Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 15 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Nội dung
49 XÁCĐỊNHTÝPEBVTRONGTỔCHỨCSINHTHIẾTVÒMCỦABỆNHNHÂNUNGTHƯVÒMMŨIHỌNGBẰNGKỸTHUẬTPCR Phan Thị Minh Phương Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN ĐỀ Epstein-Barr Virus (EBV) thuộc nhóm Lymphocryptovirus, liên quan mật thiết với họ gamma herpesvirus ở người. EBV được biết là tác nhân gây bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm khuẩn và liên quan chặt chẽ với một số bệnh lý ác tính ở người như: u lympho Burkitt (BL), ungthưvòmmũihọng [7], [10], [12], [14]. Theo tổchứcnghiêncứuungthư Quốc tế (IARC-1993) thì ungthưvòmmũihọng (UTVMH) là bệnh phổ biến ở miền Nam Trung Quốc, Đông Nam Á và là 1 trong 8 loại ungthư hay gặp [1], [6],[8],[13]. Việt Nam là nước có tỉ lệ mắc bệnh trung bình song điều đáng quan tâm là UTVMH đứng hàng đầu các ungthư vùng đầu, cổ và đứng hàng thứ năm trong các loại ungthư chủ yếu gặp ở nam 50 giới [1], [4]. Hơn thế nữa bệnh có đặc điểm là các biểu hiện lâm sàng thường là “mượn”, dễ chẩn đoán nhầm, trên 95% bệnhnhân được phát hiện đã ở giai đoạn III và IV [2],[4]. Nhiều nghiêncứu về UTVMH cho thấy bệnh là do sự phối hợp giữa yếu tố di truyền (HLA) và yếu tố môi trường, trong đó nhiễm EBV là quan trọng nhất. Hàng loạt dấu ấn EBV được phát hiện thông qua các kháng thể (KT) kháng các kháng nguyên (KN) củaEBV như IgA/VCA, IgA/EA, IgG/VCA trong huyết thanh bệnhnhân UTVMH. Tiếp đó, DNA- EBV cũng như các gien, sản phẩm gien củaEBV cũng được tìm thấy trong huyết thanh, trongtổchứcsinhthiếtvòm họng, trong dịch tiết đường mũihọngcủabệnhnhân UTVMH [1],[3],[4],[9],[11] càng khẳng định vai trò củaEBVtrongbệnhsinh UTVMH. Nhằm mục đích xácđịnh tỷ lệ và phân bố củatýpEBVtrong UTVMH của người Việt Nam và góp phần tìm hiểu mối liên quan giữa các týpEBV với UTVMH giúp quản lý và theo dõi bệnh. Trong đề tài này chúng tôi tiến hành xácđịnhtýpEBVtrongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH thể không biệt hóa, thể hay gặp nhất ở Việt Nam (trên 80%)[4]. 51 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU 1. Đối tượng - Nhóm nghiên cứu: 91 mẫu sinhthiếtvòmhọng hoặc khối paraffin củabệnhnhân UTVMH thể không biệt hóa (đã xác chẩn mô bệnh học) ở miền Bắc và miền Trung. - Nhóm chứng: 32 mẫu sinhthiết tươi hoặc khối paraffin củabệnhnhânungthư vùng đầu, cổ khác không phải UTVMH (có xác chẩn mô bệnh học). 2. Phương pháp nghiêncứu - Tách DNA: + Tổchứcsinhthiết tươi vòmhọngcủabệnhnhân UTVMH thể không biệt hóa và ungthư vùng đầu, cổ khác được chiết tách DNA theo quy trình Rapid prep micro genomic DNA isolation kits. + Tổchứcsinhthiếttrong khối paraffin chiết tách DNA theo quy trình của Choon Kook Sam 1995, có bổ sung. + Hoá chất của Amersham Pharmacia Biotech. 52 - Tiến hành PCR cho DNA thu được sau chiết tách. PCR được tiến hành theo nguyên lý của KaryMullis (1986) với các cặp mồi đặc hiệu cho gien EBNA - 2A và EBNA - 2B, trình tự mồi: Gien EBV Kích thước sản phẩm Vị Trí Trình tự mồi EBNA 2A- 5’ (B95-8) 115 bp 49213 - 49232 AACTTCAACCCACACCA TCA EBNA-2A-3’ 49309 - 49328 TTCTGGACTATCTGGAT CAT EBNA-2B-5’ (AG876) 119 bp 2060 - 2079 TACTCTTCCTCAACCCA GAA EBNA-2B-3’ 2160 - 2179 GGTGGTAGACTTAGTTG ATG Điều kiện chu kỳ nhiệt để làm phản ứng PCR: + 94 0 C/90 