Phát hiện đột biến gen p53 ở bệnh nhân ung thư vú qua nhuộm hoá mô miễn dịch và giải trình tự gen

Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu xác định tỉ lệ đột biến gen p53 (exon 5-8) ở bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú bằng phương pháp giải trình tự gen và sự biểu hiện protein p53 bằng phương pháp hóa mô miễn dịch (IHC). Phát hiện đột biến gen p53 ở bệnh nhân ung thư vú qua nhuộm hoá mô miễn dịch và giải trình tự gen

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN P53 Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ VÚ QUA NHUỘM HỐ MƠ MIỄN DỊCH VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GEN Đỗ Thị Thanh Thủy*, Hồng Anh Vũ*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* TÓM TẮT Mở đầu: Ung thư vú đứng hàng thứ ba loại ung thư giới Tỉ lệ mắc bệnh tỉ lệ tử vong thay đổi tùy quốc gia Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến đổi di truyền khác tế bào sinh dưỡng, đột biến gen sinh khối u gen ức chế khối u Ngồi ra, yếu tố mơi trường tác động lên bệnh ung thư vú Ngày nay, ung thư vú, đột biến gen nghiên cứu nhiều, gen ức chế khối u p53 với tỉ lệ gặp khoảng 30% Một số nghiên cứu đánh giá vai trò đột biến gen p53 tiên lượng bệnh ung thư vú gây nhiều tranh cãi Nhiều nghiên cứu cố gắng nhận diện giai đoạn phát sinh ung thư vú mà đột biến p53 tế bào sinh dưỡng xảy Phối hợp phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch protein P53 xác định đột biến gen p53 phương pháp giải trình tự giúp đánh giá được mối tương quan đột biến gen p53 với kiểu biểu protein P53, tiên lượng sống đưa phương pháp trị liệu thích hợp cho bệnh nhân Mục tiêu: Xác định tỉ lệ đột biến gen p53 (exon 5-8) bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú phương pháp giải trình tự gen biểu protein p53 phương pháp hóa mơ miễn dịch (IHC) Phương pháp: Nghiên cứu cắt ngang 100 bệnh nhân chẩn đoán carcinôm tuyến vú Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y Dược thời gian từ tháng 06/2008 đến tháng 6/2010 Sử dụng kỹ thuật hóa mơ miễn dịch để xem xét tích tụ protein p53 nhân tế bào kỹ thuật giải trình tự gen để xác định tình trạng đột biến gen p53 Phân tích mối tương quan tình trạng đột biến gen p53 tình trạng tích tụ protein p53 nhân tế bào Kết quả: Trong mẫu mô bệnh nhân chẩn đoán carcinoma tuyến vú, tỷ lệ biểu tích tụ protein P53 nhân tế bào 57% Gen p53 (exon - exon 8) phân tích phương pháp giải trình tự, tỉ lệ đột biến 28%, đột biến xảy exon chiếm tỉ lệ cao (69,4%) Đột biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6% Đột biến xảy chủ yếu vị trí thứ thứ (100%) mã di truyền 33% đột biến xảy vùng trình tự bảo tồn gen 25% đột biến xảy vùng CpG Đột biến xảy codon 175 chiếm 5,6% Đột biến Tyr163Cys chiếm 14% Đột biến xảy cao vùng L2/L3 (36%) L1/S/H2 (17%) Sự tương đồng đột biến gen p53 với tích tụ mức protein P53 nhân tế bào 19% Tỉ lệ tương đồng biểu protein p53 tình trạng đột biến gen p53 53% 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có biến đổi trình tự gen p53 68% số mẫu biến đổi gen p53 có XN HMMD dương tính Liên quan biểu protein P53 đột biến gen p53 với đặc điểm carcinôm tuyến vú nhóm tuổi, loại mơ học, độ mơ học, tình trạng hạch khơng có khác biệt Kết luận: Tỷ lệ biểu tích tụ protein P53 nhân tế bào carcinôm tuyến vú (IHC) 57% tỉ lệ đột biến gen p53 qua kỹ thuật giải trình tự 28% Tỷ lệ tương đồng biểu protein p53 tình trạng đột