Phát hiện đột biến gen RB1 ở trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB1 Ở TRẺ EM UNG THƯ NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Hải Hà Sinh viên thực : Nguyễn Thị Thanh Hoa Lớp : 1202- K19 CNSH Hà Nội - 2016 LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Nguyễn Hải Hà – Phó Trưởng Phòng phân tích hệ gen, Viện nghiên cứu hệ gen, người thầy - người chị không hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ, chia sẻ khó khăn em suốt trình làm việc hoàn thành luận văn mà sống hàng ngày.Thái độlàm việc chuyên nghiệp chị truyền cảm hứng cho em giúp em cải thiện thân nhiều sau thời gian thực tập Em xin gửi lòng cảm ơn đặc biệt đến Ths.Nguyễn Phương Nhung, Ths.Ma Thị Huyền Thương CN.Phạm Nhật Khôi theo sát giúp đỡ bảo em suốt trình tiến hành thí nghiệm.Qua em xin cảm ơn tất cô, anh, chị Viện Nghiên cứu hệ gen giúp đỡ em nhiều suốt thời gian em thực tập Để có hiểu biết kiến thức chuyên ngành, em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học- Viện Đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho em kiến thức bổ ích suốt năm học qua Cuối cùng, em xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, người thân gia đình bạn bè ủng hộ, khích lệ động viên tinh thần em suốt thời gian thực tập tốt nghiệp để hoàn thành tốt khóa luận Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Hoa MỤC LỤC MỞ ĐẦU PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu ung thư nguyên bào võng mạc 1.1.1 Tình hình nghiên cứu ung thư nguyên bào võng mạc giới Việt Nam 1.1.2 Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc 1.1.3 Các yếu tố nguy gây ung thư nguyên bào võng mạc 1.1.4 Biểu lâm sàng bệnh ung thư nguyên bào võng mạc… 1.1.5 Chẩn đoán 1.1.6 Điều trị 1.1.7 Tư vấn di truyền 10 1.2 Cơ chế gây bệnh ung thư nguyên bào võng mạc 11 1.2.1 Tái tổ hợp nguyên phân (Mitotic Recombination) 13 1.2.2 Hoạt động bất thường DNA polymerase tổng hợp DNA (Gen Conversion) 13 1.2.3 Sự phân chia bất thường nhiễm sắc thể (Nondisjunction)… 14 1.3 Giới thiệu gen RB1 14 1.3.1 Tên gọi 14 1.3.2 Vị trí, đặc điểm 15 1.3.3 Chức 15 1.3.4 Những thay đổi gen RB1 liên quan đến tình trạng sức khỏe… 16 1.3.5 Cơ chế gây bệnh gen RB1 16 1.4 Cách tiếp cận phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng nhằm xác định đột biến gen RB1 giới Việt Nam 17 1.4.1 Phương pháp kết hợp PCR giải trình tự gen 17 1.4.2 Phương pháp kết hợp multiplex PCR định lượng giải trình tự 17 1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với multiplex PCR định lượng cho đoạn huỳnh quang ngắn (QMPSF) 18 1.4.4 Phương pháp PCR-RFLP với multiplex PCR định lượng giải trình tự gen 18 1.4.5 Phương pháp phân tích giải trình tự mRNA 19 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị 20 2.1.3 Hóa chất 20 2.2 Phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Quy trình lấy mẫu 22 2.2.2 Quy trình tách chiết genomic DNA 22 2.2.3 Kỹ thuật điện di gel agarose 23 2.2.4 Thiết kế mồi cho PCR sequencing 24 2.2.5 Quy trình thực PCR 27 2.2.6 Quy trình thực giải trình tự gen 29 2.2.7 Phương pháp phân tích kết 31 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Thu mẫu nghiên cứu 32 3.1.1 Đặc điểm lâm sàng bệnh nhân 32 3.2 Tách chiết DNA tổng số 32 3.3 PCR nhân đoạn gen RB1 35 3.4 Giải trình tự gen 36 3.4.1 Kết tinh 36 3.4.2 Kết giải trình tự 36 3.5 Phân tích kết 38 3.5.1 Phân tích biến đổi gen 38 3.5.2 Phân tích mối tương quan kiểu gen-kiểu hình 46 KẾT LUẬN 49 KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT UTNBVM Ung thư nguyên bào võng mạc DNA Deoxyribonucleic acid RNA Ribonucleic acid cDNA Complement deoxyribonucleic acid mRNA Messenger ribonucleic acid -RNA thông tin bp Base pair dNTPS Deoxyribonucleotide Triphosphate PCR Polymerase chain reaction Taq Thermus aquaticus UV Ultra violet TAE Tris-axit