giây 53 + 94 0 C/1 phút + 55 0 C/2 phút 25 chu kỳ + 72 0 C/1 phút + 72 0 C/10 phút + 4 0 C Hóa chất cần thiếtcủa hãng Perkin - Elmer 54 III. KẾT QUẢ Bảng 1: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH Vùng n DNA - EBV % p Miền Bắc 61 56 91, 8 Miền Trung 30 27 90, 0 >0,05 Tổng số 91 83 91, 2 Bảng 2: Tỷ lệ phát hiện DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trongtổchứcsinhthiếtbệnhnhânungthư đầu, cổ khác Vùng n DNA - EBV % p Miền Bắc 14 4 28,56 >0,05 55 Miền Trung 18 2 11,11 Tổng số 32 6 18,75 76,9% 11% 3,3% 12,5% 6,25% 0 20 40 60 80 % UTVMH UT §Çu, cæ kh¸c Týp 1 Týp 2 Týp 1 & 2 0% Biểu đồ 1: Tỷ lệ phát hiện các týpcủaEBVtrong UTVMH và ungthư đầu, cổ khác. 56 IV. BÀN LUẬN EBV là loại gamma Herpesvirus, được Epstein và Barr phát hiện từ năm 1964, kể từ đó EBV không ngừng được nghiên cứu. Cho đến nay, EBV được phân thành 2 týp: týp 1 (týp A), týp 2 (týp B) dựa trên sự khác biệt về trình tự nucleotide của các gien mã cho các kháng nguyên nhâncủa nó (EBNA- 2,3,4&6)[5]. Nhiều công trình nghiêncứu về EBV đã nhậnđịnh rằng EBV là loại virus ái tế bào biểu mô và lympho bào B. Người ta thấy rằng EBV lây truyền chủ yếu qua nước bọt, sau đó xâm nhập vào các tế bào lympho B, tế bào biểu mô vòm họng, liên bào tuyến nước bọt trực tiếp qua thụ thể CD21 và gián tiếp qua lgA nhờ các phân tử gp350/250 của EBV. Tại các tế bào này, virus được lưu trữ, sao chép đồng thời thiết lập một quá trình nhiễm tiềm ẩn. Như vậy, tế bào biểu mô vòmhọng là nơi lưu giữ virus ở khu vực vòm họng. Sự nhiễm EBV ở tế bào biểu mô thường dai dẳng, còn số lượng tế bào lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn trong máu ngoại vi thường thấp (ít hơn 0,001%). Số lượng thấp của tế bào lympho B nhiễm EBV tiềm ẩn được quy là do hoạt động của tế bào lympho T độc (Tc) đối với EBV, hoạt động này xuất hiện sau nhiễm EBV tiên phát. Chính vì vậy, trong đề tài này chúng tôi chọn mẫu bệnh phẩm là tổchứcsinhthiếtvòmhọng chứ không chọn mẫu là máu hay huyết thanh củabệnhnhân UTVMH (mặc dù mẫu máu hay huyết thanh dễ thu thập hơn) để khả năng phát hiện EBV cao. Kết quả bảng 1 cho thấy 91,8% trường hợp ở miền Bắc phát hiện có DNA-EBV trongtổchứcsinhthiếtvòmhọng và ở miền Trung là 90,0% trường hợp không có sự khác biệt về tỷ lệ phát hiện DNA-EBV giữa hai vùng (p> 0,05). Kết quả của chúng tôi có hơi thấp hơn một ít so với kết quả của một số tác giả trong và ngoài nước khác là do các tác giả khác sau PCR đã sử dụng thêm những kỹthuật đặc biệt hơn để phân tích. Ví dụ, tác giả Uraiwan Kositanont [14] và 57 Choon - Kook - Sam [5] sau PCR, sản phẩm khuếch đại thay vì được đọc trực tiếp trên gel agarose thì được tiếp tục lai southern blot giúp cho việc phát hiện tốt hơn, nên kết quả của họ đạt đến 94,1% và 96,0%. Nghiêm Đức Thuận [4] của Việt Nam, sản phẩm PCR tiếp tục được lai dot blot làm cho số lượng acid nucleic được tăng cường nên càng dễ dàng phát hiện và vì thế mà tỷ lệ có DNA-EBV trong mẫu sinhthiếtvòmhọng rất cao 98,1% và 95,7%. Hoặc các tác giả Kantakamalakul W. của Thái Lan, Peh S. C của Malaysia [12] thì sử dụng kỹthuậtPCR lồng (nested - PCR) thay vì PCR đơn thuần. Độ nhạy củaPCR lồng rất cao do sản phẩm PCR được tiếp tục khuếch đại lại một lần nữa, vì thế kết quả đạt được ở mức cao nhất là 96,5% và 100%. Bảng 2 cho