biến gen p53 53% 33 % số mẫu có XN HMMD dương tính có biến đổi gen p53 68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD dương tính Từ khóa: Đột biến gen, biểu gen, P53, carcinôm tuyến vú * Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: Ts.BS Đỗ Thị Thanh Thủy Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh ĐT: 0908.487.425 Email: thuyprenatal@gmail.com 99 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 ABSTRACT DETECTING P53 GENE MUTATIONS OF BREAST CANCER BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND DIRECT SEQUENCING TECHNIQUES Do Thi Thanh Thuy, Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 98 - 106 Background: Breast cancer is the third leading cancer on the world The incidence and the mortality rates vary depending on countries Breast cancer is associated with types of somatic genetic alterations such as mutations in tumor suppressor genes and oncogenes Environmental agents have also affected to etiology of breast cancer Now, studies have paid attention on gene mutations, especially p53 gene mutations Some studies assessing the prognostic and predictive roles of p53 alterations in breast cancer have conflicting results Many studies try to identify the stages which breast cancer’s development and progression occur involving in mutations of p53 gene in somatic cells Dectecting the pattern of p53 gene mutations in breast cancer by DNA sequencing and immunohistochemistry methods may be help to assess the correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation, the prognosis the survival as well as having suitable treatment for patients Aims: - Identify the rate of p53 gene mutations (from exon to exon 8) and p53 protein accumulation in the tissues of breast diagnosed adenocarcinoma by immunohistochemistry and DNA sequencing - Determine the correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei Method: Cross Sectional Study on 100 patients who were diagnosed adenocarcinoma of breast at University of Medicine and PharcmacyDepartment of Pathology, HCMC from June 2008 to June 2010 Using Immunohistochemistry and DNA sequencing methods to identify p53 protein accumulation and mutations of p53 gene Analysis of correlation between p53 gene mutations and p53 protein accumulation in cell nuclei Results: Overexpressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28% inwhich mutations in exon has highest rate with 69,4% Missense mutations has rate of 91,6% Mutated sites usually occufy at number and number of codon 33% mutations is in conserved region and 25% in CpG region Mutation at codon 175 is 5,6% and mutation at codon 163 (Tyr163Cys) is 14% Mutation at L2/L3 region is 36$ and L1/S/H2 region is 17% The rate of the samples with both p53 gene mutated and overexpression of p53 protein is 19% The correlation between p53 gene mutation status and p53 protein accummulation status is 53% 33% of samples which have IHC (+) has p53 gene mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+) The relation between IHC (+), p53 gene mutation and the characteristics od breast cancer such as age group,types of histology, histological grade and nodular status are not significantly diffirent Conclusion: Over expressions of p53 protein is 57% and p53 gene mutations is 28% The correlation between p53 gene mutatin and p53 protein accummulation is: 33% of samples which