Biến thế Ebnai ở bệnh nhân ung thư vòm múi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở người Việt Nam bình thường docx

TCNCYH 25 (5) - 2003 Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở ngời Việt Nam bình thờng Nguyễn Văn Đô 1 , Trần Thị Chính 1 , Phan Thị Phi Phi 1 , Ingemar Ernberg 2 , Li Fu Hu 2 1 Bộ môn Miễn dịch - Sinh lý bệnh trởng đại học Y Hà Nội 2 MTC, Viện Karolinska, Stockholm, Thuỵ Điển EBNA (EBV - nuclear antigen1) là một protein duy nhất đợc biểu lộ ở tất cả các tế bào bị nhiễm virut Epstein - Barr. Biến thể của EBNA1 đã đợc định nghĩa dựa vào acid amin ở vị trí thuộc mã bộ ba 487 của DNA và bao gồm các dới nhóm là P (prototype): P- ala (B95 -8) và P- thr; V (variant): V - val, V - leu và V - pro. Chúng tôi đã phân tích trình tự DNA ở đầu cacboxy của EBNA1 từ sản phẩm PCR. Các mẫu DNA cho kỹ thuật PCR đợc chiết tách từ khối u vòm họng và máu ngoại vi của bệnh nhân ung th vòm họng ngời Việt Nam và Trung Quốc, thể biểu mô không biệt hoá; máu ngoại vi của ngời cho máu Việt Nam. Kết quả cho thấy EBNA1 ở ngời bình thờng và bệnh nhân ung th vòm mũi họng có các đột biến điểm dẫn đến thay đổi các acid amin và các biến thể này thuộc dới nhóm của V - val: V - val - v1 (9/10 cặp mẫu và 5 ngời bình thờng) và V - val - v2 (1/10 cặp mẫu). Trong số 15 cặp mẫu của bệnh nhân ung th vòm họng ngời Trung Quốc, ở khối u có dới nhóm là V - val - v1 (15/15), còn máu ngoại vi chỉ có 2 mẫu (2/15) là P - ala và một mẫu nghi ngờ có cả P - ala và V- val - 1. I. Đặt vấn đề Virút Epstein - Barr (EBV), một virut thuộc nhóm herpes, đợc lây nhiễm ở hầu hết các quần thể dân c trên thế giới. Sự tồn tại của virut trong cơ thể bị nhiễm có hai dạng là thể dung giải và thể tiềm ẩn. Khởi đầu của chu kỳ dung giải là sự xâm nhập của các virut vào liên bào lympho B ở vòm họng nhờ các rêxepơ thích hợp. Virut đợc nhân lên trong tế bào và tạo ra các hạt virut. Các hạt virut này lại đợc giải phóng ra và lây nhiễm sang các tế bào lành khác hoặc các cơ thể khác qua con đờng nớc bọt. Thể nhiễm tiềm ẩn xuất hiện sau khi nhiễm dung giải ở các cơ thể bị nhiễm. Thể này gồm các hình thái I, II, III và sự biểu lộ gen của EBV khác nhau tuỳ theo hình thái nhiễm, ở các bệnh khác nhau. ở thể nhiễm tiềm ẩn I chỉ có EBER và EBNA1, hình thái II có thêm các gen khác biểu lộ nh LMP1, LMP2 và hình thái III tất cả các gen của hình thái I và II và thêm EBNA2 - 6 biểu lộ. EBV là nguyên nhân gây ra bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và là virut có liên quan đến một số bệnh lý ác tính ở ngời nh u lympho Burkitt (BL) [1], ung th vòm mũi họng (UTVMH) [2,3]. EBNA1 là một protein của EBV đợc biểu lộ ở tất cả các thể nhiễm tiềm ẩn trong tế bào nhiễm EBV. Nó có vai trò rất quan trọng là yếu tố hệ thống các gen khởi động của EBV giúp cho quá trình sao chép ADN và phân chia của EBV để duy trì sự tồn tại của EBV trong tế bào, đồng thời điều hoà sự biểu lộ của chính EBNA1 và các gen khác của thể nhiễm tiềm ẩn nh EBNA 2 - 6, LMP1,2. Trình tự gen của EBV thuộc dòng tế bào B95 -8 đã đợc phân tích hoàn chỉnh và cấu trúc của gen