thấy trong tổng số 32 mẫu ungthư đầu, cổ khác chỉ phát hiện được 6 mẫu có chứa DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B, chiếm tỷ lệ 18,75%. Phân tích giữa 2 vùng (miền Bắc và miền Trung) cho thấy tỷ lệ phát hiện DNA- EBV ở miền Bắc cao hơn (28,56%) so với miền Trung (11,11%) nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05). Tỷ lệ chênh lệch giữa hai vùng có thể quy cho số mẫu được thu thập. Kết quả của chúng tôi (18,75%) cũng tương đối phù hợp so với kết quả nghiêncứu của một số tác giả khác nghĩa là tỷ lệ phát hiện DNA-EBV trên đối tượng chứng thấp hơn nhiều so với bệnhnhân UTVMH. Tuy nhiên, những con số cụ thể có thể hơi khác nhau tùy thuộc vào số lượng nghiên cứu, chất liệu nghiên cứu, kỹthuậtứng dụng trongnghiêncứu và cũng không loại trừ tính chất của dân tộc nghiên cứu. Như vậy, tỷ lệ phát hiện cao (91,2%) DNA-EBV với mồi EBNA-2A, -2B trongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH và tỷ lệ thấp (18,75%) 58 DNA-EBV trong các ungthư đầu, cổ khác. Nghiêncứucủa chúng tôi hoàn toàn phù hợp với những khẳng định trước đây rằng UTVMH có liên quan chặt chẽ với EBV. Liên quan củaEBV với UTVMH nói riêng và với các bệnh lý ác tính nói chung đã đặt ra câu hỏi rằng: có những dưới nhóm khác nhau củaEBV có thể liên quan đến các bệnh lý này hay không? Và câu trả lời được khẳng định qua biểu đồ về tỷ lệ phát hiện các týpcủa EBV. Biểu đồ trên cho thấy sự vượt trội củatýp 1 trong UTVMH (76,9%) so với týp 2(11%), týp 1&2(3,3%) cũng như so với nhóm ungthư đầu cổ khác (12,5%). Kết quả này của chúng tôi là hoàn toàn tương tự với các nghiêncứucủa các tác giả khác. Theo Uraiwan K. và cs [14] phân tích 34 mẫu sinhthiết UTVMH với cặp mồi EBNA - 2A, -2B phát hiện 82,3 % là týp 1, 5,9% týp 2 và 5,9% cả týp 1&2. Tác giả Janse van Rensburg E. và cs [7] nghiêncứu trên 15 bệnhnhân UTVMH ở Nam Phi cho thấy 14/15 trường hợp tế bào có EBVtýp 1, chỉ có 1 trường hợp có cả týp 1&2. Nghiêncứu tại Malaysia, Choon Kook Sam và cs [5] cũng thấy EBVtýp 1 gặp ở 72% số mẫu sinhthiết và dịch tiết đường mũihọngbệnhnhân UTVMH. Peh SC. và cs [12] thấy EBVtýp 1 trong tất cả 38 trường hợp u lympho và 14 trường hợp UTVMH được nghiêncứu (100%). Từ kết quả trên có thể nói rằng EBVtýp 1 là týp chiếm ưu thế trong UTVMH thể không biệt hóa người Việt Nam. Như vậy, phát hiện chủ yếu của đề tài chúng tôi là sự nổi trội củaEBVtýp 1 trongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH so với một tỷ lệ thấp trongtổchức tương ứngcủa nhóm chứng bệnhnhânungthư đầu, cổ khác (76,9% so với 12,5%); sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,0001. Mức độ caocủa sự biểu lộ EBVtýp 1 trongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH cho thấy mối liên quan giữa EBVtýp 1 với tế bào u trongsinhthiết UTVMH. [...]... 91,2%, ở bệnhnhânungthư vùng đầu, cổ khác là 18,75% - EBVtýp 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 76,9% trongtổchứcsinhthiếtvòmhọngcủabệnhnhân UTVMH, tỷ lệ EBVtýp 2 là 11,0% và EBVtýp 1&2 là 3,3% - Tỷ lệ EBVtýp 1 trongtổchứcsinhthiếtcủabệnhnhânungthư đầu, cổ khác là 12,5%, týp 2 là 6,25% Không phát hiện nhiễm phối hợp EBVtýp 1&2 trong những trường hợp này TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 Phạm Hoàng...Việc xácđịnhtýp 1 củaEBV là týp chiếm ưu thế trong UTVMH