Thuốc dòi: chọn mua những cây thuốc dòi còn tươi, thân màu tím, không bị giập nát. Nguyên liệu thuốc dòi được mua tại chợ Xuân Khánh – Cần Thơ.
Acid citric (Trung Quốc). 3.1.3 Thiết bị và hóa chất
3.1.3.1 Dụng cụ và thiết bị
Water bath (Memmert)
Nhiệt kế thủy ngân (0-100oC) (Trung Quốc). Máy đo pH (Martini, Nhật).
Máy quang phổ FIA (Shimadzu, Nhật).
Cân điện tử 2 số lẻ (độ chính xác 0,01 gam), cân điện tử 4 số lẻ (độ chính xác 0,0001 gam).
Một số dụng cụ phân tích (cốc thủy tinh, bình tam giác, pipet,…)
3.1.3.2 Hóa chất
Acid oxalic (Trung Quốc). KMnO4 (Trung Quốc). Indigocarmin (Trung Quốc). Dung dịch H2SO4 (Trung Quốc). Dung dịchHCl (Trung Quốc). Dung dịch Folin - Ciocalteu (Đức). Na2CO3 (Trung Quốc).
KCl (Trung Quốc).
Sodium acetate (CH3CO2Na) (Trung Quốc). 3.2 Phương pháp thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình trích ly các hoạt chất có hoạt tính sinh học trong cây thuốc dòi. Quy trình trích ly được thực hiện theo sơ đồ hình 3.1.
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 22 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình trích ly
3.2.1. Thí nghiệm 1. Khảo sát ảnh hưởng của bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu đến hàm lượng các hoạt chất sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi liệu đến hàm lượng các hoạt chất sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi
Mục đích
Xác định hàm lượng các hoạt chất sinh học trong các bộ phận của cây và đặc tính
nguyên liệu.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 2 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố A: Bộ phận cây
A1: Lá già A2: Lá non A3: Thân
Nhân tố B: Đặc tính nguyên liệu
B1: Tươi B2: Khô
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 332 = 18 đơn vị thí nghiệm.
Cách tiến hành
Thuốc dòi được rửa sạch, loại bỏ lá vàng sau đó chọn 1 tôm 5 lá được phân loại là lá non, các lá còn lại trên thân là lá già. Tiến hành khảo sát bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu như bố trí thí nghiệm.
Lá non: màu xanh nhạt có pha màu ánh tím, chiều dài lá khoảng 4÷6,5cm, cấu trúc mềm và mỏng.
Lá già: có màu xanh đậm và ít ánh tím hơn, chiều dài lá khoảng 7÷8cm, cấu trúc cứng và dày hơn lá non.
Nguyên liệu
Lọc Rửa
Dịch trích Trích ly (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 23 Đối với từng hoạt chất khảo sát sử dụng loại dung môi trích ly khác nhau để được hiệu quả trích ly tối ưu.
- Polyphenol: Cân 1,5g nguyên liệu cắt nhỏ, cho vào ống tube 10mL, thêm 5mL dung dịch methanol 70% và ổn nhiệt ở 70oC trong 30 phút. Lắc đều trên máy vortex và tiếp tục trích ly trong vòng 10 phút sau đó tiến hành lọc. Tiếp tục lấy phần bã lọc trích lần 2 rồi gộp dịch chiết lại và đo thể tích rồi tiến hành phân tích.
- Tannin: Cân 3g nguyên liệu, cắt nhỏ cho vào bình tam giác 100mL. Bổ sung 30mL dung môi (ethanol/nước = 1:1) tiến hành ổn định nhiệt ở 80oC trong bể điều nhiệt 60 phút sau đó mang đi lọc. Phần bã tiếp tục đem trích lần 2 với 30mL dung môi, tiến hành lọc và gộp dịch chiết của 2 lần. Xác định thể tích và tiến hành phân tích.
- Anthocyanin: Cân 5g nguyên liệu, cắt nhỏ cho vào bình tam giác 100mL. Ngâm trong 50mL dung môi (etanol/nước = 1:1 có 1% HCl), thời gian 60 phút, lọc, xác định thể tích, sau đó đưa đi phân tích.
Chỉ tiêu theo dõi
- Hàm lượng polyphenol tổng (% chất khô). - Hàm lượng anthocyanin (% chất khô). - Hàm lượng tannin (% chất khô).
