Biểu hiện, tinh sạch, đánh giá hoạt tính sinh học của thrombin tái tổ hợp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG DUYÊN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA THROMBIN TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG DUYÊN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA THROMBIN TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH MÃ SỐ: 60720408 Người hướng dẫn khoa học: TS Đỗ Thị Tuyên TS Đào Thị Mai Anh HÀ NỘI 2017 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Thị Tuyên TS Đào Thị Mai Anh người thầy định hướng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn, sửa luận văn tạo điều kiện hóa chất, thiết bị kinh phí để thực đề tài Tôi xin cảm ơn tập thể Phòng Công nghệ sinh học Enzym, Viện Công nghệ sinh học bảo, giúp đỡ tận tình cho trình thực nghiệm chia sẻ kinh nghiệm chuyên môn Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo môn Hóa sinh thầy cô môn, phòng ban, thư viện trường Đại học Dược Hà Nội quan tâm, giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập Đề tài thực khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu điều kiện biểu tinh thrombin tái tổ hợp ứng dụng tạo băng gạc cầm máu nhanh vết thương” TS Đỗ Thị Tuyên - Viện CNSH làm chủ nhiệm đề tài Cuối xin cảm ơn đồng nghiệp, bạn bè người thân gia đình giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên suốt thời gian học tập Hà Nội, ngày 31 tháng năm 2017 Học viên Vũ Thị Hồng Duyên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Sơ lược trình đông máu 1.1.1 Các yếu tố đông máu 1.1.2 Cơ chế trình đông máu 1.1.2.1 Giai đoạn thành lập phức hợp prothrombinase 1.1.2.2 Giai đoạn thành lập thrombin 1.1.2.3 Giai đoạn thành lập fibrin cục máu đông 1.2 Thrombin, vai trò, nguồn gốc 1.2.1 Thrombin 1.2.2 Vai trò thrombin trình cầm máu 1.2.3 Nguồn gốc thrombin 11 1.2.3.1 Prothrombin 11 1.2.3.2 Sự hình thành thrombin 13 1.2.4 Ứng dụng thrombin 15 1.2.4.1 Công cụ nghiên cứu 15 1.2.4.2 Ứng dụng Y - Dược 15 1.2.4.3 Sản xuất thực phẩm 16 1.2.5 Tình hình nghiên cứu, sản xuất thrombin nước quốc tế 16 1.2.5.1 Trên giới 16 1.2.5.2 Tại Việt Nam 17 1.3 Chủng vi khuẩn Escherichia coli 18 1.3.1 Các thông tin chung chủng E.coli 18 1.3.1.1 Hình thái học 18 1.3.1.2 Môi trường nuôi cấy 18 1.3.2 E.coli sử dụng hệ biểu để sản xuất protein tái tổ hợp 18 1.3.3 Ưu điểm hạn chế hệ biểu protein E.coli 19 1.3.3.1 Ưu điểm 19 1.3.3.2 Hạn chế 20 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 22 2.1.1 Nguyên liệu 22 2.1.2 Hóa chất 22 2.1.3 Môi trường nuôi cấy 24 2.1.4 Thiết bị thí nghiệm 24 2.1.5 Dụng cụ 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 27 2.3.1 Phương pháp hoạt hóa chủng E.coli 27 2.3.2 Phương pháp nuôi cấy, biểu thrombin chủng E.coli 27 2.3.3 Phân tích protein kỹ thuật điện di SDS-PAGE 27 2.3.4 Phương pháp tinh protein tái tổ hợp 28 2.3.5 Phương pháp thẩm tách 29 2.3.6 Xác định hàm lượng protein 29 2.3.7 Phương pháp thử hoạt tính 30 2.3.7.1 Đánh giá khả chuyển hóa fibrinogen thrombin 30 2.3.7.2 Đánh giá khả phản ứng với chất đặc hiệu Tosyl- GlyPro-Arg-4-nitranilide acetate (Chromozym TH) 32 2.3.7.3 Đánh giá động vật thực nghiệm 32 2.3.8 Xử lý số liệu……………………………………………………… 32 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33 