EBNA1 liên quan đến các chức năng của nó đã đợc nghiên cứu và làm sáng tỏ. Một số tác giả đã phát hiện thấy các đột biến điểm của gen EBNA1 dẫn đến sự thay đổi 23 TCNCYH 25 (5) - 2003 các acid amin trong chuỗi protein ở các chủng EBV từ các vùng địa lý khác nhau trên thế giới và từ những bệnh lý khác nhau có liên quan. Các công trình nghiên cứu đều cho thấy các đột biến thờng xảy ra ở vùng có chức năng gắn DNA thuộc đầu cocboxy của EBNA1 [4,5]. Bhatia và cộng sự 1996 cũng đã phân tích trình tự gen EBNA1 của EBV thuộc dòng B95 - 8 so sánh với một số chủng EBV khác và đã phân loại EBNA1 thành 5 dới nhóm khác nhau, đó là P - ala, P - thr, V - pro, V - leu và V - val (P là prototype thuộc chủng B95 - 8, còn V là variant). ở Việt Nam cha có công trình nào nghiên cứu về phân tích trình tự gen và phát hiện đột biến gen EBNA1 của EBV. Mục tiêu của công trình này là: 1. Phân tích trình tự gen EBNA1 ở đầu tận cacboxy của DNA, tách chiết từ mô sinh thiết ung th vòm mũi họng (UTVMH) và máu ngoại vi ngời khỏe mạnh. 2. So sánh trình tự gen EBNA1 của bệnh nhân UTVMH Việt Nam với trình tự gen này ở bệnh nhân UTVMH Trung Quốc với gen EBNA của chủng B95 - 8 châu Âu và của máu của ngời khoẻ mạnh Việt Nam. II. Đối tợng và phơng pháp nghiên cứu 1. Đối tợng 1.1. Bệnh nhân ung th vòm mũi họng DNA đợc chiết tách từ 10 cặp mẫu gồm sinh thiết khối u vòm họng đợc chẩn đoán xác định bằng giải phẫu bệnh lý là ung th biểu mô không biệt hoá và máu của mỗi bệnh nhân tơng ứng. Các bệnh nhân này đợc chẩn đoán và điều trị tại bệnh viện K Hà Nội. 15 cặp mẫu bệnh nhân ung th vòm họng thể biểu mô không biệt hoá đợc lấy từ Quảng Đông, Trung Quốc. 1.2. Ngời bình thờng DNA đợc chiết tách từ 5 mẫu máu lấy từ ngời cho máu tại Viện Huyết học và Truyền máu Trung ơng. 2. Phơng pháp nghiên cứu 2.1. Chiết tách DNA 2.1.1. Chiết tách DNA từ máu toàn phần 5ml máu đợc chống đông bằng EDTA bảo quản trong vòng 24 giờ ở nhiệt độ 4 0 C. Cho 10ml dung dịch phá hồng cầu (1mM NH 4 HCO 3 115mM NH 4 Cl) vào falcon 15ml đã đựng sẵn máu chống đông, lắc đều và ly tâm 1200g x 10 phút. Loại bỏ dịch và giữ lại phần cặn. Làm tan cặn và cho 10ml dung dịch phá hồng cầu lần 2, ly tâm lấy cặn nh trên. Cho 1,8ml dung dịch phá bạch cầu (100mM tris - C1, pH 7,6; 40mM EDTA, pH 8.0; 50mM NaCl; 0,2% SDS; 0,05% sodium azide) vào cặn bạch cầu thu đợc và lắc mạnh theo chiều dọc ống nghiệm để làm tan hết các bạch cầu, dung dịch trở nên đặc và nhầy. Cho 10àl proteinase K nồng độ 20mg/mL vào bạch cầu đã đợc làm tan và ủ ở 50 0 C, 2 giờ có lắc theo chu kỳ. Thêm 600àl NaCl 6M, lắc 10 phút và ly tâm 1200 vòng/ phút x 5 phút, loại bỏ nớc nổi. Cho 5ml cồn 70 0 vào cặn DNA, ly tâm 1200 vòng/ phút x 5 phút. Làm khô DNA ở nhiệt độ phòng và hoà tan trong 400àl - 500àl TE. 2.1.2. Chiết tách DNA từ mô sinh thiết tơi Cho 560àl dung dịch phá huỷ tế bào (0,6% SDS; 10mM EDTA; 10mM Tris, pH 7,5; 200àg/ml RNaseA) vào cối nghiền thủy tinh vô trùng đựng sẵn mẫu sinh thiết tơi. Nghiền cho đến khi mẫu sinh thiết tan hoàn toàn sau đó ủ 60 0 C x 1 giờ. Cho 15àl proteinase K (20mg/ml), tiếp tục ủ 60 0 C