3.2.2 Thí nghiệm 2. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/ nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp xử lý đến hiệu suất thu hồi các biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp xử lý đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Mục đích
Xác định tỷ lệ nguyên liệu/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn thích hợp để đạt được hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học cao.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 3 nhân tố và 3 lần lặp lại. Nhân tố C: Tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/ nước
C1: 1/5 C2: 1/10 C3: 1/15 C4: 1/20
Nhân tố D: Biện pháp xử lý nguyên liệu
D1: Nguyên cây D2: Cắt nhỏ
Nhân tố E: Phương pháp xử lý khuấy trộn
E1: Không khuấy trộn E2: Khuấy trộn (27 vòng/phút)
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 24
Cách tiến hành
Thuốc dòi sau khi mua về được rửa sạch, loại bỏ những lá vàng, lá giập sau đó tiến hành thí nghiệm như bố trí. Sử dụng dung môi trích ly là nước máy, cố định nhiệt độ trích ly ở 90oC và thời gian trích ly 30 phút.
Đối với biện pháp xử lý nguyên liệu cắt nhỏ, tiến hành cắt ngắn nguyên liệu với chiều dài khoảng 2cm.
Chỉ tiêu theo dõi
- Hiệu suất trích ly polyphenol tổng (%) - Hiệu suất trích ly anthocyanin (%) - Hiệu suất trích ly tannin (%)
3.2.3 Thí nghiệm 3. Khảo sát ảnh hưởng của pH, nhiệt độ và thời gian trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học trong dịch trích ly
Mục đích
Xác định pH, nhiệt độ và thời gian thích hợp để quá trình trích ly các hoạt chất sinh học đạt hàm lượng cao.
Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên 3 nhân tố và 3 lần lặp lại Nhân tố F: pH
F1: 3 F2: 4 F3: 5 F4: 6
Nhân tố G: Nhiệt độ (oC)
G1: 70 G2: 80 G3: 90 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhân tố H: Thời gian (phút)
H1: 10 H2: 20 H3: 30
Tổng số đơn vị thí nghiệm: 3433 = 108 đơn vị thí nghiệm.
Cách tiến hành
Từ kết quả tối ưu của thí nghiệm 2 chọn được tỷ lệ thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp xử lý khuấy trộn tiến hành trích ly với các điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian ở các mức độ như bố trí thí nghiệm. Với các giá trị pH khác nhau được điều chỉnh bằng cách bổ sung acid citric vào dung môi (nước máy) trích ly.
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 25
Chỉ tiêu theo dõi
- Hiệu suất trích ly polyphenol tổng (%) - Hiệu suất trích ly anthocyanin (%) - Hiệu suất trích ly tannin (%)
3.2.4 Công thức tính hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học Hiệu suất trích ly = Lượng hoạt chất trích ly bằng nước Hiệu suất trích ly = Lượng hoạt chất trích ly bằng nước
Lượng hoạt chất trích ly bằng dung môi(%) 3.2.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu được xử lý và vẽ đồ thị bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Sử dụng phần mềm Statgraphics Centurion 16.0 để phân tích phương sai ANOVA, kiểm tra mức độ khác biệt ý nghĩa của các nghiệm thức thông qua LSD.
LSD: Least Significant Difference (khác biệt có ý nghĩa nhỏ nhất).
Giá trị STD: Standard deviation (độ lệch chuẩn) được tính theo công thức:
STD = 1 n − 1 (X − X) Trong đó: n: số lần lặp lại Xi: số liệu ở lần phân tích i X: giá trị trung bình
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 26 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Hàm lượng các hoạt chất sinh học trong các bộ phận cây và đặc tính nguyên liệu nguyên liệu
Khác với các sản phẩm thông thường, sản phẩm thực phẩm sinh học gây sự chú ý và được ưa chuộng bởi thành phần, hàm lượng và hoạt tính của các hoạt chất sinh học có trong sản phẩm. Để sản phẩm có hàm lượng các hoạt chất sinh học cao và đảm bảo chất lượng cần chú ý hàm lượng các hoạt chất sinh học trên từng bộ phận cây nhằm chọn lựa nguyên liệu thích hợp cho quá trình sản xuất.
Trên cùng một cây, các bộ phận khác nhau và trạng thái nguyên liệu khác nhau sẽ chứa hàm lượng hoạt chất nhất định. Trong quá trình sản xuất, nguyên liệu là yếu tố quyết định đến chất lượng sản phẩm. Có nhiều yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến thành phần các chất trong nguyên liệu tùy theo giống, môi trường sống và thời gian thu hoạch (Nguyễn Thị Bích Thủy và cộng sự, 2007). Khảo sát hàm lượng hoạt chất sinh học ở các bộ phận cây thuốc dòi với hai trạng thái nguyên liệu tươi và khô giúp lựa chọn phương pháp chế biến thích hợp. Kết quả khảo sát một số hoạt tính sinh học hiện diện trong cây thuốc dòi được trình bày ở bảng 4.1.