3.1 Chọn lọc chủng E.coli sinh tổng hợp thrombin 33 3.2 Lựa chọn điều kiện biểu thrombin chủng E.coli BL21(DE3) 38 3.2.1 Lựa chọn nhiệt độ biểu thrombin 38 3.2.2 Lựa chọn điều kiện pH môi trường biểu thrombin 39 3.2.3 Lựa chọn nồng độ pepton môi trường LB biểu thrombin 40 3.2.4 Lựa chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG biểu thrombin 41 3.2.5 Lựa chọn thời điểm kết thúc biểu thrombin 42 3.3 Kết tinh thrombin đánh giá độ tinh khiết 43 3.4 Đánh giá hoạt tính sinh học thrombin tái tổ hợp 45 3.4.1 Khả chuyển hóa fibrinogen 45 3.4.2 Phản ứng với chất đặc hiệu Tosyl- Gly-Pro-Arg-4-nitranilide acetate (Chromozym TH) .45 3.4.3 Đánh giá hoạt tính thrombin động vật thực nghiệm 46 Chương BÀN LUẬN 47 4.1 Bàn luận kết lựa chọn chủng E.coli có biểu thrombin tốt 47 4.2 Bàn luận kết chọn điều kiện biểu thrombin 48 4.2.1 Kết lựa chọn điều kiện nhiệt độ 48 4.2.2 Kết lựa chọn điều kiện pH 48 4.2.3 Kết lựa chọn nồng độ pepton môi trường LB 49 4.2.4 Kết lựa chọn nồng độ IPTG 49 4.2.5 Kết lựa chọn thời điểm thu mẫu 50 4.3 Bàn luận kết tinh hoạt tính thrombin tái tổ hợp 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ADN Deoxyribonucleic acid ĐC Đối chứng IPTG Isopropyl β-D-1-Thiogalactopyranoside Kb Kilobase kDa Kilo Dalton M Marker OD Optical density SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N,Nˊ, Nˊ-Tetramethylethylenediamine TLTK Tài liệu tham khảo v/v Volume/volume w/v Weight/volume DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Bảng 1.1 Các yếu tố liên quan đến đông máu Bảng 1.2 Các công trình nghiên cứu biểu thrombin 16 Bảng 1.3 Các hệ thống biểu sử dụng để sản xuất 19 Trang protein tái tổ hợp Bảng 1.4 Một số dược phẩm sinh học có thị trường 19 Bảng 2.1 Thành phần loại đệm dung dịch 23 Bảng 2.2 Các thiết bị thí nghiệm 24 Bảng 2.3 Thành phần gel co gel tách 28 Bảng 3.1 Khối lượng ướt tế bào năm chủng E.coli 34 Bảng 3.2 So sánh mức độ biểu protein thrombin 35 chủng Bảng 3.3 Hàm lượng protein tinh từ chủng E.coli BL21 36 (DE3) E.coli (DE3)plys E Bảng 3.4 Bảng 3.5 Thời gian chuyển fibrinogen thành fibrin thrombin phân đoạn E2 tinh tách từ chủng E.coli BL2 1(DE3) E.coli (DE3)plysE Mức độ biểu protein thrombin từ chủng E.coli 37 38 BL21 (DE3) nhiệt độ khác Bảng 3.6 Biến đổi pH môi trường sau nuôi cấy 39 Bảng 3.7 Mức độ biểu protein thrombin từ chủng E.coli 40 BL21 (DE3) pH môi trường khác Bảng 3.8 Mức độ biểu thrombin từ chủng E.coli BL21 41 (DE3) nồng độ pepton môi trường khác Bảng 3.9 Mức độ biểu protein thrombin từ chủng E.coli BL21 (DE3) cảm ứng nồng độ IPTG khác 42 Bảng 3.10 Mức độ biểu protein thrombin từ chủng E.coli 43 BL21 (DE3) với thời điểm kết thúc biểu khác Bảng 3.11 Bảng tóm tắt trình tinh thrombin từ chủng 44 E.coli BL21 (DE3) Bảng 3.12 Thời gian chuyển fibrinogen thành fibrin 45 Bảng 3.13 Đánh giá hoạt độ enzym thrombin 46 Bảng 3.14 Thời gian cầm máu động mạch tai thỏ 46 nặng chuyển hóa lớn, plasmid quần thể tế bào thường xảy ra, tế bào plasmid phát triển nhanh hơn, chiếm chất dinh dưỡng môi trường, ampiclin có vai trò tiêu diệt tế bào plasmid [31] Ở pH thấp tác dụng ampicilin giảm dẫn tới hiệu suất biểu thrombin giảm 4.2.3 Kết lựa chọn nồng độ pepton môi trường LB Nồng