Nội dung bài viết giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u nguyên bào võng mạc. Phát hiện đột biến gen RB có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm soát ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị. Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán đột biến gen RB từ RNA của máu và mô u.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN RB Ở MỨC RNA TRÊN BỆNH NHÂN U NGUN BÀO VÕNG MẠC Hồng Anh Vũ*, Nguyễn Cơng Kiệt** TĨM TẮT Giới thiệu: Đột biến gen RB gây nên u ngun bào võng mạc (UNBVM). Phát hiện đột biến gen RB có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm sốt ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ xuất hiện bệnh ở mắt còn lại trên bệnh nhân đang được điều trị. Mục tiêu: Nghiên cứu này nhằm xây dựng quy trình chẩn đốn đột biến gen RB từ RNA của máu và mơ u. Đối tượng và phương pháp: Tồn bộ vùng mã hóa protein của gen RB gồm 27 exon đã được khuếch đại và giải trình tự chuỗi DNA từ 4 bệnh nhân. Kết quả: Chúng tơi phát hiện một bệnh nhân có đột biến mất đoạn exon 2, một bệnh nhân bị mất đoạn exon 14 và một bệnh nhân bị chèn thymine trên exon 3. Kết luận: Kỹ thuật xác định đột biến gen RB ở mức RNA có thể ứng dụng trong cơng tác chẩn đốn và điều trị cho bệnh nhân. Từ khóa: u ngun bào võng mạc, đột biến gen RB, giải trình tự chuỗi DNA ABSTRACT DETECTION OF RB MUTATIONS AT RNA LEVEL IN RETINOBLASTOMA PATIENTS Hoang Anh Vu, Nguyen Cong Kiet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 72 ‐ 75 Introduction: Mutations in the RB gene cause retinoblastoma. Detection of RB mutations is important for a strategy for cancer screening in carriers and for prediction of relapse in retinoblastoma patients. Objective: This study aims to establish a testing procedure for RB mutant identification from blood and tumor‐derived RNA. Patients and methods: The RB coding region encompassing 27 exons were amplified and sequenced from 4 patients. Results: We found RB mutations in 3 patients, including deletion of exon 2, deletion of exon 14 and insertion of thymine in exon 3. Conclusion: The technique described here should be applied to clinical setting. Key words: retinoblastoma, RB gene mutation, DNA sequencing sinh sống và khơng có sự khác biệt giữa các ĐẶT VẤN ĐỀ chủng tộc và giới tính(6). Bệnh thường biểu hiện U nguyên bào võng mạc (UNBVM) là dạng trước 3 tuổi với các dấu hiệu đồng tử trắng, lé, ung thư hốc mắt thường gặp nhất ở trẻ em, thị lực kém, mắt đỏ và đau (khi có biến chứng). chiếm khoảng 3% trong tổng số các trường hợp Các trường hợp UNBVM có tính gia đình ung thư trong lứa tuổi này. Tần suất bệnh được chiếm 40%, thường có nhiều u, biểu hiện ở cả ước tính trong khoảng 1/15.000 – 1/20.000 trẻ hai mắt và xuất hiện triệu chứng sớm trong năm *Trung tâm Y sinh học Phân tử, Đại học Y Dược TPHCM **Bộ mơn Mắt, Đại học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: TS.BS. Hồng Anh Vũ Email: hoangvuxinh@yahoo.com Chun Đề Giải Phẫu Bệnh ĐT: 0122‐2993537 71 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 đầu tiên(8). Các trường hợp ngẫu nhiên thường chỉ có 1 khối u của 1 bên mắt và khởi phát trễ hơn. Tại Việt Nam, hầu hết bệnh nhi thường chỉ được phát hiện ở giai đoạn trễ, xâm lấn nhiều, đe dọa tính mạng nên điều trị bảo tồn rất hạn chế và phải cắt bỏ nhãn cầu(8). Trong khi đó, ở các nước phát triển, tỷ lệ điều trị thành công trên 95% do được phát hiện sớm(7). Đột biến gen RB gây ra sự bất hoạt của cả 2 alen đã được xác định là nguyên nhân