từ 1 - 1,5 giờ. Thêm 640àl dung dịch phenol bão hoà và lắc nhẹ 10'. Ly tâm 5000 vòng/ phút x 10'. Hút lấy nớc nổi chuyền sang tube mới, cho 660àl phenol/ CHISAM (1:1) lắc đều 5', ly tâm loại bỏ cặn. Cho 660àl CHISAM (clorofom/ isoamyl alchohol: 24:1) lắc đều 5', ly tâm và hút lấy phần nớc nổi. Thêm 40àl NaOAc, pH 5,2, cồn tuyệt đối gấp 2 lần thể tích dung dịch thu đợc và lắc nhẹ nhàng. Tủa DNA hình thành, ly tâm lấy tủa, rửa tủa bằng cồn tuyệt đối và cồn 70 0 . Hoà tan DNA trong TE hoặc nớc cất. Kiểm tra chất lợng DNA bằng điện di trên thạch agarose 0,8% có ethidium bromide. Đọc kết quả bằng đèn UV. 24 TCNCYH 25 (5) - 2003 Nồng độ và độ tinh khiết của DNA đợc đo bằng quang phổ kế. Các mẫu DNA đều đạt độ tinh khiết tiêu chuẩn (OD 260/280) lớn hơn 1,7. 2.2. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) 2.2.1. Xác định gen EBNA1 từ khối u Cặp mồi sử dụng cho kỹ thuật khuyếch đại 1 đoạn gen EBNA1 từ mô sinh thiết là: mồi xuôi, 5' - tgg gttt gga aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) và mỗi ngợc, 5' - gtt gtg ggc cgg gtc cag gg - 3' (109600nt - 109581nt). Thể tích của phản ứng là 25àl trong đó 2,5àl mỗi mồi xuôi và ngợc nồng độ 2àl, 1 đơn vị Taq polymerase (Perkin - Elmer), 2àl dNPTs nồng độ 2.5àM và 200ng DNA và H 2 O. Trình tự các phản ứng gồm có biến tính DNA tiền phản ứng là 95 0 C x 2', 35 chu kỳ nhiệt là 95 0 C x 15'', 52 0 C30'', 72 0 C30'' thời gian hoàn thành phản ứng là 5' ở 72 0 C. Sản phẩm PCR có chiều dài 246bp. Điện di sản phẩm PCR trong thạch agarose 2%. Đọc kết quả và chụp ảnh bởi hệ thống GelDoc 2000. 2.2.3. Xác định gen EBNA1 từ máu ngoại vi Để khuyếch đại gen EBNA1 từ máu ngoại vi, chúng tôi phải dùng 2 lần phản ứng PCR (PCR1 và PCR2). PCR1: Trình tự nucleotid của cặp mồi thứ nhất giống với cặp mồi dùng cho phản ứng PCR đối với DNA từ khối u vòm họng. 25àl hỗn hợp phản ứng chứa 2,5àl mỗi loại mồi xuôi và ngợc nồng độ 2àl, 1 đơn vị AmpliTaq DNA polymerase (Perkin Elmer), 2.0àl dNTPs 2.5mM và 200ng DNA. Biến tính DNA tiền phản ứng ở 95 0 C x 2', 35 chu kỳ nhiệt là: 94 0 C x 15'', 52 0 C x 30'' và 72 0 C x 30'', giai đoạn hoàn thành việc kéo dài là 72 0 C x 5' . Kích thớc của sản phẩm là 246bp. PCR2: Kỹ thuật PCR lồng (nested - PCR) với cặp mồi là: mồi xuôi 5' - tgg gtt gga aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt) và mồi ngợc: 5' - gcc att cca aag aga cg - 3' (109580nt - 109561nt). Nhiệt độ gắn mồi tăng lên 59 0 C và số chu kỳ nhiệt giảm xuống còn 27. Sản phẩm PCR có kích thớc là 146bp. 2.3. Kỹ thuật phân tích trình tự nucleotid Các sản phẩm PCR (DNA từ mô sinh thiết) và nested - PCR (DNA từ máu ngoại vi) là nguyên liệu dùng để phân tích trình tự. Chuẩn bị mẫu để phân tích trình tự bằng một phản ứng PCR có một mồi xuôi, 5' - Thủ tớng gttt gga aag cat cgt ggt c - 3' (109339nt - 109360nt). Bộ kit sử dụng là "BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit". Kết quả đợc phân tích bằng phần mềm chuyên dụng. III. Kết quả 1. Đột biến thay thế nucleotid đầu cacboxy của EBNA1 ở mô sinh thiết bệnh nhân ung th vòm mũi họng và máu ngoại vi Phân tích