axetic-EDTA QM-PCR Quantitative Mutiplex Polymerase chain reaction DHPLC Denaturing High Performance Liquid Chromatography QMPSF Quantitative multiplex Polymerase chain reaction of short fluorescent fragments PCR-RFLP Polymerase chain reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid DMSO Dimethyl sulfoxide DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH ẢNH Bảng 1: Hướng dẫn pha dung dịch TAE 50X 23 Bảng 2: Các cặp mồi đặc hiệu cho phản ứng PCR 27 Bảng 3: Tóm tắt tình trạng bệnh đối tượng nghiên cứu 32 Bảng 4: Nồng độ độ tinh DNA tổng số mẫu bệnh nhi bố mẹ bệnh nhi 34 Hình 1: Hình ảnh siêu âmcủa UTNBVM Hình 2: Hình ảnh chụp cắt lớp vi tính UTNBVM Hình 3: Soi đáy mắt trước điều 10 trị hóa chất giảm tế bào 10 Hình 4: Soi đáy mắt sau điều trị hóa chất giảm tế bào 10 Hình 5: Giải thích mặt di truyền đột biến chức gen Rb 12 Hình 6: Tái tổ hợp nguyên phân 13 Hình 7: Hoạt động bất thường DNA polymerase chép DNA 14 Hình 8: Sự phân chia bất thường nhiễm sắc thể nguyên phân 14 Hình 9: Vị trí gen RB1 nhiễm sắc thể số 13 15 Hình 10: Cấu trúc gen protein RB1 15 Hình 11: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm DNA tổng số tách chiết từ mẫu máu bệnh nhân gia đình 33 Hình 12: Ảnh minh hoạ kết đo quang phổ DNA tổng số 35 Hình 13: Ảnh minh hoạ điện di đồ sản phẩm PCR mẫu KVM 35 36 Hình 14: Ảnh minh hoạ kết giải trình tự 37 Hình 15: Kết so sánh trình tự vùng điều khiển gen vùng mã hoá gen RB1 mẫu UTNBVM với trình tự chuẩn ATG: mã khởi đầu; K G T; M T C; TGA: mã kết thúc 44 Hình16: Kết dự đoán chức đột biến 470 I > L 44 Hình 17: Đột biến có ý nghĩa lâm sàng RB1 phát mẫu KVM 35 (A) Đột biến thay nucleotide T thành G vị trí 1494 (1494T>G) alen gen RB1 phát phương pháp giải trình tự Sanger chiều đọc ngược (B) Hậu đột biến 1494T>G tạo mã kết thúc codon 498 (*) mã kết thúc 46 MỞ ĐẦU Ung thư nguyên bào võng mạc(retinoblastoma, UTNBVM) bệnh u ác tính mắt thường gặp trẻ emdưới tuổi UTNBVM xuất với tỷ lệ khoảng 1/200000 Mỹ[3]và nhiều khu vực giới Bệnh xảy cân hai giới tính nam nữ, không phụ thuộc nguồn gốc, chủng tộc UTNBVM xuất dạng di truyền(~40%) không di truyền(~60) [4].Dạng di truyền thường xảy hai mắt nhiều khối u dạng không di truyền xảy mắt khối u Cả dạng UTNBVM liên quan đến chức hai alen gen áp chế khối u RB1 (retinoblastoma 1) nằm nhiễm sắc thể số 13 Dạng di truyền alen RB1 bị bất hoạt có nguồn gốc từ dòng mầm (germline) alen bị bất hoạt sinh dưỡng[5,13,14] RB1 protein có vai trò quan trọng điều khiển chu kỳ tế bào trình biệt hóa tế bào, tham gia vào chuyển pha G1/S cách ức chế yếu tố phiên mã E2F cần thiết cho khởi đầu pha S.Sự bất hoạt RB1 có tác động lớn đến quần thể nhỏ tế bào tiền thân tế bào nón trình phát triển võng mạc.Sự biểu cao RB nhóm tế bào chứng tỏ có vai trò lớn việc hạn chế phân chia tăng sinh tế bào[7] GenRB1 nằm tạivị trí 13q14.2gồm 27 exon 26 intron.Cho đến nay, 900 đột biến phát genRB1 bệnh nhân UTNBVM [8].Các phương pháp tiếp cận kết hợp multiplex PCR định lượng giải trình tự, sắc ký lỏng cao áp biến tính (DHPLC) với multiplex PCR định lượng cho đoạn huỳnh quang ngắn (QMPSF) hay PCR-RFLP với multiplex PCR định lượng giải trình tự gen cho phép phát đột biến tái phát, đoạn/thêm đoạn lớnvà đột biến điểm vùng promoter, exon vùng nối intron-exon genRB1[6,9,10,49].Việc xác định đột biến genRB1 bệnh nhân UTNBVM gia đình mang lại thông tin cần thiết để thực điều trị hiệu bảo tồn thị lực cho bệnh nhân Ngoài ra, sở để thực tư vấn di truyền cho người thân bệnh nhân Hàng năm bệnh viện Mắt trung ương phát khoảng 40 ca ung thư võng mạc mới.Phần lớn bệnh nhân nhập viện giai đoạn muộn nên bị lỡ hội điều trị bảo tồn mắt.Trong số đó, nhiều bệnh nhân sinh gia đình có tiền sử bệnh UTNBVM cho thấy vai trò yếu tố di truyền khả sinh bệnh Năm 2005 Nguyễn Công Kiệt Nguyễn Trí Dũng nghiên