gây UNBVM trong cả các trường hợp có tính gia đình và ngẫu nhiên(5). Đột biến ở alen đầu tiên có thể là đột biến mầm ở các trường hợp có tính gia đình hoặc đột biến sinh dưỡng trong trường hợp bệnh ngẫu nhiên; trong khi đó đột biến ở alen thứ hai là đột biến sinh dưỡng xảy ra trên tế bào của võng mạc. Việc phát hiện đột biến gen RB trong UNBVM có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm sốt ung thư cho người lành mang gen đột biến cũng như góp phần đánh giá nguy cơ tái phát trên bệnh nhân đang được điều trị(2,6). ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 4 bệnh nhi UNBVM được điều trị tại Bệnh viện Mắt TPHCM thỏa các điều kiện: Bệnh nhi được chẩn đoán xác định UNBVM dựa vào kết quả khám lâm sàng, chụp cắt lớp điện toán, siêu âm và giải phẫu bệnh sau khi được cắt bỏ nhãn cầu. Cha mẹ của mỗi bệnh nhi có giấy đồng thuận tự nguyện tham gia nghiên cứu này. Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA Từ mỗi bệnh nhi, chúng tôi thu nhận 4 mL máu ngoại vi được chống đơng trong EDTA có bổ sung puromycin (200 μg/mL) và lắc nhẹ trong 4 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó RNA được tách chiết bằng RNeasy mini Kit (Qiagen, Mỹ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. RNA được đo nồng độ bằng máy quang phổ kế spectrophotometer. DNA bổ sung (complement DNA hay cDNA) được tổng hợp từ 1 μg RNA với bộ hóa chất SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, Mỹ). Chất lượng 72 cDNA được kiểm tra bằng cách khuếch đại đoạn cDNA của gen beta‐actin dài 1180 bp. Ở một bệnh nhân, mẫu mô u cũng được thu nhận để đối chiếu với kết quả đột biến gen phát hiện trong máu. Thiết kế mồi cho PCR (polymerase chain reaction) Tồn bộ vùng mã hóa protein của gen RB dài khoảng 3 kb được khuếch đại bằng 2 cặp mồi được thiết kết với phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của RB mang accession number NM_000321 trong GenBank. Thơng tin các đoạn mồi được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1: Thơng tin về các đoạn mồi dùng cho PCR. Tên mồi Vùng gen khuếch đại RBExon – TGTAACGGGAGTCGGGAGAG 1F 16 RBCCATGGGAAAGACAAATCTG 3R RBExon 17 – GAGGTTGTAATGGCCACATA 4F 27 RB5R Trình tự (5’ -3’) Sản phẩm PCR (bp) 1652 1380 CAGTCACATCTGTGAGAGAC Thực hiện PCR Trong mỗi tube PCR có tổng thể tích 25 μL, các thành phần gồm có PCR buffer, dNTP (250 μM cho mỗi loại), 2 loại mồi xi và ngược (0,5 μM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (Takara Bio, Nhật Bản) và cDNA (25 ng). Chu kỳ luân nhiệt được thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Mỹ) bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C trong 2 phút, theo sau bằng 45 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 90 giây và kết thúc bằng giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản), tinh sạch bằng QIAquick Gel Extraction kit và được kiểm tra lại bằng điện di trên thạch agarose 1,2%. Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 (Applied Biosystems, Mỹ), theo 2 chiều xuôi và ngược. Các đoạn mồi dùng cho cycle sequencing được liệt kê trong Bảng 2. Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi‐Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP‐7 polymer và capillary 80 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape. Bảng 2: Các đoạn mồi dùng cho cycle sequencing. Tên RB-1F RB-2F RB-3F RB-4F RB-5F RB-1R RB-2R RB-3R RB-4R RB-5R Trình tự (5’ -3’) TGTAACGGGAGTCGGGAGAG GTATTGTTTGCACTCTTCAG AATGGACTTCCAGAGGTTGA GAGGTTGTAATGGCCACATA GTCTGAGCACCCAGAATTAG CGAACTGCTGGGTTGTGTCA CTGTCTATAGAATCAGTCTG CCATGGGAAAGACAAATCTG GTTCATACTCATTCTGCAGG CAGTCACATCTGTGAGAGAC KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Xây dựng kỹ thuật giải trình tự RNA của gen RB Gen RB là một gen lớn nằm trên nhiễm sắc thể 13, gồm 27 exon chiếm chiều dài hơn 180 kb. Đột biến trên genomic DNA khơng có tính khu trú vào một vùng nhất định nào của gen này mà phân bố khắp chiều dài gen, làm cho việc khảo sát đột biến trên genomic DNA rất phức tạp và tốn kém. Kỹ thuật phân tích đột biến trên RNA tập trung vào các exon, có thể phát hiện các đột biến thuộc vùng mã hóa protein của gen. Chúng tơi đã khuếch đại thành cơng vùng mã hóa protein của gen RB bằng 2 phản ứng PCR, với sản phẩm tương ứng là 1652 bp và 1380 bp, giúp đơn giản q trình phân tích đột biến gen (Hình 1A). Trước khi tách chiết RNA, mẫu máu đã được trộn ủ với puromycin nhằm ngăn chặn sự thối hóa các RNA đột biến trong tế bào(1,4,11). Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Các sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch đã được tiến hành giải trình tự chuỗi DNA để xác định thay đổi trên exon của gen RB. Tồn bộ các kết quả giải trình tự chuỗi DNA đều cho kết quả đặc hiệu với các vùng gen RB đã được khuếch đại. Phát hiện đột biến gen RB trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc Từ mẫu máu của 4 bệnh nhân, chúng tơi phát hiện 3 bệnh nhân có mang đột biến của gen RB, gồm 2 đột biến mất đoạn và 1 đột biến chèn đoạn (Hình 1B‐E). Cả 3 đột biến phát hiện trong máu đều ở trang thái dị hợp tử vì còn hiện diện alen bình thường khi phân tích sóng giải trình tự chuỗi DNA. Đột biến mất đoạn exon 14 vẫn bảo tồn khung đọc nhưng làm mất đi 19 amino acid do exon này mã hóa. Đột biến này đã được mô tả trên một bệnh nhân bị UNBVM cả hai mắt và trên người cha bị UNBVM một bên mắt(9). Đây là một kiểu trượt exon bất thường, chỉ có thể phát hiện được khi khảo sát ở mức RNA, trong khi cơ chế chính xác chưa thể được xác định trong phân tích đột biến trên genomic DNA(9). Khi phân tích trên mẫu máu, chúng tơi ghi nhận đột biến mất exon 14 ở trạng thái dị hợp tử (Hình 1B); tuy nhiên phân tích mẫu mơ u cho thấy đột biến này ở trạng thái đồng hợp tử (Hình 1C). Kết quả phù hợp với vai trò của RB trong phát sinh UNBVM: đột biến mầm phát hiện trong máu đã kết hợp với một sự cố thứ 2 trên tế bào võng mạc làm mất tính dị hợp tử và gây bệnh(3). 73 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Gen RB mã hóa protein gồm 928 amino acid. Đột biến mất exon 2 làm lệch khung đọc, tạo ra protein với mã dừng sớm ở codon 68, thiếu hầu hết các vùng quan trọng của protein này (Hình 1D). Trường hợp này có thể coi đột biến đã làm mất chức năng ức chế khối u của RB, giải thích cho tính mẫn cảm cao với sự hình thành UNBVM trên bệnh nhân. Tương tự, đột biến thêm 1 nucleotide ở exon 3 cũng làm lệch khung đọc và dừng tổng hợp protein tại codon 109 (Hình 1E). So với kỹ thuật khảo sát đột biến ở mức genomic DNA thì kỹ thuật sử dụng RNA cho phép xác định được các hậu quả do đột biến DNA gây nên: đó là những bất thường hình thành trong quá trình phiên mã tạo RNA(9, 12). Tuy nhiên, cần chú ý thao tác trên RNA đòi hỏi các tiêu chuẩn kỹ thuật nghiêm ngặt hơn như bảo quản mẫu tươi đúng quy cách, trong quá trình tách chiết RNA và tổng hợp cDNA tránh làm phân hủy RNA do ln có sự hiện diện RNase trên bề mặt da của người thao tác kỹ thuật. Trong nghiên cứu này, có một bệnh nhân chúng tôi không phát hiện đột biến nào trong vùng mã hóa protein của