have IHC (+) has p53 gene mutation and 68% of samples which have p53 gene mutation has IHC (+) Key words: gene mutation, gene expression, p53, adenocarcinoma of breast điều trị tích cực chống lại tình trạng di hệ ĐẶT VẤN ĐỀ thống Ung thư vú liên quan đến nhiều loại biến Ung thư vú đứng hàng thứ đổi di truyền khác tế bào sinh dưỡng, loại ung thư Việt Nam Tỉ lệ mắc bệnh tỉ lệ đột biến gen sinh khối u gen ức chế tử vong thay đổi tùy quốc gia Mỗi năm có khối u Ngồi ra, yếu tố môi trường tác động lên 1.000.000 trường hợp mắc bệnh bệnh ung thư vú Ngày nay, ung chẩn đoán Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh tăng thư vú, đột biến gen nghiên cứu nhiều vòng 20 năm qua, tiên lượng bệnh gen ức chế khối u p53 với tỉ lệ gặp cải thiện nhiều chẩn đốn sớm 100 Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 khoảng 30% Một số nghiên cứu đánh giá vai trò đột biến gen p53 tiên lượng bệnh ung thư vú gây nhiều tranh cãi Nhiều nghiên cứu cố gắng nhận diện giai đoạn phát sinh ung thư vú mà đột biến p53 tế bào sinh dưỡng xảy Hai phương pháp phân tích đột biến gen p53 giải trình tự gen p53 hóa mơ miễn dịch (IHC) xem xét biểu protein p53 Trong phạm vi đề tài này, chúng tơi thực giải trình tự gen p53 từ exon 5-8 vùng tập trung tỉ lệ đột biến cao nhất, đồng thời phân tích biểu protein p53 bệnh nhân phương pháp hóa mơ miễn dịch (IHC) ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 100 bệnh nhân chẩn đốn carcinơm tuyến vú Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y Dược khoảng thời gian từ tháng 06/2008 đến tháng 6/2010 với đầy đủ hồ sơ bệnh án Phương pháp nghiên cứu Kỹ thuật hố mơ miễn dịch biểu protein P53 Bệnh phẩm Mẫu mô carcinôm tuyến vú cố định formol đệm trung tính từ – 48 vùi paraffin Kháng thể sử dụng thể DO-7 nhà sản trước chứng âm không phủ kháng thể thứ Kỹ thuật giải trình tự phát đột biến gen P53 Tách chiết DNA từ bệnh phẩm Thu hoạch tế bào từ mô vùi nến bệnh phẩm carcinôm tuyến vú Sau chẩn đốn giải phẫu bệnh, vùng mơ ung thư đánh dấu tiêu HE Đối chiếu với tiêu HE, đánh dấu vùng mô ung thư tiêu trắng lấy vùng tế bào ung thư vào tube ly tâm 1,5ml Tách chiết DNA từ mô CRC QIAkit PCR khuyếch đại đoạn gen p53 chứa exon 5-8: Đối tượng nghiên cứu Kháng Nghiên cứu Y học xuất DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha lỗng 1/25 Đọc kết đánh giá kính hiển vi quang học Về biểu tích tụ mức protein TP53, dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu đậm độ bắt màu: (không bắt màu 10%); 2(+): (bắt màu trung bình > 10%); 3(+): bắt màu đậm > 10%; Âm tính: 0; Dương tính: 1(+), 2(+), 3(+) với Dùng cặp mồi p53g5F2 5’GGTTGCAGGAGGTGCTTACA-3’ p53g8R5’GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG-3 để khuyếch đại đoạn DNA chứa exon 5-8 có kích thước 1741bp từ hệ gen DNA li trích Thành phần phản ứng: µl 10X PCR buffer, µl 2,5 mM dNTP, 2,5 µl p53g5F2 (10µM), 2,5 µl p53g8R (10µM), 0,3 µl Takara Tag TM HS, 2,5 µg DNA Chương trình PCR : 98 oC x phút, 98 oC x 10 giây, 60 oC x 30 giây, 72 oC x phút (40 chu kì), 72oC x phút Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR gel agarose với thang chuẩn Ready-LoadTM Kb Plus DNA Ladder để xác định kích thước sản phẩm PCR Tinh sản phẩm PCR Sử dụng kit GFX QIAgen PCR trước giải trình tự kết tủa DNA ethanol Tiến hành PCR giải trình tự sản phẩm PCR tinh mồi xuôi mồi ngược, tạo lượng lớn đoạn DNA chồng lắp nhau nucleotid, có nucleotide cuối