cứu đặc điểm di truyền 30 ca ung thư võng mạc Việt Nam Tuy nhiên, hạn chế phương pháp nghiên cứu, tác giả xác định trường hợp bệnh nhân có đoạn vị trí NST 13q14[2].Năm 2014, Nguyễn Hải Hà cộng xây dựng hoàn thiện quy trình giải trình vùng promoter, vùng nối intron-exon exon gen RB1 phát hai đột biến di truyền gây bệnh hai bệnh nhi có đột biến hoàn toàn chưa công bố[11].Cho đến nay, việc điều trị cho bệnh nhân ung thư võng mạc giai đoạn sớm thực hiệu Việt Nam, nhiên hiểu biết chế phân tử nguyên nhân di truyền bệnh hạn chế Các công tác tư vấn di truyền chưa thực nhằm đem lại hiểu biết cần thiết cho gia đình bệnh nhân, đặc biệt gia đình có người mắc bệnh cha/mẹ hay anh/chị em ruột Do nhu cầu thực tiễn bệnh nhân UTNBVM, khóa luận: “Phát đột biến genRB1 trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc” tiến hành với nội dung nghiên cứu sau: Thu thập mẫu máu bệnh nhi UTNBVM Bệnh viện Mắt trung ương, người thân gia đình mẫu bố/mẹ, anh chị em ruột (nếu có) RB1-KVM35 1510 1520 1530 1540 1550 1560 | | | | | | | | | | | | NM_000321 ATACAAACTTGGAGTTCGCTTGTATTACCGAGTAATGGAATCCATGCTTAAATCAGAAGA RB1-KVM20 RB1-KVM35 1570 1580 1590 1600 1610 1620 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AGAACGATTATCCATTCAAAATTTTAGCAAACTTCTGAATGACAACATTTTTCATATGTC RB1-KVM20 .M RB1-KVM35 1630 1640 1650 1660 1670 1680 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TTTATTGGCGTGCGCTCTTGAGGTTGTAATGGCCACATATAGCAGAAGTACATCTCAGAA RB1-KVM20 RB1-KVM35 K 1690 1700 1710 1720 1730 1740 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TCTTGATTCTGGAACAGATTTGTCTTTCCCATGGATTCTGAATGTGCTTAATTTAAAAGC RB1-KVM20 RB1-KVM35 1750 1760 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | | | | | NM_000321 CTTTGATTTTTACAAAGTGATCGAAAGTTTTATCAAAGCAGAAGGCAACTTGACAAGAGA RB1-KVM20 RB1-KVM35 1810 1820 1830 1840 1850 1860 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AATGATAAAACATTTAGAACGATGTGAACATCGAATCATGGAATCCCTTGCATGGCTCTC RB1-KVM20 RB1-KVM35 1870 1880 1890 1900 1910 1920 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AGATTCACCTTTATTTGATCTTATTAAACAATCAAAGGACCGAGAAGGACCAACTGATCA RB1-KVM20 RB1-KVM35 1930 1940 1950 1960 1970 1980 | | | | | | | | | | | | NM_000321 CCTTGAATCTGCTTGTCCTCTTAATCTTCCTCTCCAGAATAATCACACTGCAGCAGATAT RB1-KVM20 RB1-KVM35 1990 2000 2010 41 2020 2030 2040 | | | | | | | | | | | | NM_000321 GTATCTTTCTCCTGTAAGATCTCCAAAGAAAAAAGGTTCAACTACGCGTGTAAATTCTAC RB1-KVM20 RB1-KVM35 2050 2060 2070 2080 2090 2100 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TGCAAATGCAGAGACACAAGCAACCTCAGCCTTCCAGACCCAGAAGCCATTGAAATCTAC RB1-KVM20 RB1-KVM35 2110 2120 2130 2140 2150 2160 | | | | | | | | | | | | NM_000321 CTCTCTTTCACTGTTTTATAAAAAAGTGTATCGGCTAGCCTATCTCCGGCTAAATACACT RB1-KVM20 RB1-KVM35 2170 2180 2190 2200 2210 2220 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TTGTGAACGCCTTCTGTCTGAGCACCCAGAATTAGAACATATCATCTGGACCCTTTTCCA RB1-KVM20 RB1-KVM35 2230 2240 2250 2260 2270 2280 | | | | | | | | | | | | NM_000321 GCACACCCTGCAGAATGAGTATGAACTCATGAGAGACAGGCATTTGGACCAAATTATGAT RB1-KVM20 RB1-KVM35 2290 2300 2310 2320 2330 2340 | | | | | | | | | | | | NM_000321 GTGTTCCATGTATGGCATATGCAAAGTGAAGAATATAGACCTTAAATTCAAAATCATTGT RB1-KVM20 RB1-KVM35 2350 2360 2370 2380 2390 2400 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AACAGCATACAAGGATCTTCCTCATGCTGTTCAGGAGACATTCAAACGTGTTTTGATCAA RB1-KVM20 RB1-KVM35 2410 2420 2430 2440 2450 2460 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AGAAGAGGAGTATGATTCTATTATAGTATTCTATAACTCGGTCTTCATGCAGAGACTGAA RB1-KVM20 RB1-KVM35 2470 2480 2490 2500 2510 2520 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AACAAATATTTTGCAGTATGCTTCCACCAGGCCCCCTACCTTGTCACCAATACCTCACAT RB1-KVM20 42 RB1-KVM35 2530 2540 2550 2560 2570 2580 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TCCTCGAAGCCCTTACAAGTTTCCTAGTTCACCCTTACGGATTCCTGGAGGGAACATCTA