độ chất dinh dưỡng chất hóa học môi trường đóng vai trò quan trọng cho phát triển tế bào E.coli, tế bào E.coli phát triển nhiều nồng độ dinh dưỡng khác nhau, tùy chủng tế bào mà yêu cầu dinh dưỡng tối ưu khác Pepton hỗn hợp peptid acid amin sản phẩm phân hủy protein động vật thực vật enzym pepsin Trong nghiên cứu nồng độ pepton ảnh hưởng lớn đến biểu thrombin, tăng nồng độ pepton từ 0,2% đến 1,5% biểu thrombin tăng tuyến tính, tăng đến 2% lại giảm nguyên nhân nồng độ pepton tăng làm tăng nồng độ lactose có môi trường, cảm ứng IPTG, nồng độ lactose cao làm tế bào chuyển hóa nhanh dẫn đến gánh nặng chuyển hóa, tế bào nhanh bị kiệt quệ giảm biểu thrombin 4.2.4 Kết lựa chọn nồng độ IPTG Trong dải nồng độ IPTG từ 0,5 mM - 1,5 mM tăng nồng độ, biểu thrombin giảm, nồng độ có biểu tốt 0,5mM Kết phù hợp với nghiên cứu Michaela Osadská năm 2014 biểu tiền chất thrombin vi khuẩn E.coli với nồng độ IPTG 0,4mM [47] Trong năm gần việc sử dụng E.coli làm vật chủ vector biểu protein tái tổ hợp ngày phổ biến thương mại hóa, vùng điều khiển phiên mã lac cảm ứng IPTG với nồng độ 50-100µM đạt đầy đủ cảm ứng [23], nồng độ IPTG cao gây cảm ứng mức, dẫn tới tăng cao mRNA gây phá hủy ribosome chết tế bào [41] dẫn đến hiệu suất biểu protein tái tổ hợp giảm 49 4.2.5 Kết lựa chọn thời điểm thu mẫu Trong kết nghiên cứu chúng tôi, thời điểm thu mẫu tốt sau cảm ứng, sau khoảng thời gian biểu thrombin giảm hoạt động protease phân hủy protein ngoại lai, đồng thời sản phẩm trình chuyển hóa gây độc tế bào làm suy kiệt dinh dưỡng môi trường nuôi cấy, làm cho tế bào E.coli bị tiêu diệt Kéo dài thời gian kết thúc cảm ứng làm giảm biểu thrombin mà làm xuất nhiều loại protein tạp khác, gây khó khăn trình tinh Vì thu mẫu sau cảm ứng đạt mức độ biểu thrombin cao đồng thời trình tinh thuận lợi 4.3 Bàn luận kết tinh hoạt tính thrombin tái tổ hợp Tinh thrombin sắc ký lực Resin-Nikel theo phương pháp hỗn hợp (Native) Invitrogen cho hệ thống tinh ProBond TM cho băng protein có kích thước khoảng 37 kDa Trong nghiên cứu Elsie cộng năm 1995 [20] sử dụng sắc ký lực heparin độ đạt 85%; Nghiên cứu Yonemura cộng năm 2004 [70] dùng sắc ký lực sử dụng Benzamidine-Sepharose có độ đạt 90%; Nghiên cứu Meta cộng năm 2015 [40] tinh hai lần, lần đầu với sắc ký lực sử dụng Benzamidine-Sepharose sau sắc ký trao đổi cation nhựa Eshmuno CPX có độ đạt 95% Tuy nhiên hiệu suất trình tinh thấp đạt 44,44% nghiên cứu Yonemura cộng năm 2004 [70] hiệu suất tinh cao xấp xỉ đạt 70% Trong nghiên cứu thrombin có hoạt tính sinh học thử nghiệm in vitro in vivo: Đã chuyển hóa fibrinogen hòa tan dung dịch thành fibrin dạng sợi kết vón lại với nhau, nhiên hoạt tính thấp khác biệt lớn thrombin tái tổ hợp thrombin tự nhiên từ huyết bò Thời gian bắt đầu đông mẫu thrombin tự nhiên nhanh gấp 33,33 lần so với mẫu thrombin tái tổ hợp, nghiên cứu sản xuất thrombin nhóm nghiên cứu trước hoạt tính chuyển hóa fibrinogen gần khác biệt 50 giữ mẫu tự nhiên tái tổ hợp [40], [70], [20] Khi đo hoạt độ Phản ứng với chất đặc hiệu Tosyl- Gly-Pro-Arg-4-nitranilide acetate (Chromozym TH) 39,87 mg thrombin tái tổ hợp tạo IU hoạt độ enzym, cần 2,885 IU làm giảm đáng kể thời gian cầm máu động mạch thỏ bị tổn thương so với nhóm chứng dùng