gắn chất bắt màu đặc hiệu phát huỳnh quang đèn laser chứng dương mơ carcinơm tuyến vú có mức biểu protein P53 biết dương tính (3+) Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 101 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Thành phần phản ứng PCR µl Big Dye terminator V.3.1, 0.3 µl mồi (10 μM), 12,7 μl đệm giải trình tự 1X, μl PCR tinh Các mồi dùng cho giải trình tự P53g5F2-GGTTGCAGGAGGTGCTTACA, P53,56R -CACTGACAACCACCCTTAAC, P53seq7F – GGCCTCCCCTGCTTGCCACA, P53g8R – TGCTAGGAAAGAGGCAAGG Tồn sản phẩm PCR giải trình tự thu lại theo phương pháp kết tủa ethanol hòa tan tủa DNA dung dich TE hay nước cất Giải trình tự sản phẩm PCR Mỗi đoạn DNA khoảng 500-600bp giải trình tự chiều mồi xuôi mồi ngược máy ABI 3100 Genetic Analyser Kết giải trình tự đọc chương trình Sequencing Analysing v.2.5 Sau đó, dùng phần mềm SeqCap để so với trình tự chuẩn NC_000017.10 GenBank, xác định biến đổi nucleotid thuộc exon nào, codon nào, SNP hay đột biến, đột biến loại Các liệu đột biến tra cứu theo liệu IARC, liệu SNP gen p53 tra cứu hệ thống liệu NCBI Bảng Biểu protein p53 qua kết HMMD Protein p53 Số ca Tỉ lệ 1+ 23 23,0 2+ 8,0 3+ 26 26,0 Âm tính 43 43,0 Tổng cộng 100 100,0 Tỉ lệ khơng tích tụ protein p53 (âm tính) 43% tích tụ protein TP53 nhân 57%, tỷ lệ cao so với nghiên cứu khác Zellars cộng đánh giá biểu P53 1530 bệnh nhân carcinôm tuyến vú cho thấy tỷ lệ dương tính 51%(14) Nhiều nghiên cứu khác cho thấy tỉ lệ protein P53 (+) dao động khoảng từ 18% - 51% (Bảng 3), nguyên nhân giải thích chủ yếu do: khác biệt nhóm tuổi (trước sau mãn kinh), giai đoạn lâm sàng (có chưa di hạch), khác biệt độ nhạy kháng thể kỹ thuật hố-mơ-miễn dịch(10) Bảng So sánh tỷ lệ p53 (+) carcinôm tuyến vú với tác giả khác Tác giả Cỡ mẫu Tỉ lệ protein p53 (+)% (14) Zellar cộng 1530 51 (12) Sjogren cộng 315 20 (13) Thor cộng 994 33 Nghiên cứu 100 57 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát biến đổi trình tự gen p53 Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu Tỉ lệ đột biến gen p53 Bảng Tỉ lệ đột biến exon 5, 6, 7, gen p53 Tuổi Nghiên cứu khảo sát bệnh nhân ung thư vú từ 29 đến 74 tuổi, trung bình 40,5 (± 9,9) tuổi, tập trung chủ yếu độ tuổi từ 30-39, chiếm tỉ lệ 51% Bảng Tuổi bệnh nhân nhóm nghiên cứu Tuổi 20-29 30-39 40-49 50-59 60-69 ≥ 70 Số ca 51 29 5 Tỉ lệ % 8% 51% 29% 5% 5% 2% TC 100 100% Hóa mơ miễn dịch Biểu protein P53 qua kết HMMD 102 Đột biến gen p53 (exon 5-8) Khơng đột biến Có đột biến Tổng Số lượng 72 28 100 Tỉ lệ % 72 28 100 Bảng Tỉ lệ đột biến gen p53 nghiên cứu khác Số lượng đột biến Tỉ lệ đột biến 100 28 28% 2000 27 10 37% Alsner J 2000 315 74 25% (9) 2009 14482 3662 25,3% Nhóm nghiên cứu Năm Số mẫu Nghiên cứu 2010 (10) Jin-Woo Ryu (1) IARC Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Theo bảng 4, tỉ lệ gen p53 bị đột biến exon 5, 6, 7, chiếm tỉ lệ 28% Cho đến nay, người ta nhận thấy tần xuất xuất đột biến gen p53 tất loại ung thư 50%(6) Còn bệnh nhân ung thư vú, tần xuất đột biến gen p53 ghi nhận thay đổi từ 15 đến 71%(6,7,10) Sự khác biệt tần xuất phát đột biến nghiên cứu khác tùy thuộc vào việc tầm soát nhóm dân số nghiên cứu khác nhau, kỹ thuật khác nhau, hay việc giải trình tự tồn gen 53 hay nhắm vào vùng exon số đến exon số 8, nơi có tần suất đột biến cao nhất… Theo nhiều nghiên cứu, tỉ lệ đột biến gen p53 gặp khoảng 25-40% ung thu vú Tuy vậy, có nghiên cứu tìm thấy 2,7% đột biến gen