oxy hóa nên tannin không phản ứng với protein Ở nhiệt độ thấp, phức tannin – protein bền hơn Nhiệt độ làm thay đổi entropy có liên quan đến sự loại trừ dung môi trên bề mặt trong suốt giai đoạn đầu hình thành liên kết kỵ nước Và dung môi tạo thành liên kết hydro như aceton formamit ức chế tương tác tannin – protein

 Phản ứng kiềm phân

Tannin bị kiềm phân bởi kiềm đậm đặc, nóng tạo thành các mảnh nhỏ và đơn giản, phản ứng thường được dùng để nghiên cứu cấu trúc tannin

 Phản ứng thủy phân

Dưới tác dụng của tác nhân thủy phân và enzyme tannase (thu nhận từ việc nuôi cấy

nấm mốc Aspergillus Niger trên acid tannic) tấn công vào mối liên kết ester của

tannin tạo ra sản phẩm là acid gallic và polyol nhưng enzyme này không thể tách liên kết ester của acid hexahydroxydiphenic (HHDP) và dạng mở vòng của ellagi - tannin

Ngoài ra, dưới tác dụng của acid nóng (H2SO4 5% nóng) có thể tách hoàn toàn tannin thủy phân thành polyol và acid phenolic còn tannin ngưng tụ lại bị trùng ngưng thành phlobaphene màu đỏ (đỏ tannin)

 Phản ứng trên nhân thơm

Tannin ngưng tụ (tannin pyrocatechin) cho phản ứng thế với các hallogen (brôm lỏng nguyên chất) tạo sản phẩm khó tan

 Phản ứng tạo phức với muối kim loại

Các nhóm phenol –OH của tannin có thể tạo phức màu khó tan với các muối kim loại như Pb2+, Fe3+, Al3+ Càng nhiều nhóm –OH, phản ứng tạo phức màu càng đậm Màu của phức thay đổi tùy theo kim loại ví dụ như: muối sắt cho phức màu xanh, muối chì cho phức màu trắng ngà đến vàng

 Phản ứng với dung dịch ankaloid

Dung dịch tannin loãng cho phản ứng với dung dịch muối ankaloid (thường dùng quinin) cho kết tủa bông trắng

 Phản ứng với Vanillin

Tác dụng với vanillin sẽ tạo thành phức vanillin-tannin có màu nâu đỏ trong môi trường acid Phức này có khả năng hấp thu cực mạnh ở bước sóng 500nm

2.3.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ bền của tannin

So với các hợp chất thiên nhiên, tannin là chất có độ bền kém, chỉ thể hiện tính bền trong môi trường acid

Với tác dụng của nhiệt trong môi trường pH acid, nó dễ bị phân hủy và sau đó ngưng tụ lại với nhau thành các hợp chất có màu nâu Ngoài ra, sự phân hủy của tannin còn có thể xảy ra trong quá trình chiết, trích cũng như tinh chế chúng

Độ bền của tannin phụ thuộc vào nhiều yếu tố như cấu trúc hóa học của tannin, pH, nhiệt độ, thời gian, oxy, enzyme Nếu pH, nhiệt độ càng cao, thời gian càng dài, khả năng tiếp xúc với các tác nhân oxy hóa càng nhiều thì tannin càng bị phân hủy nhanh

2.3.3.4 Vai trò và ứng dụng của tannin

Những năm gần đây, các nhà nghiên cứu khoa học về tannin đã quan tâm nhiều đến hoạt tính sinh học của tannin do những tác động lên hệ sinh học của nó (như phản ứng với protein, tạo phức vòng càng với ion kim loại, kháng oxy hóa sinh học,…)

để từ đó tannin đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược:

- Làm thuốc săn da (do tannin kết hợp với protein tạo thành màng trên niêm mạc), bôi ngoài da hoặc bôi lên các vết thương do rắn và côn trùng cắn

- Điều trị loét (miệng, da,…) do có tính kháng khuẩn

- Giải độc (độc do nhiễm kim loại nặng hoặc uống phải alkaloid)

- Cầm máu

- Trị viêm ruột, lỵ, tiêu chảy

Ngoài ra, tannin có tính kháng oxy hóa sinh học Chất chống oxy hóa này khi sử dụng sẽ ngăn ngừa một loạt các bệnh như: ung thư, tim mạch, viêm khớp, sự lão hóa, đột quỵ, chống hư răng,…

Theo nghiên cứu, tác dụng kháng oxy hóa của tannin là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do (các gốc tự do này được sinh ra và tích lũy trong quá trình sống, là nguyên nhân gây bệnh và dẫn đến quá trình lão hóa của cơ thể con người) Tannin khử được các gốc tự do nhờ khả năng dễ tham gia vào phản ứng oxy hóa – khử và khả năng ổn định gốc aryloxyl Những thí nghiệm gần đây cho thấy phức protein-tannin có phân tử lượng nhỏ hơn Khả năng giữ gốc tự do của tannin cũng hiệu quả như các vitamine A, E Tannin còn ngăn chặn sự tạo thành mỡ trên thành mạch máu bằng cách tham gia vào quá trình vận chuyển cholesterol

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Thời gian: Từ 06/01/2014 đến tháng 05/2014

Water bath (Memmert)

Nhiệt kế thủy ngân (0-100oC) (Trung Quốc)

Máy đo pH (Martini, Nhật)

Máy quang phổ FIA (Shimadzu, Nhật)

Cân điện tử 2 số lẻ (độ chính xác 0,01 gam), cân điện tử 4 số lẻ (độ chính xác 0,0001 gam)

Một số dụng cụ phân tích (cốc thủy tinh, bình tam giác, pipet,…)

3.1.3.2 Hóa chất

Acid oxalic (Trung Quốc)

KMnO4 (Trung Quốc)

Indigocarmin (Trung Quốc)

Dung dịch H2SO4 (Trung Quốc)

Dung dịchHCl (Trung Quốc)

Dung dịch Folin - Ciocalteu (Đức)

A1: Lá già A2: Lá non A3: Thân

Nhân tố B: Đặc tính nguyên liệu

B1: Tươi B2: Khô

Tổng số đơn vị thí nghiệm: 332 = 18 đơn vị thí nghiệm

Cách tiến hành

Thuốc dòi được rửa sạch, loại bỏ lá vàng sau đó chọn 1 tôm 5 lá được phân loại là

lá non, các lá còn lại trên thân là lá già Tiến hành khảo sát bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu như bố trí thí nghiệm

 Lá non: màu xanh nhạt có pha màu ánh tím, chiều dài lá khoảng 4÷6,5cm, cấu trúc mềm và mỏng

 Lá già: có màu xanh đậm và ít ánh tím hơn, chiều dài lá khoảng 7÷8cm, cấu trúc cứng và dày hơn lá non

Nguyên liệu

Lọc Rửa

Dịch trích Trích ly