NaCl 0,9% Có thể thấy sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống vi sinh vật cách mạng hóa sinh đại [23] Với sản phẩm thrombin tái tổ hợp thuận lợi cho trình tinh thrombin chiết xuất từ động vật, đồng thời có hoạt tính sinh học tiền đề để nghiên cứu sản xuất thrombin mà không cần đến hàng kilogram tế bào động để chiết xuất 51 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận: Từ chủng E.coli ban đầu: chủng E.coli JM109 (DE3), E.coli C43 (DE3), E.coli BL21 (DE3), E.coli (DE3)plysE, E.coli (DE3)plysS mang plasmid pET22b(+), lựa chọn chủng E.coli BL21 (DE3) có khả biểu thrombin tái tổ hợp cao Lựa chọn điều kiện để tăng khả sinh biểu thrombin tái tổ hợp: môi trường nuôi cấy LB (1,5% pepton, 0,5% cao nấm men, 1,0% NaCl), nhiệt độ biểu 28oC, pH 8, nồng độ chất cảm ứng IPTG 0,5 mM, thời điểm thu mẫu sau cảm ứng Thrombin tái tổ hợp sau tinh qua cột sắc ký lực Resin-Nikel có kích thước phân tử đạt 37 kDa với kích thước dự đoán thrombin tái tổ hợp Thrombin tái tổ hợp có hoạt tính sinh học chuyển hóa fibriogen thành fibrin, thủy phân chất đặc hiệu chromozym TH đặc biệt rút ngắn thời gian cầm máu vết thương động mạch tai thỏ thực nghiệm Kiến nghị: Nghiên cứu hệ biểu khác để khắc phục hạn chế của hệ biểu E.coli Tạo thrombin tái tổ hợp có cấu trúc không gian tương tự thrombin tự nhiên, từ nâng cao hoạt tính sinh học Nghiên cứu tính chất lý, hóa thrombin tái tổ hợp, từ mở hy vọng tiềm sản xuất thrombin làm nguyên liệu chế tạo chế phẩm cầm máu nhanh lâm sàng Việt Nam 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Nguyễn Thị Hồng Nhung, cộng (2014), "Khảo sát hàm lượng Thrombin phổi số loại động vật ứng dụng làm vật liệu sản xuất băng gạc cầm máu tức thì", Tạp chí Y Học Việt Nam, 421(số 22), tr.1859-1868 Tiếng Anh Aizawa, P.Winge, S Karlsson, G (2008), "Large-scale preparation of thrombin from human plasma", Thromb Res, 122(4), p 560-7 Alexander C, Rietschel ET (2001), "Bacterial lipopolysaccharides and innate immunity", J Endotoxin Res, (3), p.167-202 Bajzar L, Manuel R, Nesheim ME (1995), "Purification and characterization of TAFI, a thrombin-activable fibrinolysis inhibitor", J Biol Chem, (270),p 14477–14484 Baker JB, Low DA, Simmer RL, Cunningham DD (1980), "Protease-nex in: a cellular component that links thrombin and plasminogen activator and mediates their binding to cells", Cell, (21), p 37-45 Boissel JP, Le Bonniec B, Rabiet MJ, Labie D, Elion J (1984), "Covalent structures of beta and gamma autolytic derivatives of human alphathrombin", J Biol Chem, (259), p 5691– 5697 Bradford HN, Krishnaswamy S (2016), "The Fragment Region of Prothrombin Facilitates the Favored Binding of Fragment 12 to Zymogen and Enforces Zymogen-like Character in the Proteinase", J Biol Chem, (291), p 11114-23 Bulbul Chakavarti, Deb Chakavarti (2008), "Electrophoretic Separation of Proteins", J Vis Exp, (16), p 758 CT, Esmon (1989), "The roles of protein C and thrombomodulin in the regulation of blood coagulation", J Biol Chem, (264),p 4743-4746 10 Chen R, Doolittle RF (1969), "Identification of the polypeptide chains involved in the cross-linking of fibrin", Proc Natl Acad Sci USA, (63) p 420–427 11 Choi Eun-Hwa, Kim Yong Joo, Kim Jong-Myoung, Hong