p53 Theo tổng kết IARC (năm 2009)(9), tỉ lệ đột biến gen p53 gặp ung thư vú 25,3% (bảng 3-5), tương đồng với nghiên cứu chúng tơi Vị trí exon bị đột biến Bảng Đột biến exon – gen p53 Kết đột biến Exon 5-8 Số lượng Tỉ lệ % Exon 25 69,4% Exon 13,9% Exon 11,1% Exon 5,6% Theo bảng 6, tỉ lệ đột biến gen p53 exon 5, 6, 7, 69%, 14%, 11% 6% Tỉ lệ đột biến p53 exon xảy với tỷ lệ cao (69%) Nhiều tác giả cho đột biến gen p53 nằm chủ yếu exon 5, 6, 8, tỷ lệ chiếm từ 80 đến 95% Đây vùng có tính bảo tồn cao, vùng chức nơi protein điều hòa hoạt động gen bám vào vùng bám DNA protein P53 Chính nghiên cứu này, kinh phí có hạn, chúng tơi tập trung tìm đột biến gen p53 exon 5-8 mẫu mơ vùi nến có kết giải phẫu bệnh carcinôm tuyến vú Tuy nhiên, theo Osborne R.J, tỷ lệ đột biến exon dường cao so với exon khác vùng bảo tồn hay theo Ryu J.W(10), tỷ lệ Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Nghiên cứu Y học đột biến gen p53 lại gặp exon nhiều (70%) nghiên cứu mẫu ung thư vú phụ nữ Hàn Quốc Về vị trí codon bị đột biến Vị trí acid amin đột biến thường gặp Cys 135, Arg158, Tyr163, Asn239 với tỷ lệ 11%, 14%, 14%, 6% Các vị trí acid amin đột biến thường gặp (hotspots) hay nằm vùng DNA dễ bị tổn thương (như vị trí cặp nucleotide CpG) mã di truyền mã hóa cho acid amin chủ chốt vùng thực chức sinh học protein, hai Phân bố đột biến codon gen p53 carcinơm tuyến vú vị trí thường gặp tương tự với loại ung thư khác Theo Cho(5), vị trí hotspots Arg175, Gly245, Arg248, Arg249, Arg273, Arg282 tất dạng ung thư Tuy nhiên, theo Feki(7) đột biến codon 163 (TAC thành TGC) chiếm khoảng 2% carcinôm tuyến vú, đột biến codon ung thư khác chiếm khoảng 1% Ngoài ngoại lệ này, nghiên cứu toàn cầu cho thấy khác biệt đột biến gen p53 carcinôm tuyến vú ung thư khác ý nghĩa Trong nghiên cứu này, đột biến Arg 175 gặp với tỷ lệ 5,6% Theo Hamroun(7), đột biến Arg175 đột biến thường gặp 90% đột biến dạng Arg175 His, đột biến nghiên cứu chúng tơi rơi vào vị trí 175, từ Arg biến đổi thành Cys (2,8%) Prolin (2,8%) Đột biến có tính chọn lọc cao bệnh ung thư người, protein P53 có chức cần thiết gấp xoắn vùng liên kết DNA đồng thời có khả đột biến cao dinucleotid CpG methyl hoá codon (CGA)(14) Ngồi ra, chúng tơi khơng gặp đột biến thường gặp khác tác giả nêu trên, nhiên điều lưu ý có đột biến 163 (Tyr (TAC) thành Cys (TGC)) chiếm 103 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 tỷ lệ 14%, trường đột có đột biến Tyr 163 có trường hợp đột biến kèm với đột biến Cys 135 Tyr Ngồi ra, có trường hợp có đột biến Arg158 (tỷ lệ 14%), liệu chúng có phải đột biến thường gặp bệnh nhân carcinôm tuyến vú tiên phát người Việt Nam Tương tự nghiên cứu Coles C 136 bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú với 41 trường hợp có đột biến p53, tác giả nhận thấy khơng có đột biến gọi đột biến thường gặp số tác giả khác nêu Như vậy, tỷ lệ đột biến quần thể khác liệu có phân bố đột biến gen p53 khác nhau? Số lượng đột biến mẫu bệnh phẩm Bảng Số lượng đột biến mẫu bệnh phẩm đột biến/1 mẫu đột biến/1 mẫu 20 71% Số mẫu Tì lệ % exon exon (21%) (8%) 29% Tổng 28 100% Theo Bảng số mẫu bệnh phẩm vùi nến bệnh nhân carcinôm tuyến vú mang đột biến chiếm tỷ lệ 71%, mang đột biến chiếm 29% (trong đột biến exon chiếm 21% đột biến exon chiếm 8%) Andersson(2) tìm thấy có 4,8% khối u có chí loại đột biến khác nhau, vừa đột biến điểm nhầm nghĩa vừa đột biến nucleotid thêm nucleotid