Đối chiếu kết quả giữa phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch đặc hiệu và phương pháp giải trình tự gen EGFR trong ung thư phổi không tế bào nhỏ

Phương pháp nhuộm HMMD protein EGFR đặc hiệu mất đoạn E746-A750 và đột biến điểm L858R có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho việc xác định EGFR đột biến và là phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay cho việc phát hiện EGFR đột biến có ý nghĩa cho việc điều trị nhắm đích.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học ĐỐI CHIẾU KẾT QUẢ GIỮA PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HĨA MƠ MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP GIẢI TRÌNH TỰ GEN EGFR TRONG UNG THƯ PHỔI KHƠNG TẾ BÀO NHỎ Ngơ Thị Tuyết Hạnh*; Hoàng Anh Vũ**, Hứa Thị Ngọc Hà*, Đặng Hồng Minh*, Nguyễn Sào Trung* TĨM TẮT Giới thiệu: Ngày tỉ lệ ung thư phổi ngày tăng cao nên việc phân tích đột biến gen EGFR ung thư phổi cần thiết bệnh nhân có đột biến gen EGFR ung thư phổi khơng tế bào nhỏ (UTPKTBN) gắn với tiên lượng xấu có khả đáp ứng tốt với thuốc nhắm trúng đích phân tử ức chế miền tyrosine kinase (erlotinib, gefitinib) Nhuộm HMMD với kháng thể đặc hiệu EGFR đoạn E746 –A750 exon 19 đột biến điểm L858R exon 21 đồng thời với phương pháp giải trình tự gen nhằm đối chiếu kết hai phương pháp nhằm xác định phương pháp nhuộm HMMD đặc hiệu có phải phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay cho việc phát EGFR đột biến Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 70 bệnh nhân UTPKTBN giải trình tự gen EGFR máy ABI 3130 Genetic Analyzer TT Y sinh học phân tử – Đại học Y Dược TPHCM Các trường hợp nhuộm HMMD máy Benchmark, với kháng thể kháng protein EGFR đặc hiệu (kháng thể đặc hiệu đoạn E746 –A750 exon 19 đột biến điểm L858R exon 21) tính dựa vào cường độ bắt màu màng bào tương với điểm cắt 10% tế bào u sau: (0) không nhuộm màng nhuộm cường độ mờ nhạt < 10% tế bào u; (1+): cường độ nhuộm mờ nhạt > 10% tế bào u; (2+): cường độ nhuộm trung bình; (3+): Cường độ nhuộm mạnh Các trường hợp coi dương tính: 1+; 2+; 3+ Các trường hợp âm tính: điểm Đối chiếu kết HMMD đặc hiệu với kết giải trình tự gen Kết quả: có 17 trường hợp có biểu protein E746-A750 (24,3%), có 18 trường hợp có biểu protein L858R (25,7%), có 34 trường hợp có đột biến EGFR (48,6%) có trường hợp đột biến exon 18, 20 trường hợp đột biến exon 19 (28,6%); trường hợp đột biến exon 20 14 đột biến exon 21 (20%) Có trường hợp mang lúc đột biến gen exon 19 21 Có liên quan có ý nghĩa thống kê phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch đặc hiệu phương pháp giải trình tự đột biến gen EGFR (p = 0,001 p = 0,004) Kết luận: Phương pháp nhuộm HMMD protein EGFR đặc hiệu đoạn E746-A750 đột biến điểm L858R có độ nhạy độ đặc hiệu cao cho việc xác định EGFR đột biến phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay cho việc phát EGFR đột biến có ý nghĩa cho việc điều trị nhắm đích Từ khóa: Hóa mơ miễn dịch, EGFR đặc hiệu, giải trình tự gen EGFR, ung thư phổi không tế bào nhỏ ABSTRACT COMPARISON OF SPECIFIC IMMUNOHISTOCHEMISTRY STAINING MOTHOD WITH SEQUENCING OF EGFR MUTATION IN PATIENTS WITH NON-SMALL CELL LUNG CANCER Ngo Thi Tuyet Hanh, Hoang Anh Vu, Hua Thi Ngoc Ha, Dang Hoang Minh, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 19 - No - 2015: 91 - 96 Background: Currently, the percentage of lung cancer cases is increasing Therefore, the analysis of EGFR mutations in lung cancer is necessary for patients