RB1-KVM20 RB1-KVM35 2590 2600 2610 2620 2630 2640 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TATTTCACCCCTGAAGAGTCCATATAAAATTTCAGAAGGTCTGCCAACACCAACAAAAAT RB1-KVM20 RB1-KVM35 2650 2660 2670 2680 2690 2700 | | | | | | | | | | | | NM_000321 GACTCCAAGATCAAGAATCTTAGTATCAATTGGTGAATCATTCGGGACTTCTGAGAAGTT RB1-KVM20 RB1-KVM35 2710 2720 2730 2740 2750 2760 | | | | | | | | | | | | NM_000321 CCAGAAAATAAATCAGATGGTATGTAACAGCGACCGTGTGCTCAAAAGAAGTGCTGAAGG RB1-KVM20 RB1-KVM35 2770 2780 2790 2800 2810 2820 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AAGCAACCCTCCTAAACCACTGAAAAAACTACGCTTTGATATTGAAGGATCAGATGAAGC RB1-KVM20 RB1-KVM35 2830 2840 2850 2860 2870 2880 | | | | | | | | | | | | NM_000321 AGATGGAAGTAAACATCTCCCAGGAGAGTCCAAATTTCAGCAGAAACTGGCAGAAATGAC RB1-KVM20 RB1-KVM35 2890 2900 2910 2920 2930 2940 | | | | | | | | | | | | NM_000321 TTCTACTCGAACACGAATGCAAAAGCAGAAAATGAATGATAGCATGGATACCTCAAACAA RB1-KVM20 RB1-KVM35 2950 2960 2970 2980 2990 3000 | | | | | | | | | | | | NM_000321 GGAAGAGAAATGAGGATCTCAGGACCTTGGTGGACACTGTGTACACCTCTGGATTCATTG RB1-KVM20 RB1-KVM35 43 Hình 15: Kết so sánh trình tự vùng điều khiển gen vùng mã hoá gen RB1 mẫu UTNBVM với trình tự chuẩn ATG: mã khởi đầu; K G T; M T C; TGA: mã kết thúc 3.5.1.1 KVM 20 Trình tự DNA nhận mẫu KVM20 so sánh với trình tự cDNA chuẩn gen RB1 lưu ngân hàng gen với mã số NM-000231.2 trình tự người chuẩn (GRCh37/hg19) (Hình 15) Kết xác định vùng điều khiển vùng biên exon-intron gen RB1 bất thường trình tự nucleotide Khi phân tích trình tự exon phát haialen gen RB1 bị đột biến exon số 15 Đây dạng đột biến thay nucleotide T thay C vị trí số 1422 Đột biến kí hiệu 1422T>C.Phân tích dịch mã cho thấy đột biến làm thay đổi amino acid codon số 470 protein RB1 từ Isoleucin (I) thành Lysin (L) Để dự đoán ảnh hưởng điểm thay đổi acid amin I470L, sử dụng phần mềm Polyphen-2 Đây phần mềm cho phép dự đoán ảnh hưởng việc thay acid amin đến chức protein Kết phân tích cho thấy ảnh hưởng đột biến thay acid amin I thành L vị trí 470 chức protein RB1 (BENIGN) (Hình 16) Như phương pháp giải trình tự trực tiếp, chưa xác định đột biến di truyền nguyên nhân gây bệnh mẫu KVM 20 Hình16: Kết dự đoán chức đột biến 470 I > L 3.5.1.2 KVM35 Trình tự DNA nh nhận mẫu KVM35 đượcc so sánh vvới trình tự cDNA chuẩn gen RB1 lưu ngân hàng gen với mã số NM-000231.2 trình tự người chuẩnn (GRCh37/hg19) (Hình 17) Kết xác đđịnh vùng điều khiển n vùng biên exon-intron exon gen RB1 bbất thường trình tự nucleotide Khi phân tích trình tự t exon phát hai alen củaa gen RB1 bị đột biến exon số 16 Đây ddạng đột biến thay nucleotide T thay G tạii vị v trí số 1494 Đột biến đượcc kí hi hiệu 1494T>G (Hình 17A) Phân tích ddịch mã cho thấy đột biến tạoo mã kết k thúc vị trí thay đổii codon 498 ccủa protein RB1 (Hình 17B) Đột biến bi bốn nhóm nghiên cứuu khác th giới phát hiện(RB1 RB1 muatation database) database A Trình tự chuẩnTGG GGCCACATATAGCAGTAAG Alen 1-KVM35 KVM35 TGGCCACATAGAGCAGTAAG Alen 2-KVM35 KVM35 TGGCCACATATAGCAGTAAG B Hình 17: Đột ột biến bi có ý nghĩa lâm sàng RB1 phát hi mẫu KVM35 (A) Độ ột biến thay nucleotide T thành ành G ttại vị trí 1494 (1494T>G) alen c gen RB1 phát ng phương ph pháp giải trình tự ự Sanger chiều chi đọc ngược (B) Hậu quảả củ đột biến 1494T>G ttạomã kết thúc codon 498 (*) mã k kết thúc 3.5.2 Phân tích mốii tương tươ quan kiểu gen-kiểu hình 3.5.2.1 KVM 35 Như kết giảii trình tự t hình 17A cho thấy đỉnh lồồng vào nhau, đỉnh màu đỏ tương ứng ng với v nucleotide T đỉnh màu đen en tươ tương ứng với nucleotide G Trên máy giải trình tự 3500 ABI nhận tín hiệu, theo chương trình phần mềm lập trình cho máy cho kết K Phân tích kết giải trình tự người mẹ cho thấy đỉnh tương ứng nucleotide G thấp so với đỉnh tương ứng nucleotide T, người vị trí