Nội dung bài viết giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc. Phát hiện đột biến gen RB có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô u.
Trang 1Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học
PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB Ở MỨC RNA
TRÊN BỆNH NHÂN U NGUYÊN BÀO VÕNG MẠC
Hoàng Anh Vũ*, Nguyễn Công Kiệt**
TÓM TẮT
Giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc (UNBVM). Phát hiện đột biến gen RB có ý
nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị.
Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô
u.
Đối tượng và phương pháp: Toàn bộ vùng mã hóa protein của gen RB gồm 27 exon đã được khuếch đại và
giải trình tự chuỗi DNA từ 4 bệnh nhân.
Kết quả: Chúng tôi phát hiện một bệnh nhân có đột biến mất đoạn exon 2, một bệnh nhân bị mất đoạn exon
14 và một bệnh nhân bị chèn thymine trên exon 3.
Kết luận: Kỹ thuật xác định đột biến gen RB ở mức RNA có thể ứng dụng trong công tác chẩn đoán và
điều trị cho bệnh nhân.
Từ khóa: u nguyên bào võng mạc, đột biến gen RB, giải trình tự chuỗi DNA
ABSTRACT
DETECTION OF RB MUTATIONS AT RNA LEVEL IN RETINOBLASTOMA PATIENTS
Hoang Anh Vu, Nguyen Cong Kiet
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 72 ‐ 75
Introduction: Mutations in the RB gene cause retinoblastoma. Detection of RB mutations is important for
a strategy for cancer screening in carriers and for prediction of relapse in retinoblastoma patients.
Objective: This study aims to establish a testing procedure for RB mutant identification from blood and
tumor‐derived RNA.
Patients and methods: The RB coding region encompassing 27 exons were amplified and sequenced from
4 patients.
Results: We found RB mutations in 3 patients, including deletion of exon 2, deletion of exon 14 and
insertion of thymine in exon 3.
Conclusion: The technique described here should be applied to clinical setting.
Key words: retinoblastoma, RB gene mutation, DNA sequencing
ĐẶT VẤN ĐỀ
U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là dạng
ung thư hốc mắt thường gặp nhất ở trẻ em,
chiếm khoảng 3% trong tổng số các trường hợp
ung thư trong lứa tuổi này. Tần suất bệnh được
ước tính trong khoảng 1/15.000 – 1/20.000 trẻ
sinh sống và không có sự khác biệt giữa các chủng tộc và giới tính(6). Bệnh thường biểu hiện trước 3 tuổi với các dấu hiệu đồng tử trắng, lé, thị lực kém, mắt đỏ và đau (khi có biến chứng). Các trường hợp UNBVM có tính gia đình chiếm 40%, thường có nhiều u, biểu hiện ở cả hai mắt và xuất hiện triệu chứng sớm trong năm
*Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM **Bộ môn Mắt, Đại học Y Dược TPHCM
Tác giả liên lạc: TS.BS. Hoàng Anh Vũ ĐT: 0122‐2993537 Email: hoangvuxinh@yahoo.com
Trang 2Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013
Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 72
đầu tiên(8). Các trường hợp ngẫu nhiên thường
chỉ có 1 khối u của 1 bên mắt và khởi phát trễ
hơn. Tại Việt Nam, hầu hết bệnh nhi thường chỉ
được phát hiện ở giai đoạn trễ, xâm lấn nhiều,
đe dọa tính mạng nên điều trị bảo tồn rất hạn
chế và phải cắt bỏ nhãn cầu(8). Trong khi đó, ở
các nước phát triển, tỷ lệ điều trị thành công trên
95% do được phát hiện sớm(7).
Đột biến gen RB gây ra sự bất hoạt của cả 2
alen đã được xác định là nguyên nhân gây
UNBVM trong cả các trường hợp có tính gia
đình và ngẫu nhiên(5). Đột biến ở alen đầu tiên
có thể là đột biến mầm ở các trường hợp có tính
gia đình hoặc đột biến sinh dưỡng trong trường
hợp bệnh ngẫu nhiên; trong khi đó đột biến ở
alen thứ hai là đột biến sinh dưỡng xảy ra trên tế
bào của võng mạc. Việc phát hiện đột biến gen
RB trong UNBVM có ý nghĩa quan trọng trong
việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư
cho người lành mang gen đột biến cũng như
góp phần đánh giá nguy cơ tái phát trên bệnh
nhân đang được điều trị(2,6).
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
4 bệnh nhi UNBVM được điều trị tại Bệnh
viện Mắt TPHCM thỏa các điều kiện: Bệnh nhi
được chẩn đoán xác định UNBVM dựa vào kết
quả khám lâm sàng, chụp cắt lớp điện toán, siêu
âm và giải phẫu bệnh sau khi được cắt bỏ nhãn
cầu. Cha mẹ của mỗi bệnh nhi có giấy đồng
thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu này.
Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA
Từ mỗi bệnh nhi, chúng tôi thu nhận 4 mL
máu ngoại vi được chống đông trong EDTA có
bổ sung puromycin (200 μg/mL) và lắc nhẹ
trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó RNA được
tách chiết bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ)
theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo
nồng độ bằng máy quang phổ kế
spectrophotometer. DNA bổ sung (complement
DNA hay cDNA) được tổng hợp từ 1 μg RNA
với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse
Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Chất lượng
cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của gen beta‐actin dài 1180 bp. Ở một bệnh nhân, mẫu mô u cũng được thu nhận để đối chiếu với kết quả đột biến gen phát hiện trong máu.
Thiết kế mồi cho PCR (polymerase chain reaction)
Toàn bộ vùng mã hóa protein của gen RB
dài khoảng 3 kb được khuếch đại bằng 2 cặp mồi được thiết kết với phần mềm Oligo 4.1 dựa
trên trình tự chuẩn của RB mang accession
number NM_000321 trong GenBank. Thông tin các đoạn mồi được trình bày trong Bảng 1.
Bảng 1: Thông tin về các đoạn mồi dùng cho PCR.
Tên mồi
được khuếch đại
Sản phẩm PCR (bp)
RB-1F TGTAACGGGAGTCGGGAGAG
Exon 1 –
16
1652
RB-3R CCATGGGAAAGACAAATCTG
RB-4F GAGGTTGTAATGGCCACATA
Exon 17 –
27
1380
RB-5R CAGTCACATCTGTGAGAGAC
Thực hiện PCR
Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250
μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5
μM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara Bio, Nhật Bản) và cDNA (25 ng). Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 45 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở
720C trong 90 giây và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản), tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit
và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2%.
Trang 3Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học
Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được
thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye V3.1 (Applied Biosystems, Mỹ), theo 2
chiều xuôi và ngược. Các đoạn mồi dùng cho
cycle sequencing được liệt kê trong Bảng 2. Sản
phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan
trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2
phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA
được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer,
với POP‐7 polymer và capillary 80 cm (Applied
Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng
phần mềm SeqScape.
Bảng 2: Các đoạn mồi dùng cho cycle sequencing.
RB-1F TGTAACGGGAGTCGGGAGAG
RB-2F GTATTGTTTGCACTCTTCAG
RB-3F AATGGACTTCCAGAGGTTGA
RB-4F GAGGTTGTAATGGCCACATA
RB-5F GTCTGAGCACCCAGAATTAG
RB-1R CGAACTGCTGGGTTGTGTCA
RB-2R CTGTCTATAGAATCAGTCTG
RB-3R CCATGGGAAAGACAAATCTG
RB-4R GTTCATACTCATTCTGCAGG
RB-5R CAGTCACATCTGTGAGAGAC
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng kỹ thuật giải trình tự RNA của
gen RB
Gen RB là một gen lớn nằm trên nhiễm sắc
thể 13, gồm 27 exon chiếm chiều dài hơn 180 kb.
Đột biến trên genomic DNA không có tính khu
trú vào một vùng nhất định nào của gen này mà
phân bố khắp chiều dài gen, làm cho việc khảo
sát đột biến trên genomic DNA rất phức tạp và
tốn kém. Kỹ thuật phân tích đột biến trên RNA
tập trung vào các exon, có thể phát hiện các đột
biến thuộc vùng mã hóa protein của gen. Chúng
tôi đã khuếch đại thành công vùng mã hóa
protein của gen RB bằng 2 phản ứng PCR, với
sản phẩm tương ứng là 1652 bp và 1380 bp, giúp
đơn giản quá trình phân tích đột biến gen (Hình
1A). Trước khi tách chiết RNA, mẫu máu đã
được trộn ủ với puromycin nhằm ngăn chặn sự
thoái hóa các RNA đột biến trong tế bào(1,4,11).
Các sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch
đã được tiến hành giải trình tự chuỗi DNA để
xác định thay đổi trên exon của gen RB. Toàn bộ
các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết
quả đặc hiệu với các vùng gen RB đã được
khuếch đại.
Phát hiện đột biến gen RB trên bệnh nhân
u nguyên bào võng mạc
Từ mẫu máu của 4 bệnh nhân, chúng tôi phát hiện 3 bệnh nhân có mang đột biến của gen
RB, gồm 2 đột biến mất đoạn và 1 đột biến chèn
đoạn (Hình 1B‐E). Cả 3 đột biến phát hiện trong máu đều ở trang thái dị hợp tử vì còn hiện diện alen bình thường khi phân tích sóng giải trình tự chuỗi DNA.