with EGFR mutations in non-small cell lung cancer (NSCLC) associating with poor prognosis and are likely to respond well to drugs targeting molecules on targeted tyrosine ** TT Sinh Học Phân tử, Đại học Y Dược TP.HCM * Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, Đại học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS Ngô Thị Tuyết Hạnh ĐT: 0918181722 Email: tuyethanhngo72@gmail.com 91 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 kinase domain inhibitors (erlotinib, gefitinib) Immunohistochemistry (IHC) staining with EGFR specific antibodies deletion E746-A750 in exon 19 and point mutation L858R in exon 21 was tested in conjunction with sequencing method to compare the results between two methods, and to determine the usefulness of IHC specific methods prior to detect EGFR mutations Methods: 70 NSCLC patients were sequenced EGFR gene by ABI 10 Genetic Analyer in Center for Molecular Biomedicine, Ho Chi Minh City Medicine and Pharmacy University These cases also had been dyed IHC by Benchmark with antibodies against EGFR specific protein (deletion specific antibodies in exon 19 E746A750 and L585R point mutations in exon 21), and calculated based on the intensive staining of cytoplasmic membrane with 10% cutoff point of tumor cells as follows: 0: no staining is observed, or membrane staining < 10% of tumor cells; 1+: a faint/barely perceptible membrane staining > 10% of tumor cells; 2+: a weak to moderate complete membrane staining; 3+: a strong complete membrane staining; The cases were considered postitive: 1+; 2+; 3+; Negative cases: 0; The results of specific IHC and gene sequencing were compared Results: Seventeen cases had protein expression E746-A750 (24.3%), 18 cases had L858R protein expression (25.7%) There were 34 cases of EGFR mutations (48.6%), in which case in exon 18, 20 cases in exon 19 (28.6%); case in exon 20, and 14 cases in exon 21 Two cases had mutations in both exon 19 and 21 There was a statistically significant between specific IHC method and mutation sequencing of EGFR (p 10% tế bào u 2+: cường độ nhuộm trung bình 3+: Cường độ nhuộm mạnh Các trường hợp coi dương tính: 1+; 2+; 3+ Các trường hợp âm tính: Đối chiếu kết nhuộm HMMD đặc hiệu với kết giải trình tự gen EGFR Các số liệu xử lý thống kê phần mềm stata 10 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tuổi giới Bao gồm 39 bệnh nhân nam 31 nữ, tỉ lệ nam/nữ 1,3/1 94 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Tuổi trung bình bệnh nhân 60 (± 12,2), (khoảng tuổi 18 - 85) Mô bệnh học Đa số bệnh nhân chẩn đốn carcinơm tuyến 88,6% với giai đoạn xâm lấn di Các dạng mô bệnh học khác 11,4% (bao gồm carcinôm tế bào lớn (8,6%) carcinôm gai – tuyến (2,8%) Kết nhuộm hóa mơ miễn dịch Trong tổng số 70 đối tượng nghiên cứu, có 17 bệnh nhân có biểu protein EGFR dương E746- A750 (24,3%), có 53 bệnh nhân biểu protein EGFR âm tính E746 - A750 (75,7%) Có 18 bệnh nhân có biểu dương tính với L858R chiếm (25,7%) có 52 bệnh nhân có biểu âm tính với L858R chiếm (75,7%) Có trường hợp biểu protein EGFR dương tính với E746-A750 L858R Các nghiên cứu trước cho thấy phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch phương pháp nhằm phát protein EGFR phương pháp đầu tay trước giải trình tự chuỗi DNA phương pháp đơn giản rẻ tiền(15,4,2) Tuy nhiên gần có số nghiên cứu cho thấy phương pháp nhuộm HMMD với kháng thể đặc hiệu EGFR đoạn E746- A750 đột biến điểm L858R có độ nhạy độ đặc hiệu cao