Hyo Jeong, Han Moon Hi and Kim Ji Young (1989), "Cloning and expression of human prethrombin cDNA in Escherichia Coli", Korean Biochem.J, (22), pp 154-160 12 Davie, E W and J D Kulman (2006), "An overview of the structure and function of thrombin", Semin Thromb Hemost, 32(1), p 3-15 13 Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W, (1991), The coagulation cascade- initiation, maintenance, and regulation Biochemistry 30 14 Davie EW, Fujikawa K, Kisiel W (1991), The coagulation cascade- initiation, maintenance, and regulation Biochemistry 30: p 10363–10370 15 De Candia E, Hall SW, Rutella S, Landolfi R, Andrews RK, De Cristofaro R , (2001) Binding of thrombin to glycoprotein Ib accelerates the hydrolysis of Par-1 on intact platelets J Biol Chem 276: p 4692-4698 16 Degen SJ, MacGillivray RT, Davie EW (1983), Characterization of complementary deoxyribonucleic acid and genomic Biochemistry 22: p 2087-2097 17 Diesen DL, Lawson JH, (2008), Bovine thrombin: history, use, and risk in the surgical patient Vascular 17(3): p 181 18 Dumon-Seignovert L1, Cariot G, Vuillard L, (2004) The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3) Protein Expr Purif 37: p 2036 19 Eckburg PB, Bik EM, Bernstein CN, Purdom E, Dethlefsen L, Sargent M, Gill SR, Nelson KE, Relman DA, (2005) Diversity of the human intestinal microbial flora Science 308: p 1635-8 20 Elsie E DiBella, Muriel C Maurer and Harold A Scheraga, 1995 Expression and folding of recombinant bovine prethrombin-2 and its activation to thrombin J Biol Chem 270: p 163–169 21 Esmon CT, Jackson CM, (1974), The conversion of prothrombin to thrombin III The factor Xa-catalysed activation of prothrombin J Biol Chem 249: p 7782–7790 22 Esmon CT, Jackson CM, (1974), The conversion of prothrombin to thrombin IV The function of the fragment region during activation in the presence of factor V J Biol Chem 249: p 7791–7 23 F, Baneyx, (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli Curr Opin Biotechnol 5: p 411-21 24 Foster, K N., et al., (2011), Recombinant human thrombin: safety and immunogenicity in pediatric burn wound excision J Pediatr Surg 46(10): p 1992-9 25 Fotadar U, Zaveloff P, Terracio L, (2005) Growth of Escherichia coli at elevated temperatures Journal of Basic Microbiology 45: p 403-4 26 Furie B, Furie BC, (1988) The molecular basis of blood coagulation Cell 53: p 505-18 27 Furie, Bruce Furie and Barbara C., (2005) Thrombus formation in vivo J Clin Invest 115: p 3355-3362 28 Ham SW, Lew WK, Weaver FA (2010) Thrombin use in surgery: an evidence-based review of its clinical use J Blood Med 1: p 135-142 29 Heffernan JK, Ponce RA, Zuckerman LA, Volpone JP, Visich J, Giste EE, Jenkins N, Boster D, Pederson S, Knitter G, Palmer T, Wills M, Early RJ, Rogge MC, 2007 Preclinical safety of recombinant human thrombin Regul Toxicol Pharmacol 47: p 48–58 30 Ishii S, Sadowsky MJ., (2008) Escherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human HealthEscherichia coli in the Environment: Implications for Water Quality and Human Health Microbes Environ 2: p 101-8 31 J.Pasternak, Bernard R Glick Jack, (2003), Molecular Biotechnology Principles and applications of recombinant