trình tự 1 đoạn gen mã hoá cho các acid amin nằm ở những vị trí có các acid amin từ 487 đến 533, chúng tôi nhận thấy rằng sự đột biến thay thế nucleotid dẫn đến thay đổi acid amin xuất hiện ở các vị trí 487, 499, 502, 524 và 533 so với EBNA1 của chủng B95 - 8. Các vị trí thay thế acid amin này giống với dới nhóm V - val theo phân loại dới nhóm của Bhatia 1996 và Sandvej 2000 [4,6]. Nhng trong nghiên cứu của chúng tôi, vị trí các acid amin là V - val - v1 và Va - val - v2, dới nhóm của V - val (bảng 1). Dựa vào acid amin số 487, chuỗi EBNA1 đợc xếp thành 2 loại: P (prototype) - ala (hoặc thr) và V (viriant) - val (hoặc - leu). P - ala là EBNA1 thuộc dòng B95 -8. P - ala - v1, v2, v3 là các dới nhóm của P -ala. V- val - v1 và V - val - v2 là các dới nhóm của V - val. Các nucleotide có đột biến thay thế đợc đánh dấu bằng gạch chân. Các ô trống là các nucleotide có trình tự giống với P -ala của B95 - 8. 25 TCNCYH 25 (5) - 2003 Bảng 1: Các dới nhóm EBNA1 trong nghiên cứu của chúng tôi so với EBNA1 của B95 - 8 và các dới nhóm khác 471 475 476 487 492 499 500 502 520 524 525 528 533 P-ala CAA Gln AAC Agn CCG Pro GCT Ala AGT Ser GAC Asp GAA Glu ACT Thr CTA Leu ACT Thr GCC Ala ATT Ile CTT Leu P-ala-v1 GAA Glu ATT Ile P-ala-v2 GAA Glu GTT val P-ala-v3 GAA Glu GTT Val GTT Val P-thr CAG Gln ACT Thr TGT Cys GAT Asp CT C Leu A TT Ile P-thr-v CAG Gln ACT Thr TGT Cys GAG Glu CT C Leu A TT Ile V-leu GAA Glu AGC Ser CAG Gln CTT Leu TGT Cys GAG Glu GA T Asp A AT Agn CTC Leu A TT Ile GGC Gly V-val GTT Val GAG Glu A AT Agn CTC Leu A TT Ile ATT Ile V-val-v1 GTT Val GAG Glu A AT Agn CTC Leu A TT Ile GTT Val ATT Ile V-val-v1 GTT Val GAG Glu A AT Agn CTC Leu A TT Ile CTT Leu ATT Ile 2. Tỷ lệ các dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân UTVMH Việt Nam, Trung Quốc và ngời bình thờng Bảng 2: Sự phân bổ các dới nhóm EBNA1 ở máu ngoại vi ngời bình thờng, máu và khối u của các bệnh nhân ung th vòm Trung Quốc và Việt Nam Số mẫu P - ala P - ala + Va-val-v1 Va-val-v1 Va-val-v2 Ghi chú T: 10 0 0 9 1 UTVMH Việt Nam L: 10 0 0 9 1 Cặp mẫu T: 15 0 0 15 0 UTVMH Quảng Đông 1 L: 15 2 1? 12 0 Ngời cho máu Việt Nam L: 5 0 0 5 0 T: Khối u; L : máu ngoại vi; cặp mẫu: gồm sinh thiết và máu ngoại vi của cùng một bệnh nhân. Trong tổng số 10 cặp mẫu của bệnh nhân UTVMH Việt Nam có 9 cặp mẫu có dới nhóm là V - val - v1 và 1 cặp mẫu có V - val - v2. Đối với các bệnh nhân UTVMH của Trung Quốc dới nhóm V-val-v1 cũng có mặt ở hầu hết các cặp mẫu và không thấy một trờng hợp nào có dới nhóm V- val-v2. Trong khi đó ở máu ngoại của một số bệnh nhân UTVMH lại có P-ala hoặc nghi ngờ có cả P-ala và V-val-v1. Sự có mặt của cả 2 dới nhóm P-ala và V-val trong máu ngoại vi cũng đã đợc thông báo [7]. Một điều đáng chú ý là trong 5 mẫu DNA từ máu 26 TCNCYH 25 (5) - 2003 ngoại vi của ngời cho máu Việt Nam cũng chỉ có một dới nhóm là V-val-vq Kết quả này cũng phù hợp với nhận xét của Sandvej 2000 khi nghiên cứu trên các đối tợng bệnh nhân ung th vòm họng của ngời Trung Quốc và chỉ đặc trng cho biến thể EBNA1 ở Châu á, nơi có tỷ lệ mắc bệnh ung th