Các kiểu đột biến gen p53 Bảng Phân loại kiểu đột biến theo vị trí exon gen p53 Các dạng biến đổi Đột biến thay Nhầm nghĩa Vô nghĩa Đột biến dịch khung Mất Thêm Đột biến điểm Tại A Tại T Tại G Tại C Đồng hoán A→G G→A C→T T→C Dị hoán A→T G→T G→C T→G Khác Vị trí Nu đột biến codon Vùng CpG Trong Ngồi Vùng trình tự bị đột biến Bảo tồn 104 Exon 24 24 1 25 10 17 4 1 25 21 24 16 Exon 4 1 1 0 1 5 Exon 4 0 0 4 0 0 0 0 4 Exon 1 0 2 0 0 1 0 2 2 Số lượng 34/36 33/36 1/36 2/36 1/36 1/36 36/36 8/36 9/36 14/36 5/36 25/36 6 9/36 1 2/36 36/36 9/36 27/36 36/36 9/36 27/36 Tỉ lệ % 94,4 91,6 2,8 5,6 2,8 2,8 100% 22,2% 25,0% 38,9% 13,9% 69,4% 25% 16,7% 11,1% 16,7% 25% 2,8% 16,7% 2,8% 2,8% 5,6% 100.0% 25% 75% 100% 25% 75% 12/36 33,3% Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Các dạng biến đổi Không bảo tồn Exon 16 Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến thay gồm đột biến nhầm nghĩa 91,6% đột biến vô nghĩa chiếm 2,8% so với tỷ lệ đột biến dịch khung 5,6% Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa phụ nữ bị ung thư vú Nhật Bản chiếm 93% Theo liệu IARC, tỷ lệ loại đột biến nhầm nghĩa, vô nghĩa, dịch khung 73,6%, 7,67% 8,85% Số liệu nghiên cứu có khác với số liệu IARC (2009) phạm vi nghiên cứu đề tài giới hạn vùng exon 5-8 gen p53, ngược lại, liệu đột biến IARC tổng hợp nghiên cứu toàn gen p53, vùng exon intron Tuy có nhiều tác giả đề cập nghiên cứu họ có khoảng >60% đột biến nhầm nghĩa Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến điểm exon 5-8 gen p53 chiếm đến 100% Theo nghiên cứu Catalin M.(4), 803 mẫu mô khối u carcinôm tuyến vú, tỷ lệ đột biến điểm gen p53 bị đột biến 95% Trong nghiên cứu Coles C(6), tỷ lệ đột biến gen p53 89% Nghiên cứu chúng tơi có tỷ lệ đột biến điểm cao tác giả khác, có lẽ tập trung giải trình tự vùng exon 5-8 Trong loại đột biến điểm, tỷ lệ đột biến G cao nhất, chiếm 39% so với thành phần khác Tuy nhiên tỷ lệ đột biến G C tương đồng với tỷ lệ đột biến A T Đột biến đồng hốn chiếm tỷ lệ 69,4% so với đột biến dị hốn chiếm 25% Trong đó, tỷ lệ đột biến đồng hoán AG cao chiếm 25%, ung thư đại-trực tràng tỷ lệ đồng hoán G A chiếm 36% Trong tỷ lệ đột biến dị hoán, tỷ lệ GT cao 16,7% so với ung thư đại –trực tràng 10% Điều khác biệt so với nhận xét Feki A(7) đột biến carcinôm tuyến vú Theo nghiên cứu Sasa(11), đột biến đồng hoán, tỷ lệ GA lại chiếm đa số (53%), khơng có đột biến dị hoán GT 62 trường hợp phụ nữ Nhật bị ung thư ống tuyến vú Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Exon Exon Nghiên cứu Y học Exon Số lượng 24/36 Tỉ lệ % 66,7% Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy vùng CpG carcinôm tuyến vú chiếm tỷ lệ 25%, khác biệt so với carcinôm tuyến đại trực tràng, tỷ lệ đột biến vùng CpG 58% Vị trí nucleotid bị đột biến Cũng theo Bảng 8, tỷ lệ nucleotid bị đột biến vị trí thứ thứ codon 25% 75% Trong mã di truyền, vị trí nucleotid thứ thứ hai có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp protein Vì vậy, đột biến xảy vị trí thứ hay thứ codon, có nhiều khả làm thay đổi thành phần cấu trúc protein, phù hợp với tỷ lệ đột biến nhầm nghĩa chiếm 94% Vùng trình tự bị đột biến Trong Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy vùng trình tự bảo tồn 33% ngồi vùng trình tự bảo tồn 67% Đột biến vùng trình tự bảo tồn thứ tự vùng II (16,7%), vùng III (8,3%) vùng IV (8,3%) Số liệu khác biệt so với nghiên cứu Coles C (6), 68% đột biến nằm