DNA Washington, DC : ASM Press, Canada 32 John L Tymoczko, Lubert Stryer Jeremy Berg, (2007) Biochemistry 6th Edition (Sixth Ed.) New York: W.H Freeman and Company: p 69 33 K A PRESSER, D A RATKOWSKY, AND T ROSS, (1997) Modelling the Growth Rate of Escherichia coli as a Function of pH and Lactic Acid Concentration Appl Environ Microbiol 63: p 2355-2360 34 Kamionka, Mariusz, (2011) Engineering of Therapeutic Proteins Production in Escherichia coli Current Pharmaceutical Biotechnology 12: p 268-274 35 Krishnaswamy, Sriram, (2013) The Transition of Prothrombin to Thrombin J Thromb Haemost 11: p 265-276 36 LJ, Berliner, (1984) Structure-function relationships in human alpha- and gamma-thrombins Mol Cell Biochem 61: p 159-72 37 Magnusson S, Sottrup-Jensen L, Claeys H, Zajdel M, Petersen TE, 1795 Proceedings: Complete primary structure of prothrombin Partial primary structures of plasminogen and hirudin Thromb Diath Haemorrh 34: p 562– 563 38 Mann KG, Jenny RJ, Krishnaswamy S, (1988), Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes Annu Rev Biochem 57: p 915–956 39 Mann KG, Nesheim ME, Church WR, Haley P, Krishnaswamy Schultz, J., (1990), Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes Blood 76: p 1-16 40 Meta, A., et al., (2015), High-yield preparation of recombinant human alphathrombin for therapeutic use J Biosci Bioeng 120(4): p 432-7 41 Miroux B, Walker JE, (1996) Over-production of protein in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels J Mol Biol 260: p 289-298 42 MW, Mosesson, (2005), Fibrinogen and fibrin structure and functions J Thromb Haemost 3(8): p 1894–1904 43 Nelsestuen GL, Zytkovicz TH, Howard JB, 1974 The mode of action of vitamin K Identification of gamma-carboxyglu- tamic acid as a component of prothrombin J Biol Chem 1974 249: p 6347–6350 44 Nesheim ME, Taswell JB, Mann KG, (1979) The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase J Biol Chem 254: p 10952-62 45 Ofosu, F A., S Crean, and M W (2009) Reynolds, (2009), A safety review of topical bovine thrombin-induced generation of antibodies to bovine proteins Clin Ther 31(4): p 679-91 46 Ortel TL, Charles LA, Keller FG, Marcom PK, Oldham HN Jr, Kane WH, Macik BG, 1994 Topical thrombin and acquired coagulation factor inhibitors: clinical spectrum and laboratory diagnosis Am J Hematol 45: p 128–135 47 Osadska, M., et al., (2014), Optimization of expression of untagged and histidine-tagged human recombinant thrombin precursors in Escherichia coli Appl Microbiol Biotechnol 98(22): p 9259-70 48 Pope B, Kent HM, (1996) High efficiency transformation of Escherichia coli Nucleic Acids Res 3: p 536-7 49 Pozzi N, Chen Z, Gohara DW, Niu W, Heyduk T, Di Cera E., (2013) Crystal structure of prothrombin reveals conformational flexibility and mechanism of activation J Biol Chem 288: p 22734-44 50 R, Chen, (2012) Bacterial expression systems for recombinant protein production: E coli and beyond Biotechnol Adv 5: p 1102-7 51 R J Butkowski, J Elion, M R Downing and K G Mann (1977), Primary structure of human prethrombin and alpha-thrombin Biological Chemistry 252: p 4942-4957 52 Rosenberg RD, Damus PS, (1973) The purification and mechanism of action of human