phương pháp sàng lọc hữu ích đầu tay cho việc phát EGFR đột biến, có ý nghĩa cho việc điều trị nhắm đích Đột biến gen EGFR Các nghiên cứu trước cho thấy đột biến EGFR ung thư phổi tập trung exon 18 – 21 Chúng sử dụng kỹ thuật giải trình tự DNA để khảo sát exon cho 70 bệnh nhân, phát 34 trường hợp có đột biến EGFR (48,6%) Trong 62 trường hợp carcinôm tuyến có 31 trường hợp có đột biến EGFR, chiếm 50%; loại mô học khác mang đột biến với tỉ lệ thấp 37,5 % Trong đột biến phát hiện, đột biến exon 19 chiếm tỉ lệ cao 20 trường hợp (28,6%), exon 21 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 chiếm 14 trường hợp (20%) Exon 18 20 bị đột biến trường hợp (1,4%), có trường Nghiên cứu Y học hợp có đột biến cho hai exon 19 21 Tương quan đột biến gen đặc điểm giải phẫu bệnh Bảng 1: Tương quan đột biến gen với đặc điểm giải phẫu bệnh Đặc điểm Giới tính Tuổi Loại mơ học Nam Nữ ≤60 >60 Carcinơm tuyến Khác * Giải trình tự gen EGFR Bình thường (n = 36) Đột biến (n = 34) 26 13 10 21 20 18 16 16 31 31 OR (95% CI) P 4,2 (1,4 -13,0) 0,004 1,1 (0,4-3,2) 0,826 0,6 (0,1-3,4) 0,057 *Bao gồm carcinôm gai – tuyến carcinôm tế bào lớn Chúng thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến gen EGFR với giới tính (p = 0,004) Bệnh nhân nữ có đột biến cao gấp 4,2 lần bệnh nhân nam Trong nghiên cứu khác giới, đột biến gặp loại carcinơm tuyến, tìm thấy carcinơm gai – tuyến (9) (14), nghiên cứu khơng có trường hợp carcinơm gai - tuyến mang gen đột biến Hơn nữa, đột biến thường tìm thấy bệnh nhân nữ so với bệnh nhân nam(13) Khơng thấy có liên quan có ý nghĩa thống kê đột biến gen với độ mô học tuổi bệnh nhân Tương quan nhuộm HMMD đặc hiệu với đặc điểm giải phẫu bệnh Bảng 2: Tương quan kết nhuộm HMMD đặc hiệu với đặc điểm giải phẫu bệnh Đặc điểm Giới Tuổi Loại mô học Nam Nữ ≤ 60 > 60 Carcinôm tuyến Khác* Biểu protein EGFR Âm tính (n = 38) Dương tính (n = 32) 27 12 11 20 22 16 16 16 34 28 4 OR (95% CI) P 4,1 (1,4-12,6) 0,005 1,4 (0,5-3,9) 0,509 1,2 (0,2-7,1) 0,796 *: Carcinôm gai tuyến carcinôm tế bào lớn Kết nghiên cứu gợi ý có mối liên quan có ý nghĩa thống kê nhuộm HMMD đặc hiệu với giới tính Bệnh nhân nữ có HMMD đặc hiệu dương tính cao gấp 4,1 lần bệnh nhân nam (OR=4,1; 95% CI: 1,4-12,6) Khơng thấy có liên quan có ý nghĩa thống kê nhuộm HMMD với tuổi loại mô học bệnh nhân Tương quan nhuộm HMMD E746 – A750 L858R với đột biến gen EGFR Những trường hợp biểu protein EGFR dương tính E746-A750 có đột biến gen EGFR cao gấp 31,1 lần trường hợp có biểu protein EGFR âm tính (p= 0,001) Những trường hợp biểu protein EGFR dương tính L858R có đột biến gen EGFR cao gấp 5,6 lần trường hợp có biểu protein EGFR âm tính (p= 0,001) Kháng thể E746-A750: độ nhạy = 80%, đặc hiệu = 98% Kháng thể L858R: độ nhạy = 78,6% đặc hiệu = 85,7% Chung kháng thể: độ nhạy = 79,4% đặc hiệu = 86,1% Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp nhuộm HHMD gen EGFR đặc hiệu E746-A750 L858R cao có hai loại đột biến EGFR (hai loại chiếm 90%) đánh giá HMMD loại đột biến khác với tần số thấp khơng kiểm tra 95 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học HMMD chưa có kháng thể đột biến đặc hiệu (chưa sản xuất) Vì ung thư phổi với đột biến EGFR qua kiểm tra HMMD âm tính nên tiếp tục làm thêm phương pháp giải trình tự gen Bảng 3: Tương quan kết nhuộm HMMD với đột biến gen Đặc điểm EGFR Bình thường Đột biến E746 - A750 Âm tính Dương tính L858R Âm tính Dương tính Chung KT Âm tính Dương tính OR (95% CI) P 49 (a) (b) (c) 16 (d) 196