vùng bảo tồn, thứ tự vùng II (8%), vùng III (12%), vùng IV (23%) vùng V (25%) Sự biến đổi protein P53 Acid amin bị biến đổi Theo Bảng 8, codon mã hóa acid amin Arg bị đột biến nhiều nhất, chiếm tỷ lệ 22% tổng số đột biến, sau codon mã hóa Cys 18% Tyr 14%, loại codon mã hóa cho acid amin khác có tỷ lệ đột biến khơng 9% Nhóm acid amin bị đột biến Theo Bảng 8, thay đổi acid amin nhóm, khác nhóm acid amin protein P53 25,0%, 69,0% 6,0%, acid amin thành phần cốt lõi protein, thay đổi acid amin protein ảnh hưởng đến cấu trúc chức protein Vùng protein chức bị đột biến Theo Bảng 8, tỷ lệ đột biến xảy vùng chức 53%, bao gồm vùng L1/S2-S2’ β, L2 L3 tương ứng 17%, 28% 8% Đây 105 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 vùng protein P53 liên kết với DNA phân tử Zn Tuy nhiên nghiên cứu này, khơng có acid amin gắn trực tiếp với DNA hay Zn bị đột biến Sự tương đồng đột biến gen p53 biểu mức P53 Bảng Sự tương đồng đột biến gen p53 biểu mức protein P53 SEQ HMMD Dương tính Âm tính Tổng Có đột biến Khơng đột biến Tổng p53 p53 19 (19%) 38 (38%) 57 (9%) 34 (34%) 43 28 (28%) 72 (72%) 100 (100%) Theo Bảng 9, tương đồng đột biến gen p53 với vượt mức biểu protein p53 bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú 19% Tỉ lệ mẫu có XN HMMD (+), có đột biến gen p53 19% tỉ lệ mẫu có XN HMMD (-), khơng có đột biến p53 34%, vậy, hai phương pháp phát biểu protein p53 biến đổi trình tự gen p53 có kết tương đồng 53% Như vậy, 33 % số mẫu có XN HMMD (+) có biến đổi trình tự gen p53 (19/57) ngược lại 68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD (+) (19/28) Có trường hợp đột biến kiểu dịch khung (do hay thêm nucleotide) có XN hóa mơ miễn dịch (-), tương tự nghiên cứu Askmalm S M(3), Williams C.(14) Askmalm S M nhận thấy 83% mẫu có đột biến gen p53 XN HMMD (+), có 61% khối u có XN HMMD (+) có đột biến gen p53 Điều chứng tỏ tình trạng biểu vượt mức protein p53 hóa mơ miễn dịch không tương đồng cao với kiểu gen p53 đột biến Theo số liệu bảng 9, số mẫu phát có mang đột biến gen p53 lại khơng có biểu vượt mức protein p53 chiếm 9,0%, trường hợp giải thích nhiều giả thiết số đột biến gen tạo protein ngắn nên không IHC phát hiện, hay gen p53 có đột biến vùng exon 5-8 đồng thời có biến đổi vùng khác làm cho protein p53 không biểu tế bào… 106 Tương tự, số mẫu phát có biểu vượt mức protein p53 lại khơng có đột biến gen p53 vùng exon 5-8 chiếm 36% Nguyên nhân tượng có đột biến nằm ngồi vùng exon 5-8, có biến đổi yếu tố kiểm sốt q trình biểu protein P53… Liên quan biểu protein P53 đột biến gen p53 với đặc điểm carcinơm tuyến vú nhóm tuổi, loại mơ học, độ mơ học, tình trạng hạch khơng có khác biệt KẾT LUẬN Qua nghiên cứu này, nhận thấy mẫu mơ bệnh nhân chẩn đốn carcinơm tuyến vú, tỷ lệ biểu tích tụ protein P53 nhân tế bào carcinôm vú 57% Gen p53 (exon - exon 8) phân tích phương pháp giải trình tự gen phát đột biến tỉ lệ đột biến gen p53 28%, đột biến xảy exon chiếm tỉ lệ cao (69,4%) Đột biến nhầm nghĩa chiếm tỉ lệ 91,6% Đột biến xảy chủ yếu vị trí thứ 1và thứ (100%) mã di truyền 33% đột biến xảy vùng trình tự bảo tồn gen 25% đột biến xảy vùng CpG Đột biến xảy codon 175 chiếm 5,6% Đột biến Tyr163Cys chiếm 14% Đột biến xảy cao vùng L2/L3 (36%) L1/S/H2 (17%) Sự tương đồng đột biến gen p53 với mức biểu protein P53 bệnh nhân bị carcinôm tuyến vú 19% Tỉ lệ tương đồng biểu protein p53 tình trạng đột biến gen p53 53% 33 % số mẫu có