antithrombin-heparin cofactor J Biol Chem 248: p 6490-6505 53 Sadowski JA, Esmon CT, Suttie JW, 1976 Vitamin K-dependent carboxylase Requirements of the rat liver microsomal enzyme system J Biol Chem 251: p 2770–2776 54 Sanjeev Palta, Richa Saroa, and Anshu Palta, (2014) Overview of the coagulation system Indian J Anaesth 58: p 515-523 55 Schenone M, Furie BC, Furie B, (2004), The blood coagulation cascade Curr Opin Hematol 11: p 272–7 56 Sezonov G, Joseleau-Petit D, D'Ari R, (2007) Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth J Bacteriol 23: p 8746-9 57 So, I S., Lee, S., Kim, S W., Hahm, K S., and Kim, J (1992), Purification and activation of recombinant human prethrombin produced in E coli, in Korean Biochem J (1992), p 60-65 58 Soejima, K., Mimura, N., Yonemura, H., Nakatake, H., Imamura, T., and Nozaki, C., 2001 An efficient refolding method for the preparation of recombinant human prethrombin-2 and characterization of the recombinant-derived alphathrombin J Biochem 130: p 269-277 59 Soslau G1, Goldenberg SJ, Class R, Jameson B., (2004) Differential activation and inhibition of human platelet thrombin receptors by structurally distinct alpha-, beta- and gamma-thrombin Platelets 15: p 155-66 60 Stenflo J, Fernlund P, Egan W, Roepstorff P, 1974 Vitamin K dependent modifications of glutamic acid residues in prothrombin Proc Natl Acad Sci USA 71: p 2730– 2733 61 Stubbs MT, Bode W, (1993) A player of many parts: the spotlight falls on thrombin's structure Thromb Res 69: p 1-58 62 SY, Lee, (1996) High cell-density culture of Escherichia coli Trends Biotechnol 3: p 98-105 63 Tollefsen DM, Majerus DW, Blank MK , (1982) Heparin cofactor II Purification and properties of a heparin-dependent inhibitor of thrombin i n human plasma J Biol Chem 257: p 2162 - 2169 64 Viitanen MI, Vasala A, Neubauer P, Alatossava T, 2003 Cheese wheyinduced high-cell-density production of recombinant proteins in Escherichia coli Microb Cell Fact 2: p 65 Walsh, Gary, (2007) Pharmaceutical biotechnology - concepts and applications John Wiley & Sons, Ltd 1: p 105-109 66 Walter, H S., 1940 Purification of prothrombin and thrombin: chemical properties of purified preparations J Biol Chem 136: p 103-111 67 Walz DA, Anderson GF, Fenton JW 2nd., (1986) Responses of aortic smooth muscle to thrombin and thrombin analogues Ann N Y Acad Sci 485: p 323-34 68 Wong JW1, Ho SY, Hogg PJ, (2011) Disulfide bond acquisition through eukaryotic protein evolution Mol Biol Evol 28: p 327-34 69 Y, Jackson CM and Nemerson, (1980) Blood coagulation Annu Rev Biochem 49: p 765-811 70 Yonemura, H., et al., (2004), Preparation of recombinant alpha-thrombin: high-level expression of recombinant human prethrombin-2 and its activation by recombinant ecarin J Biochem 135(5): p 577-82 71 Bradford, M M., 1976 A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal Biochem 72: p 248-54 Tiếng Đức 72 Alexander Schmidt (1872) "Neue Untersuchungen ueber die Fasserstoffesgerinnung" Pflüger's Archiv für die gesamte Physiologie (6), p 413-538 Trang wed 73.fda.gov/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProducts/ApprovedProducts/ LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts/ucm089451.htm 