xuất đỉnh lồng giống mẹ độ cao đỉnh tương đương Có thể kết luận kiểu gen dị hợp tử tỉ lệ chiều cao đỉnh vị trí tương đương (có alen khác vị trí này) Theo quy luật di truyền, người nhận alen từ bố alen từ mẹ, so sánh tương quan kiểu hình bố bình thường, mẹ mang bệnh Vì vậy, khả cao UTNBVM di truyền từ người mẹ Thực tế,phân tích gen người bố nhận kiểu gen đồng hợp TT vị trí c.1494, khingười mẹ xuất nucleotide thay T thành G vị trí Đặc biệt kết giải trình tự gen người mẹ cho thấy tỷ lệ alen G chiếm tỷ lệ khoảng 30% so với alen T, khác với trường hợp có kiểu gen dị hợp với tỷ lệ hai alen tương đồng nhau.Do đó, dự đoán người mẹ mang đột biến c.1494 T>G dạng thể khảm tức số tế bào mầm thể chứa alen đột biến [52] đột biến gây bệnh di truyền hoàn toàn sang người Như vậy, xác định nguyên nhân gây bệnh thể di truyền thứ bệnh nhân KVM 35 Nếu đột biến gây bệnh thứ hai là đột biến tế bào dòng loại đoạn DNA lớn phương pháp giải trình tự Sanger sử dụng không cho phép xác định Hoặc đột biến thứ hai đột biến sinh dưỡng xảy khối u võng mạc cần phải kiểm tra DNA khối u xác định Người chẩn đoán có UTNBVM hai mắt đột biến phát người đột biến dòng mầm (germline mutation), có nghĩa cá thể mang gen RB1 đột biến tất tế bào Vì vậy, saucá thể có nguy cao phát triển bệnh ung thư khác, có 50% nguy di 47 truyền gen RB1 đột biến cho đời [17] Đối với đứa trẻ người mẹ KVM 35m sinh có khả cao bị di truyền gen RB1 đột biến dẫn đến UTNBVM Vì đứa trẻ cần phải theo dõi chặt chẽ cách khám mắt thường xuyên Các công bố cho thấy cá thể mang đột biến di truyền RB1 có tới 90% khả phát bệnh [53] 48 KẾT LUẬN Nghiên cứu xây dựng điều kiện kỹ thuật cho phép xác định đột biến vùng điều khiển, vùng mang mã vùng biên exon-intron gen RB1 Đối với bệnh nhân nghiên cứu, xác định đột biến gây bệnh alen gen RB1 Hai đột biến đựơc phát hai mẫu bệnh nhi chẩn đoán UTNBVM 1422T>C (c.1422T>C) exon 15 bệnh nhi KVM20 1494T>G (77073T>G, c.1494T>G) exon 16 bệnh nhi KVM35 Đột biến di truyềngây bệnh mẫu bệnh nhi KVM35 đột biến tế bào dòng, có tính chất di truyền nên kết thu ý nghĩa cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh cho bệnh nhi mà thông tin hữu ích cho công tác tư vấn di truyền bệnh nhi gia đình họ KIẾN NGHỊ Phát triển nghiên cứu để tiến hành nghiên cứu bệnh UTNBVM với số lượng mẫu lớn 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO http://bacsinoitru.vn/content/chan-doan-va-dieu-tri-u-nguyen-baovong-mac-1 Nguyễn Công Kiệt Nguyễn Chí Dũng.(2005).Đặc điểm di truyền ung thư nguyên bào võng mạc.Y học TP.Hồ Chí Minh 1:99-103 Young JL., Smidth MA., Roffer SD, Liff JM and Bunin JG (1999) Cancer incidence and survial among children and adolescent In Retinoblastoma (ed L Ries): 1975-1995 Balmer A, Zografos L, Munier F (2006) Diagnosis and current management of retinoblastoma Oncogen25:5341-9 Cavenee WK, Dryja TP, Phillips RA, Benedict WF, Godbout R, Gallie BL, Murphree AL, Strong LC, White RL (1983) Expression of recessive alens by chromosomal mechanisms in retinoblastoma Nature 305:779-84 Abidi O1, Knari S, Sefri H, Charif M, Senechal A, Hamel C, Rouba H, Zaghloul K et al ( 2011).Mutational analysis of the RB1 gen in Moroccan patients with retinoblastoma.Molecular Vision 17:3541-7 Xu XL, Fang Y, Lee TC, Forrest D, Gregory-Evans C, Almeida D, Liu A, Jhanwar SC, Abramson DH, Cobrinik D (2009) Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling Cell 137:1018-31 Valverde JG, Alonso J, Palacios I and Pestana A (2005) RB1 gen mutation up-date, a meta-analysis based on 932 reported mutations avalable in a searchable database BMC Gent 6,53 FernandezC, Repetto K, Dalamon V, Bergonzi F, Ferreiro V, Szijan I (2007) RB1 germ-line deletion in Argentine retinoblastoma patients Mol Diagn Ther 11:55-61 50 10 Abouzeid H, Schorderet DF, Balmer A, Munie FL (2009) Germline mutations in retinoma patients: Relevance to low-penetrance and lowexpressivity molecular basis Mol Vis 15:771-777 11 Nguyễn Hải Hà, Đỗ Mạnh Hưng, Lê Thuý Quỳnh, Nguyễn Thuỳ Dương, Nguyễn Đăng Tôn (2014) Phát đột biến gen RB1 trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc Tạp chí công nghệ sinh học 12:23-29 12 Selma Sirin, MD, Marcus C.de Jong, MD, MSc, Pim de Graaf, MD, PhD, Hervé J.Brisse…(2016).High-Resolution Magnetic Resonance Imaging Can Reliably Detect Orbital Tumor Recurrence after Enucleation in Children with Retinoblastoma.Ophthalmology 3:635-45 13 Dietmar R Lohmann, MD and Brenda L Gallie, MD.(2015).Retinoblastoma.GenReviews® 14 Hajer Ayari-Jeridi, Kimberly Bouguila.(2015).Mutation Spectrum Moran, of Amel RB1 Gen Chebbi, in Hédi Unilateral Retinoblastoma Cases from Tunisia and Correlations with Clinical Features.PLoS One 1: e0116615 15 Nathan G.Lambert, BS, Blair A.Winegar, MD, G.Peter Feola, MD, Aparna Ramasubramanian, MD.(2015).Ocular dysmotility after intraarterial chemotherapy for retinoblastoma.Journal of AAPOS 6:574-7 16 De Jong MC1, van der Meer FJ1, Göricke SL1, Brisse HJ1, Galluzzi P1,…(2015).Diagnostic accuracy of intraocular Tumor size Measured with Mr imaging in the Prediction of Postlaminar Optic nerve invasion and Massive choroidal invasion of retinoblastoma.Radiology 19:151213 17 Retinoblastoma -American Cancer Society.(2015) 18 Ming-yan He, Yu An, Yi-jin Gao,Corresponding author Xiao-wen Qian,Gang Li, and Jiang Qian.(2014).Screening of RB1 gen mutations in Chinese patients with retinoblastoma and preliminary exploration of genotype–phenotype correlations.Molecular Vision 20:545-52 51 19 Friend SH, Bernards R, Rogelj S, Weinberg RA, Rapaport JM, Albert DM, Dryja TP.(1986).A human DNA segment with properties of the gen that predisposes to retinoblastoma and osteosarcoma.Nature6089:643-6 20 Knudson AG Jr.(1971) Mutation and cancer: statistical study of retinoblastoma.Proc Natl Acad Sci U S A 4:820-3 21 Wiggs J, Nordenskjöld M, Yandell D, Rapaport J, Grondin V, Janson M, Werelius B, Petersen R, Craft A, Riedel K.(1988).Prediction of the risk of hereditary retinoblastoma, using DNA polymorphisms within the retinoblastoma gen.N Engl J Med 3:151-7 22 Moll AC, Imhof SM, Bouter LM, Kuik DJ, Den Otter W, Bezemer PD, Koten JW, Tan KE.(1996).Second primary tumors in patients with hereditary retinoblastoma: a register-based follow-up study, 1945-1994.Int J Cancer 4:515-9 23 Lee WH, Bookstein R, Hong F, Young LJ, Shew JY, Lee EY.(1987).Human retinoblastoma susceptibility gen: cloning, identification, and sequence.Science 4794:1394-9 24 Richter S, Vandezande K, Chen N, Zhang K, Sutherland J, Anderson J, Han L, Panton R, Branco P, Gallie (2003).Sensitive and efficient detection of RB1 gen mutations enhances care for families with retinoblastoma.Am J Hum Gent 2:253-69 25 Nichols KE, Houseknecht MD, Godmilow L, Bunin G, Shields C, Meadows A, Ganguly A.(2005).Sensitive multistep clinical molecular screening of 180 unrelated individuals with retinoblastoma detects 36 novel mutations in the RB1 gen.Hum Mutat 6:566-74 26 Abramson DH, Frank CM, Susman M, Whalen MP, Dunkel IJ, Boyd NW III.(1998).Presenting signs of retinoblastoma.J Pediatr 3:505-8 27 Arun D.Singh, Carol L et al.(2000).Prognosis factors in retinoblastoma.Journal of Pediatric Ophthalmology and Strabismus 3: 134141 52 28 Chantada G et al.(2004).Results of a prospective study for the treatment of retinoblastoma.Cancer 4: 834-42 29 Debra L.Friedman, Bruce Himelstein et al.(2000).Chemoreduction and local Ophthalmic Therapy for Intraocular Retinoblastoma.Journal of Clinical Oncology 12 30 Shields CL et al (2004).Practical approach to management of retinoblastoma.Arch Ophthalmol 5: 729-35 31 http://23pairsofchromosomes.com/page/2 The Molecular and Cell Biology of Cancer 32 Nevins JR1.