cùng với sự hiểu biết về đặc tính sinh họccủa EBV týp 1 sẽ tạo một cơ sở khoahọc cho việc thiết kế vacxin phòng EBV Đồng thời cần khảo sát các biến thể củatýp 1 trong chủng EBV ở Việt Nam để có thể thiết kế vacxin hiệu quả V KẾT LUẬN - Với cặp mồi EBNA-2A,-2B tỷ lệ phát hiện DNA -EBV ở bệnhnhân UTVMH là 91,2%, ở bệnhnhânungthư vùng... cs Tần suất và sự đột biến mất đoạn gen LMP1 ở bệnhnhânungthưvòmmũi họng, Tóm tắt báo cáokhoahọc Hội nghị miễn dịch toàn quốc (2003) 37 - 38 4 Nghiêm Đức Thuận Nghiêncứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnhhọc và hoạt tính gen virut Epstein - Barr trongungthưvòmmũi họng, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y 5 Choon Kook Sam et al A special type of EBV associated with nasopharyngeal carcinoma Asian... Hoài Nga, Trần Hồng Trường và cs Tình hình bệnhungthư ở Hà Nội giai đoạn 1996-1999 Tạp chí Y học thực hành, Chuyên đề Ungthưhọc (431) (2000) 4 - 7 59 2 Nguyễn Thị Bích Hà Nghiêncứu giá trị chẩn đoán và tiên lượng ungthưvòmmũihọngbằngkỹthuật đặc hiệu lgA kháng VCA và EA củaEBV và tế bào diệt tụ nhiên trong máu ngoại vi, Luận án Tiến sỹ Y học, Học Viện Quân Y (1995) 3 Phạm Thị Nguyệt Hằng,... Uraiwan Kositanont et al Detection of EBV - DNA and HHV - 6 DNA in tissue biopsies from patients with nasopharyngeal carcinoma by PCR Southeast Asian J Trop Med Public (24) (1993) 455 - 460 61 TYPING EBV IN NASOPHARYNGEAL TISSUES OF PATINETS WITH NASOPHARYNGEAL CARCINOMA (NPC) BY PCR Phan Thi Minh Phuong College of Medicine, Hue University SUMMARY In this study, the EBV types in nasopharyngeal tissues... washing from patients with head and 60 neck tumors in Taiwan, Journal of Clinical Miccrobiology, Vol.32, No.1 (1994) 28 - 31 9 Hu L.F Nasopharyngeal carcinoma and EBV PhD thesis MTC (1996) 10 Kunimoto M., Tamura S et al One-step typing of EBV by PCR: Predominance of type 1 virus in Japan, J.Gen Virol, 73 (1992) 455 461 11 Katsuyuki Aozasa, Masahiko O et al Epstein - Barr virus - and malignant lymphoma,... (undifferentiated carcinoma nasopharyngeal type) from North and Central Vietnam and 32 controls with other head and neck tumors were determined by PCR with primers EBNA-2A, EBNA-2B (from genome of EBV strains B95- 8 and AG - 876) The results showed that: 1.DNA - EBV was detected in 91.2% patients with NPC and 18.75% patients with other head and neck tumors 2 In patients with NPC: 76.9% were positive cases... 1: 11% were positive cases of type 2and 3.3 % positive of both types 62 3 12.5% cases were of type 1 and 6.25 cases were of type 2 with other head and neck tumors The results indicated that type 1 of EBV is predominant in patients with NPC (UCNT) from North and Central Vietnam 63 . 49 XÁC ĐỊNH TÝP EBV TRONG TỔ CHỨC SINH THIẾT VÒM CỦA BỆNH NHÂN UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG BẰNG KỸ THUẬT PCR Phan Thị Minh Phương Trường Đại học Y khoa, Đại học Huế I. ĐẶT VẤN. cao của sự biểu lộ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH cho thấy mối liên quan giữa EBV týp 1 với tế bào u trong sinh thiết UTVMH. 59 Việc xác định týp 1 của EBV. - EBV týp 1 chiếm ưu thế với tỷ lệ 76,9% trong tổ chức sinh thiết vòm họng của bệnh nhân UTVMH, tỷ lệ EBV týp 2 là 11,0% và EBV týp 1&2 là 3,3%. - Tỷ lệ EBV týp 1 trong tổ chức sinh thiết