Bảng 4.1 Hàm lượng hoạt chất sinh học trong cây thuốc dòi theo bộ phận và đặc tính nguyên liệu
Đặc tính
nguyên liệu Bộ phận cây
Chỉ tiêu Polyphenol tổng (%CBK) Tannin (%CBK) Anthocyanin (%CBK) Tươi Lá non 17,74* ± 0,56** 12,75 ± 0,61 0,33 ± 0,03 Lá già 25,77± 0,79 10,88 ± 0,89 0,36 ± 0,04 Thân 17,21 ± 0,61 10,44 ± 0,44 0,20 ± 0,03 Khô Lá non 18,88 ± 0,72 11,25 ± 0,30 0,29 ± 0,10 Lá già 22,78 ± 0,81 8,80 ± 0,65 0,31 ± 0,10 Thân 13,20 ± 0,06 3,25 ± 0,80 0,08 ± 0,10
Ghi chú: * Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. ** Độ lệch chuẩn của giá trị trung bình. % CBK: Các giá trị được tính theo căn bản khô.
Từ kết quả khảo sát (bảng 4.1) cho thấy hàm lượng hoạt chất sinh học tồn tại trong tất cả các bộ phận khảo sát của cây thuốc dòi. Tuy nhiên, hàm lượng thu nhận được ở các bộ phận hoàn toàn không giống nhau. Các hoạt chất polyphenol tổng, tannin, anthocyanin tập trung nhiều ở bộ phận lá của cây thuốc dòi và đặc biệt có hàm lượng cao khi nguyên liệu ở trạng thái tươi.
Hàm lượng polyphenol và tannin tập trung nhiều ở bộ phận lá non của cây, polyphenol chiếm khoảng 17,74% và tannin chiếm khoảng 12,75% tính trên căn bản khô. Theo Phạm Thanh Quan và cộng sự (2007), hàm lượng tannin cao nhất ở búp trà, lá già ít tannin nhất; búp trà có 12% tannin, 4÷5 lá non gần ngọn có 5%
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 27 tannin, lá già chỉ còn 3,5% tannin; quá trình sấy khô trà xanh và ủ sấy trà đen làm giảm rất nhiều tannin.
Anthocyanin là sắc tố quan trọng nhất tạo màu xanh, đỏ, tím khác nhau của thực vật. Ở dung dịch acid tạo muối có màu đỏ, trong muôi trường kiềm là các anion cũng tạo muối với các chất kiềm có màu xanh.Ở thực vật, màu sắc của anthocyanin không chỉ phụ thuộc vào cấu trúc phân tử, pH dịch tế bào mà còn phụ thuộc vào dạng muối hoặc dạng phức với các cation kim loại hoặc phụ thuộc vào hỗn hợp màu với các sắc tố khác (Ngô Văn Thu, 2004).Trong cây thuốc dòi, anthocyanin có nhiều trong lá già của cây chiếm khoảng 0,36% tính trên căn bản khô.
4.2 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Kết quả thể hiện ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học được trình bày ở bảng 4.2
Bảng 4.2. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước, biện pháp xử lý nguyên liệu và phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Biện pháp xử lý Phương pháp khuấy trộn Thuốc dòi:nước Hiệu suất trích ly (%)
Polyphenol Tannin Anthocyanin
Nguyên cây Không khuấy 1:5 19,88* ± 0,97** 38,30 ± 0,65 7,53 ± 0,36 1:10 25,51 ± 0,51 45,75 ± 0,98 11,78 ± 0,52 1:15 29,28 ± 1,01 47,16 ± 0,89 16,97 ± 0,36 1:20 29,40 ± 1,29 47,70 ± 0,96 17,36 ± 1,17 Khuấy trộn 1:5 24,40 ± 0,53 49,74 ± 0,77 10,86 ± 0,47 1:10 30,83 ± 1,06 53,89 ± 0,31 13,42 ± 0,66 1:15 36,33 ± 0,88 55,34 ± 1,09 21,88 ± 0,81 1:20 36,61 ± 0,68 56,11 ± 1,00 22,17 ± 0,60 Cắt nhỏ Không khuấy 1:5 22,40 ± 0,49 44,27 ± 1,14 9,13 ± 0,90 1:10 28,50 ± 0,75 50,36 ± 0,57 12,67 ± 1,16 1:15 31,34 ± 1,31 52,02 ± 1,04 17,92 ± 0,73 1:20 32,94 ± 0,87 53,08 ± 0,44 18,92 ± 0,79 Khuấy trộn 1:5 26,76 ± 0,73 51,63 ± 0,89 14,62 ± 0,92 1:10 35,39 ± 0,58 57,95 ± 0,89 19,57 ± 1,17 1:15 42,45 ± 0,71 63,48 ± 0,87 25,82 ± 0,80 1:20 43,22 ± 0,70 65,16 ± 0,91 26,18 ± 0,77
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 28 4.2.1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Theo Lê Bạch Tuyết (1996), hoạt chất trong nguyên liệu đi vào dung môi bằng cơ chế khuếch tán, vì vậy hiệu suất trích ly phụ thuộc rất lớn vào tỷ lệ nguyên liệu/dung môi. Nếu tỷ lệ giữa dung môi và nguyên liệu càng nhỏ thì quá trình trích ly xảy ra không triệt để, hiệu suất trích ly thấp. Nếu tỷ lệ này quá lớn gây hao tổn dung môi, tốn chi phí. Hiệu suất trích ly sẽ đạt cao nhất tại một tỷ lệ nhất định nào đó. Kết quả thể hiện sự ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học được trình bày ở bảng 4.3.