(2001).The Rb/E2F pathway and cancer.Human Molecular Gentics 7:699-703 33 Chellappan SP1, Hiebert S, Mudryj M, Horowitz JM, Nevins JR.(1991).The E2F transcription factor is a cellular target for the RB protein.Cell 6:1053-61 34 Lukas J1, Parry D, Aagaard L, Mann DJ, Bartkova J, Strauss M, Peters G, Bartek J.(1995).Retinoblastoma-protein-dependent cell-cycle inhibition by the tumour suppressor p16.Nature 6531:503-6 35 Ali MJ1, Parsam VL, Honavar SG, Kannabiran C, Vemuganti GK, Reddy VA.(2010).RB1 gen mutations in retinoblastoma and its clinical correlation.Saudi J Ophthalmol 4:119-23 36 RB1 Gen(Protein Coding).Gencards-human gen database 37 RB1 Gen.Gentics home reference 38 Katherine M.Hyland, PhD.Tumor Suppressor Gens and Oncogens: Gens that Prevent and Cause Cancer.Biochemistry/Molecular Biology Lecture 39 Deborah L.Burkhart & Julien Sage.(2008).Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gen.Nature Reviews Cancer 8: 671-682 53 40 Al-Nawaiseh I1, Jammal HM, Khader YS, Jaradat I, Barham R.(2014).Retinoblastoma in Jordan, 2003-2013: ocular survival and associated factors.Ophthalmic Epidemiol 6:406-11 41 Sippel KC1, Fraioli RE, Smith GD, Schalkoff ME, Sutherland J, Gallie BL, Dryja TP.(1998).Frequency of somatic and germ-line mosaicism in retinoblastoma: implications for gentic counseling.Am J Hum Gent 3:610-9 42 Mastrangelo D1, Squitieri N, Bruni S, Hadjistilianou T, Frezzotti R.( 1997).The polymerase chain reaction (PCR) in the routine gentic characterization of retinoblastoma: a tool for the clinical laboratory.Survey of Ophthalmology 4:331-40 43 http://genticslab.emory.edu/tests/SRB1X.Retinoblastoma: RB1 Gen Sequencing 44 Devarajan B, Prakash L, Kannan TR, Abraham AA, Kim U, Muthukkaruppan V, Vanniarajan A.(2015).Targeted next genration sequencing of RB1 gen for the molecular diagnosis of Retinoblastoma.BMC Cancer 15:320 45 T'Ang A, Wu KJ, Hashimoto T, Liu WY, Takahashi R, Shi XH, Mihara K, Zhang FH, Chen YY, Du C (1989) Genomic organization of the human retinoblastoma gen.Oncogen4:401–407 46 Gill RM, Hamel PA, Zhe J, Zacksenhaus E, Gallie BL, Phillips RA.(1994).Characterization of the human RB1 promoter and of elements involved in transcriptional regulation.Cell Growth Differ 5:467-74 47 Houdayer C1, Gauthier-Villars M, Laugé A, Pagès-Berhouet S, Dehainault C, Caux-Moncoutier V (2004).Comprehensive screening for constitutional RB1 mutations by DHPLC and QMPSF.Human Mutation 2:193-202 48 http://www.science.gov/topicpages/l/liquid+chromatography+dhplc.ht ml 54 49 Parsam VL, Kannabiran C, Honavar S, Vemuganti GK, Ali MJ.(2009).A comprehensive, sensitive and economical approach for the detection of mutations in the RB1 gen in retinoblastoma.Journal Gentic 4:517-27 50 Grzegorz Kurzawski,corresponding author1 Dagmara Dymerska,Pablo Serrano-Fernández, Joanna Trubicka, Bartłomiej Masojć, Anna Jakubowska, and Rodney J Scott1.(2012).DNA and RNA analyses in detection of gentic predisposition to cancer.Hered Cancer Clin Pract 1: 17 51 Abidi O1, Knari S, Sefri H, Charif M, Senechal A, Hamel C, Rouba H, Zaghloul K, …( 2011).Mutational analysis of the RB1 gen in Moroccan patients with retinoblastoma.Molecular Vision 17:3541-7 52 Germline mosaicism Wikipedia 53 Balmer A1, Zografos L, Munier F (2006) Diagnosis and current management of retinoblastoma Oncogene38:5341-9 55 [...]