gen RB. Một số nghiên cứu cho thấy ngồi các đột biến trên gen RB, sự bất hoạt của RB còn có thể do hiện tượng methyl hóa q mức vùng điều hòa gen(10). Kỹ thuật phát hiện tình trạng methyl hóa đang được chúng tơi tiếp tục xây dựng để hồn thiện việc khảo sát bất thường của gen RB. KẾT LUẬN Kỹ thuật khảo sát đột biến gen RB ở mức RNA giúp phát hiện được các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào lâm sàng có thể giúp ích cho chương trình chẩn đốn sớm qua sàng lọc và theo dõi điều trị. TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 Andreutti‐Zaugg C, Scott RJ, Iggo R (1997). Inhibition of nonsense‐mediated messenger RNA decay in clinical samples facilitates detection of human MSH2 mutations with an in vivo fusion protein assay and conventional techniques. Cancer Res;57(15):3288‐93. Bamne MN, Ghule PN, Jose J, Banavali SD, Kurkure PA, Amare Kadam PS(2005). Constitutional and somatic RB1 mutation spectrum in nonfamilial unilateral and bilateral retinoblastoma in India. Genet Test;9(3):200‐211. Burkhart DL, Sage J(2008). Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer;8(9):671‐82. Dehainault C, Michaux D, Pagès‐Berhouet S, Caux‐Moncoutier V, Doz F, Desjardins L, Couturier J, Parent P, Stoppa‐Lyonnet D, Gauthier‐Villars M, Houdayer C(2007). A deep intronic mutation in the RB1 gene leads to intronic sequence exonisation. Eur J Hum Genet;15(4):473‐7. Fletcher O, Houlston RS. Architecture of inherited susceptibility to common cancer(2010). Nat Rev Cancer;10(5):353‐361. Lin P, O’Brien JM(2009). Frontiers in the management of retinoblastoma. Am J Ophthalmol;148(2):192‐8. MacCarthy A, Draper GJ, Steliarova‐Foucher E, Kingston JE(2006). Retinoblastoma incidence and survival in European children (1978‐1997): Report from the Automated Childhood Cancer Information System project. Eur J Cancer;42(13):2092‐ 2102. Nguyễn Cơng Kiệt(2007). Giá trị của siêu âm và CT trong chẩn đốn ung thư ngun bào võng mạc. Y học TPHCM;11(1):278‐ 282. Parsam VL, Ali MJ, Honavar SG, Vemuganti GK, Kannabiran C(2011). Splicing aberrations caused by constitutional RB1 gene mutations in retinoblastoma. J Biosci;36(2):281‐287. Sheck LH, Ng YS, Watson M, Vincent AL(2013). Clinical Findings and Molecular Diagnosis of Retinoblastoma in Older Children. Ophthalmic Genet. (Epub ahead of print). Tsai T, Fulton L, Smith BJ, Mueller RL, Gonzalez GA, Uusitalo MS, OʹBrien JM(2004). Rapid identification of germline mutations in retinoblastoma by protein truncation testing. Arch Ophthalmol;122(2):239‐48. Zhang K, Nowak I, Rushlow D, Gallie BL, Lohmann DR(2008). Patterns of missplicing caused by RB1 gene mutations in patients with retinoblastoma and association with phenotypic expression. Hum Mutat;29(4):475‐84. Ngày nhận bài báo Ngày phản biện nhận xét bài báo: Ngày bài báo được đăng: 11‐06‐2013 20‐06‐2013 15–07‐2013 74 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh ... đặc hi u với các vùng gen RB đã được khuếch đại. Phát hiện đột biến gen RB trên bệnh nhân u nguyên bào võng mạc Từ m u m u của 4 bệnh nhân, chúng tơi phát hiện 3 bệnh nhân có mang đột biến của gen ... khảo sát bất thường của gen RB. KẾT LUẬN Kỹ thuật khảo sát đột biến gen RB ở mức RNA giúp phát hiện được các đột biến gây bệnh trên bệnh nhân UNBVM. Việc ứng dụng kỹ thuật này vào ... biến ở alen thứ hai là đột biến sinh dưỡng xảy ra trên tế bào của võng mạc. Việc phát hiện đột biến gen RB trong UNBVM có ý nghĩa quan trọng trong việc hoạch định chương trình tầm sốt ung thư