74 http://fibrimex.com/products/ 75 http://labeling.pfizer.com/ShowLabeling.aspx?id=695 76.http://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/BloodBloodProduct s/ApprovedProducts/LicensedProductsBLAs/FractionatedPlasmaProducts /ucm074092.pdf 77 http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-bio-gen/documents/ document/ucm256531.pdf 78 http://www.openwetware.org/wiki/E._coli_genotypes#JM109.28DE3.29 79 http://www.pfizer.com/products/product-detail/thrombi_gel 80 http://www.pfizer.com/products/product-detail/thrombi_pad 81 http://www.prospecbio.com/Thrombin_Bovine_11_190/ 82.https://healthy.kaiserpermanente.org/health/care/consumer/health-wellness/ drugs-and-natural-medicines/drug-encyclopedia/medicine-information 83 https://worldwide.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloningtools-and-competent-cells/bacterial-strains-and-competentcells/bl21_de3_plyss-competent-cells/ 84.https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma /Bulletin/b9058bul.pdf 85 https://www.neb.com/products/c2527-bl21de3-competent-e-coli PHỤ LỤC Trình tự chuỗi acid amin prepro-prothrombin 10 20 30 40 50 60 MAHVRGLQLP GCLALAALCS LVHSQHVFLA PQQARSLLQR VRRANTFLEE VRKGNLEREC 70 80 90 100 110 120 VEETCSYEEA FEALESSTAT DVFWAKYTAC ETARTPRDKL AACLEGNCAE GLGTNYRGHV 130 140 150 160 170 180 NITRSGIECQ LWRSRYPHKP EINSTTHPGA DLQENFCRNP DSSTTGPWCY TTDPTVRRQE 190 200 210 220 230 240 CSIPVCGQDQ VTVAMTPRSE GSSVNLSPPL EQCVPDRGQQ YQGRLAVTTH GLPCLAWASA 250 260 270 280 290 300 QAKALSKHQD FNSAVQLVEN FCRNPDGDEE GVWCYVAGKP GDFGYCDLNY CEEAVEEETG 310 320 330 340 350 360 DGLDEDSDRA IEGRTATSEY QTFFNPRTFG SGEADCGLRP LFEKKSLEDK TERELLESYI 370 380 390 400 410 420 DGRIVEGSDA EIGMSPWQVM LFRKSPQELL CGASLISDRW VLTAAHCLLY PPWDKNFTEN 430 440 450 460 470 480 DLLVRIGKHS RTRYERNIEK ISMLEKIYIH PRYNWRENLD RDIALMKLKK PVAFSDYIHP 490 500 510 520 530 540 VCLPDRETAA SLLQAGYKGR VTGWGNLKET WTANVGKGQP SVLQVVNLPI VERPVCKDST 550 560 570 580 590 600 RIRITDNMFC AGYKPDEGKR GDACEGDSGG PFVMKSPFNN RWYQMGIVSW GEGCDRDGKY 610 620 GFYTHVFRLK KWIQKVIDQF GE PHỤ LỤC Nồng độ độ albumin huyết bò độ hấp thụ tương ứng Hàm lượng protein (mg/ml) 0,0025 0,005 0,0075 0,01 0,0125 0,015 0,0175 0,02 0,0225 0,025 0,05 0,075 0,1 0,125 0,15 0,175 OD595 0,019333 0,032333 0,038333 0,055667 0,065333 0,082667 0,091667 0,095 0,107667 0,13 0,2 0,29 0,38 0,432333 0,497667 0,567 PHỤ LỤC Mật độ tế bào chủng E.coli/pET22b(+) Chủng OD600x5 E.coli (DE3)plysE 0,323 ± 0,002 E.coli C43 (DE3) 0,335 ±0,002 E.coli BL21 (DE3) 0,346 ± 0,004 E.coli JM109 (DE3) 0,391 ± 0,006 E.coli (DE3)plysS 0,404 ± 0,003 ... có tính ứng dụng cao, luận văn: Biểu hiện, tinh sạch, đánh giá hoạt tính sinh học thrombin tái tổ hợp tiến hành với hai mục tiêu: Lựa chọn điều kiện tối ưu biểu thrombin tái tổ hợp Tinh thrombin. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ HỒNG DUYÊN BIỂU HIỆN, TINH SẠCH, ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA THROMBIN TÁI TỔ HỢP LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN... LB biểu thrombin 40 3.2.4 Lựa chọn nồng độ chất cảm ứng IPTG biểu thrombin 41 3.2.5 Lựa chọn thời điểm kết thúc biểu thrombin 42 3.3 Kết tinh thrombin đánh giá độ tinh khiết 43 3.4 Đánh