Bảng 4.3. Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu thuốc dòi/nước đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Thuốc dòi : nước Hiệu suất (%)
Polyphenol tổng Tannin Anthocyanin
1:5 23,36*a 45,99a 10,54a
1:10 30,06b 51,99b 14,53b
1:15 34,85c 54,50c 20,64c
1:20 35,54d 55,51c 21,26c
Ghi chú: *Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả thể hiện ở bảng 4.3 cho thấy hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học tăng khi tỷ lệ nguyên liệu/dung môi càng nhỏ, nghĩa là khi lượng dung môi càng cao thì lượng chất hòa tan tách ra càng nhiều. Ở tỷ lệ 1:15 cho hiệu suất trích ly cao, ở tỷ lệ 1:20 hiệu suất vẫn tiếp tục tăng nhưng không đáng kể. Khi lượng dung môi nhiều khả năng tiếp xúc nguyên liệu càng lớn tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình khuếch tán các cấu tử chất tan vào trong dung môi làm tăng hiệu suất trích ly. Tuy nhiên, đến một tỷ lệ nhất định thì lượng chất hòa tan trong dung môi đạt cực đại, khi đó nếu tăng lượng dung môi hiệu suất sẽ không tăng hoặc tăng không đáng kể.
4.2.2 Ảnh hưởng biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Theo Nguyễn Bin (2003), kích thước và hình thái của nguyên vật liệu có tác dụng trực tiếp lên hệ số truyền khối. Khi tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu với dung môi làm tăng tốc độ trích ly. Nguyên liệu có kích thước hình học nhỏ thường có hệ số truyền khối cao hơn cũng như có thể kiểm soát quá trình khuếch tán. Nếu các chất hòa tan nằm bên trong một hệ vật có cấu trúc rắn chắc thì làm giảm kích thước cấu trúc này để chất tan dễ tiếp xúc với dung môi.
SVTH: Huỳnh Thị Ngọc Nhẫn 29 Tuy nhiên, khi các hạt rất nhỏ có thể xảy ra hiệu ứng “channeling effect” làm giảm hiệu suất trích ly. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất trích ly các hoạt chất sinh học dược trình bày ở bảng 4.4.
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của biện pháp xử lý nguyên liệu đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất sinh học
Biện pháp xử lý nguyên liệu
Hiệu suất (%)
Polyphenol tổng Tannin Anthocyanin
Nguyên cây 29,03*a 49,25a 15,30a
Cắt nhỏ 32,87b 54,74b 18,18b
Ghi chú: *Các giá trị trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ cái khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt ở mức ý nghĩa 5%.
Kết quả thu nhận cho thấy các hoạt chất sinh học đạt hiệu suất trích ly cao khi nguyên liệu được cắt nhỏ trong quá trình trích ly. Nguyên nhân là do khi cắt nhỏ nguyên liệu sẽ làm tăng diện tích tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi, làm các cấu tử hòa tan dễ dàng chuyển động thúc đẩy quá trình khuếch tán chất tan trong nguyên liệu ra dung môi. Tuy nhiên, cần cân nhắc để chọn kích thước làm nhỏ nguyên liệu cho phù hợp vì nếu kích thước nguyên liệu quá nhỏ sẽ gây phức tạp cho các quá trình xử lý tiếp theo (Lê Bạch Tuyết, 1996).
4.2.3 Ảnh hưởng phương pháp khuấy trộn đến hiệu suất thu hồi các hoạt chất