XN HMMD (+) có biến đổi trình tự gen p53 68% số mẫu có biến đổi gen p53 có XN HMMD (+) TÀI LIỆU THAM KHẢO Alsner J., et al., (2000),"Heterogeneity in the clinical phenotype of TP53 mutations in breast cancer patients" Clinical Cancer Reseach, 6: p 3923-3931 Andersson J, Larsson L, Klaar S, Holmberg L, Nilsson J, Inganäs M, Carlsson G, Ohd J, Rudenstam CM, Gustavsson B, Bergh J (2005): Worse survival for TP53 (p53)-mutated breast cancer patients receiving adjuvant CMF Ann Oncol 2005 May;16(5):743-8 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 10 Askmalm M.S., et al., (2004),"Mutation and accumulation of p53 related to results of adjuvant therapy of postmenopausal breast cancer patients" Acta Oncologica, 43-43 Catalin M, (2009) "Large study documents how P53 mutations link to high-grade breast cancer, poor outcomes" PHYSORG: p www.physorg.com/news159374125.html Cho Y., Gorina S., et al (1994), “Crystal structure of a p53 tumor suppressor-DNA complex: understanding tumorigenic mutations”, Science 265, pp 346-355 Coles C., Condie A., (1992), “p53 Mutations in Breast Cancer”, Cancer Res, 52; 5291-92 Feki A and Irminger-Finger I., (2004),"Mutational spectrum of p53 mutations in primary breast and ovarian tumors" Critical Reviews in Oncology/Hematology, 52: p 103-116 Hamroun D and Kato S., (2006),"The UMD TP53 Database and Website: Update and Revisions" Human mutation, 27(1): p 1420 http://www-p53.iarc.fr/ Ryu J.W., Lee M.C., and J WC, (2000),"Detecting p53 gene mutation of breast cancer and defining differences between Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 11 12 13 14 15 Nghiên cứu Y học silver staining PCR-SSCP and immunohistochemical staining." J Korean Medical Sciences, 15(1): p 73-77 Sasa M., et al., (1994),"P53 alteration correlates with negative ER, negative PGR, and high histologic grade in breast cancer" Journal of Surgical Oncology, 56 (1): p 46-50 Sjogren S., Inganas M., Lindren A., Holmberg L., Bergh J., (1998), “Prognostic and predictive value of c-erbB-2 overexpression in primary breast cancer, alone and in combination with other prognostic markers”, Journal of Clinical Oncology, 16, pp 462-469 Thor A.D., Moore D.H., et al (1992), “Accumulation of p53 Tumor Suppressor gene protein: An independent marker of prognosis in breast cancer”, Journal of the National Cancer Institute, 84, pp 845-855 Williams C., et al., (1998),"Assessment of sequence-based p53 gene analysis in human breast cancer: messenger RNA in comparison with genomic DNA targets", Clinical Chemistry, 44(3): p 455-462 Zellars R.C., Hilsenbecck S.G., and et al (2000), “Prognostic value of p53 for local failure in mastectomy-treated breast cancer patients”, Journal of Clinical Oncology, 18, pp.1906-1913 107 ... QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát biến đổi trình tự gen p53 Đặc điểm chung mẫu nghiên cứu Tỉ lệ đột biến gen p53 Bảng Tỉ lệ đột biến exon 5, 6, 7, gen p53 Tuổi Nghiên cứu khảo sát bệnh nhân ung thư vú. .. lệ gen p53 bị đột biến exon 5, 6, 7, chiếm tỉ lệ 28% Cho đến nay, người ta nhận thấy tần xuất xuất đột biến gen p53 tất loại ung thư 50%(6) Còn bệnh nhân ung thư vú, tần xuất đột biến gen p53. .. đột biến gen p53 giải trình tự gen p53 hóa mơ miễn dịch (IHC) xem xét biểu protein p53 Trong phạm vi đề tài này, chúng tơi thực giải trình tự gen p53 từ exon 5-8 vùng tập trung tỉ lệ đột biến cao