Đột biến mất đoạn exon 14 vẫn bảo tồn khung đọc nhưng làm mất đi 19 amino acid do exon này mã hóa. Đột biến này đã được mô tả trên một bệnh nhân bị UNBVM cả hai mắt và trên người cha bị UNBVM một bên mắt(9). Đây là một kiểu trượt exon bất thường, chỉ có thể phát hiện được khi khảo sát ở mức RNA, trong khi cơ chế chính xác chưa thể được xác định trong phân tích đột biến trên genomic DNA(9). Khi phân tích trên mẫu máu, chúng tôi ghi nhận đột biến mất exon 14 ở trạng thái dị hợp tử (Hình 1B); tuy nhiên phân tích mẫu mô u cho thấy đột biến này ở trạng thái đồng hợp tử (Hình 1C). Kết quả phù hợp với vai trò của RB trong phát sinh UNBVM: đột biến mầm phát hiện trong máu đã kết hợp với một sự cố thứ 2 trên tế bào võng mạc làm mất tính dị hợp tử và gây bệnh(3).
Trang 4Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013
Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 74
Gen RB mã hóa protein gồm 928 amino acid.
Đột biến mất exon 2 làm lệch khung đọc, tạo ra
protein với mã dừng sớm ở codon 68, thiếu hầu
hết các vùng quan trọng của protein này (Hình
1D). Trường hợp này có thể coi đột biến đã làm
mất chức năng ức chế khối u của RB, giải thích
cho tính mẫn cảm cao với sự hình thành
UNBVM trên bệnh nhân. Tương tự, đột biến
thêm 1 nucleotide ở exon 3 cũng làm lệch khung
đọc và dừng tổng hợp protein tại codon 109
(Hình 1E).
So với kỹ thuật khảo sát đột biến ở mức
genomic DNA thì kỹ thuật sử dụng RNA cho
phép xác định được các hậu quả do đột biến
DNA gây nên: đó là những bất thường hình
thành trong quá trình phiên mã tạo RNA(9, 12).
Tuy nhiên, cần chú ý thao tác trên RNA đòi
hỏi các tiêu chuẩn kỹ thuật nghiêm ngặt hơn
như bảo quản mẫu tươi đúng quy cách, trong
quá trình tách chiết RNA và tổng hợp cDNA
tránh làm phân hủy RNA do luôn có sự hiện
diện RNase trên bề mặt da của người thao tác
kỹ thuật.
Trong nghiên cứu này, có một bệnh nhân
chúng tôi không phát hiện đột biến nào trong
vùng mã hóa protein của gen RB. Một số nghiên
cứu cho thấy ngoài các đột biến trên gen RB, sự
bất hoạt của RB còn có thể do hiện tượng methyl
hóa quá mức vùng điều hòa gen(10). Kỹ thuật
phát hiện tình trạng methyl hóa đang được
chúng tôi tiếp tục xây dựng để hoàn thiện việc
khảo sát bất thường của gen RB.
KẾT LUẬN
Kỹ thuật khảo sát đột biến gen RB ở mức
RNA giúp phát hiện được các đột biến gây bệnh
trên bệnh nhân UNBVM. Việc ứng dụng kỹ
thuật này vào lâm sàng có thể giúp ích cho
chương trình chẩn đoán sớm qua sàng lọc và
theo dõi điều trị.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
nonsense‐mediated messenger RNA decay in clinical samples facilitates detection of human MSH2 mutations with an in vivo fusion protein assay and conventional techniques. Cancer Res;57(15):3288‐93.
Amare Kadam PS(2005). Constitutional and somatic RB1 mutation spectrum in nonfamilial unilateral and bilateral retinoblastoma in India. Genet Test;9(3):200‐211.
suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer;8(9):671‐82.
V, Doz F, Desjardins L, Couturier J, Parent P, Stoppa‐Lyonnet
D, Gauthier‐Villars M, Houdayer C(2007). A deep intronic
mutation in the RB1 gene leads to intronic sequence
exonisation. Eur J Hum Genet;15(4):473‐7.
Cancer;10(5):353‐361.
retinoblastoma. Am J Ophthalmol;148(2):192‐8.
JE(2006). Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978‐1997): Report from the Automated Childhood Cancer Information System project. Eur J Cancer;42(13):2092‐
2102.
đoán ung thư nguyên bào võng mạc. Y học TPHCM;11(1):278‐
282.
C(2011). Splicing aberrations caused by constitutional RB1
gene mutations in retinoblastoma. J Biosci;36(2):281‐287.
10 Sheck LH, Ng YS, Watson M, Vincent AL(2013). Clinical Findings and Molecular Diagnosis of Retinoblastoma in Older Children. Ophthalmic Genet. (Epub ahead of print).
11 Tsai T, Fulton L, Smith BJ, Mueller RL, Gonzalez GA, Uusitalo
MS, OʹBrien JM(2004). Rapid identification of germline mutations in retinoblastoma by protein truncation testing. Arch Ophthalmol;122(2):239‐48.
12 Zhang K, Nowak I, Rushlow D, Gallie BL, Lohmann DR(2008).
Patterns of missplicing caused by RB1 gene mutations in
patients with retinoblastoma and association with phenotypic expression. Hum Mutat;29(4):475‐84.
Ngày nhận bài báo 11‐06‐2013 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20‐06‐2013 Ngày bài báo được đăng: 15–07‐2013