vòm họng cao nh Trung Quốc. Tuy nhiên, việc nghiên cứu chức năng của đoạn protein EBNA1 có đột biến thay thế acid amin cũng cần đợc tiến hành để xem các đột biến này có ảnh hởng đến chức năng của nó hay không. IV. Kết luận Dới nhóm của EBNA1 ở bệnh nhân ung th vòm họng và ngời bình thờng Việt Nam chủ yếu là V-val-v1. Kết quả này cũng tơng tự ở các mẫu nghiên cứu lấy từ bệnh nhân ung th vòm họng ở Trung Quốc. Tài liệu tham khảo 1. Frank, D. et al, (1995): Postransplantation lymphoproliferative disorders frequently contain type A and not type B Epstein - Barr virus. Blood, 85 (5): p. 1396 - 403. 2. Zur Hausen H., et al., (1970), EBV DNA in biopsies of Burkitt tumours and anaplastic carcinomas of the nasopharynx. Nature, 228 (276): p.1056 - 8. 3. Chang, Y.S., et al., (1990), Detection of Epstein - Barr virus DNA sequences in nasopharygeal carcinoma cells by enzymatic DNA amplification. J Clin Microbiol, 28 (11): p.2398 - 402. 4. Bhatia, K., et al. (1996), Variation in the sequence of Epstein Barr virus nuclear antigen 1 in normal peripheral blood lymphocytes and in burkitt's lymphomas. Oncogene, 13(1): p. 177 - 81 5. Bhatia, K. and I. Magrath, EBNA - 1 sequences iin endemic and sporadic Burkitt's lymphoma. J. Virol, 1999, 73 (8): p.7096 - 7 6. Sandvej K., X.G. Zhou and S.Hamilton - Dutoit, EBNA - 1 sequence variation in Danish and Chinese EBV - associated tumours: evidence for geographical polymorphism butnot for tumour - specific subtype restriction. J. Pathol, 2000, 191 (2): p.127 - 31. Gutierrez, M.I., et al. (1997), Sequence variations in EBNA - 1 may dictaterestriction of tissue distribution of Epstein - Barr virus in normal and tumour cells. J. Gen Virol, 78 (pt 7): p.1663 70. Variation of EBNA1 in Vietnamese, chinese NPC and healthy blood donors EBNA1 (Epstein Barr virus nuclear antigen-1) is the only viral protein expressed consistently in all virus-infected cells. Its sequence variations were defined based on amino acid signature at codon 487. Those are prototype containing P-ala (identical to prototype B95-8 strain) and (P)-thr and variant that has V-val, V-leu and V-pro. We analyzed DNA sequence in C-terminus of EBNA1 from PCR products. DNA samples for PCR were isolated from tumours and periferal blood of Vietnamese nasopharyngeal carcinoma and from peripheral blood of healthy blood donors. The results show that there are two EBNA1 sub-subtypes in Vietnamese NPC (nasopharyngeal carcinoma), V-val-v1 (9/10 DNA matches samples and 5 DNA samples from healthy blood donors and V-val-v2 (1/10 matched samples). Among 15 Chinese matched samples, 15/15 samples from tumors contained V-val-1, only 2/15 (blood samples) contained P-ala and 1/15 (blood sample) may be mixed P-ala and V-val-1. 27 . TCNCYH 25 (5) - 2003 Biến thể ebnai ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng Việt Nam, Trung Quốc và ở ngời Việt Nam bình thờng Nguyễn Văn Đô 1 ,. nhân ung th vòm họng của ngời Trung Quốc và chỉ đặc trng cho biến thể EBNA1 ở Châu á, nơi có tỷ lệ mắc bệnh ung th vòm họng cao nh Trung Quốc. Tuy nhiên,