... ung thư tương đối ít phổ biến ở trẻ em Cho đến nay có rất nhiều đột biến trong UTNBVM đã được báo cáo Bên cạnh đó, đột biến soma bất hoạt genRB1 đã được báo cáo trong một số trường hợp ung thư bàng quang.Ngoài ung thư bàng quang, đột biến soma ở genRB1 còn liên quan đến các dạng ung thư khác Ví dụ, thay đổi trên genRB1đã được phát hiện trên một số trường hợp ung thư phổi, ung thư vú, một loại ung thư. .. các đoạn gen RB1, giải trình tự chuỗi DNA tại vùng điều khiển, vùng nối exon-intron và toàn bộ vùng mang mã củagenRB1 3 Phân tích kết quả giải trình tự nhằm phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân UTNBVM tại Việt Nam Mục tiêu của đề tài: Phát hiện đột biến di truyền gây bệnh trên genRB1 ở trẻ em ung thư nguyên bào võng mạc Ý nghĩa của đề tài: Kết quả thu được có thể làm sáng tỏ nguyên nhân gây bệnh ở mức độ... phân tử và làm cơ sở cho công tác chẩn đoán, chữa trị và tư vấn di truyền cho các bệnh nhân và gia đình người bệnh UTNBVM 3 PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về ung thư nguyên bào võng mạc 1.1.1 Tình hình ung thư nguyên bào võng mạctrên thế giới và ở Việt Nam Ung thư ở trẻ em chiếm tỷ lệ 1–2% trên tổng số các ca ung thư. Một trong số các ung thư trẻ em phải kể đến là UTNBVM .Ở Mỹ và các nước Bắc... 1/3 UTNBVM gây ra bởi đột biến trên genRB1 được di truyền từ bố mẹ.Hầu hết số còn lại xảy ra là do một genRB1 ngẫu nhiên bị đột biến và chỉ xảy ra trong một tế bào của một mắt Đột biến này không di truyền từ bố mẹ và những đứa con của chúng sau này không có nguy cơ cao bị UTNBVM [17] 1.1.4 Biểu hiện lâm sàng của bệnh ung thư nguyên bào võng mạc Các biểu hiện lâm sàng thư ng gặp ở UTNBVM: ∗ Đồng tử... genRBđột đột biến, biến tế bào cần trải qua hai sự kiện đột biến tế bào soma trên 2 alen của cùng ùng một m gen RB1[ 1,21].Đối Đối với bệnh nhân mà gia đình có tiền sử gây bệnh,, ngay tại giai đoạn hợp tử bệnh nhân đã mang một gen RB đột biến, chỉỉ cần cầ trải qua một sự kiện đột biến trên tếế bbào soma là có khả năng gây nên kiểu ểu hình h ung thư. Bất kể các đột biếnn ban đầu là do di truyềnn hay do phát. .. 1.1.2 Phân loại ung thư nguyên bào võng mạc Bệnh này có 2 loại: Loại 1 (sporadic retinoblastoma): xuất hiện ở trẻ em trong gia đình không có tiền sử bị bệnh, khối u thư ng chỉ xuất hiện trong 1 mắt thư ng được chữa khỏi bằng phương pháp phẫu thuật cắt bỏ khối u và không có nguy cơ bị ung thư ở những nơi khác trên cơ thể[13,27,42,51] 4 Loại 2 (familial retinoblastoma):xuất hiện ở trẻ em trong gia đình... hiệu đồng tử trắng: Bệnh Coats: những biến đổi mạch máu (giãn mạch) ở ngoại vi võng mạc, dịch dưới võng mạc nhiều, không có can xi, thư ng ở hai mắt, không có yếu tố di truyền Bệnh võng mạc trẻ đẻ non: gặp ở trẻ đẻ non có cân nặng khi sinh thấp và được điều trị bổ xung oxy.Tăng sinh xơ mạch và bong võng mạc làm cho đồng tử có màu trắng Viêm màng bồ đào bẩm sinh: thư ng có dính bờ đồng tử, có thể kèm... tính lặn[2].Sự chuyển dạng ác tính của các tế bào võng mạc xảy ra khi cả 2 alen của genRB1bị đột biến mất chức năng Phát hiện này củng cố giả thuyết “two hit” của Knudson, cho rằngUTNBVM hình thành cần có hai cú hích gây tổn thư ng di truyền:lần 1 (đột biến dòng) đột biến xảy ra trên các exon của genRB1, lần 2 (đột biến thể soma) làm sai lệch sinh sản tế bào dẫn đến sự hình thành khối u[2,19,20,35,42]... sự sinh sản tế bào. Khi không có pRB, các phôi bào sinh sản bất tận dẫn đến bệnh ung thư. Hoạt động tương tác giữa pRB và E2Fđược điều hòa bởi các yếu tố như cyclin D1, cdk4 và p16[2,31,32,33,34].Một alenhoạt động của RB1 cũng có khả năng ngăn chặn sinh ung thư. Vì vậy, UTNBVM là một trong các loại bệnh ung thư ở người hình thành do có đột biến mất chức năng ở ổ gen, được gọi là gen ung thư tính lặn[2].Sự... nhiên, những yếu tố này thư ng mất nhiều năm để ảnh hưởng tới nguy cơ mắc ung thư, vì vậy nó thư ng không được xem là đóng nhiều vai trò trong UTNBVM[17].Có rất ít các yếu tố nguy cơ được biết đến gây ảnh hưởng tới ung thư nguyên bào võng mạc. Trong đó có 2 yếu tố sau đóng vai trò quan trọng: ∗ Tuổi: Hầu hết trẻ em được chẩn đoán bị UTNBVM là ít hơn 3 tuổi.UTNBVM hiếm ở trẻ trưởng thành và người lớn[17]