Tài liệu Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1 ở bệnh nhân ung thư vòm mũi họng pptx

TCNCYH 23 (3) 2003 Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1 ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi, Nguyễn Văn Đô, Bạch Khánh Hoà, Trần Thị Chính Đại học Y Hà Nội Epstein-Barr (EBV) - virút có mối quan hệ mật thiết đối với ung th vòm mũi họng (UTVMH). Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 20 cặp mẫu (gồm máu ngoại vi và sinh thiết vòm họng) bệnh nhân UTVMH thể không biệt hoá, 5 mẫu bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH. Mục đích của nghiên cứu này nhằm điều tra tần suất của gien LMP1 là một trong những gien ở thể tiềm ẩn của virút và 30 mẫu máu ngoại vi của những ngời khoẻ mạnh. Sử dụng hai cặp mồi LMP1 dựa theo kinh nghiệm của phòng thí nghiệm MTC, viện Karolinska, Thuỵ điển. Hai cặp mồi này đặc hiệu và thiết kế cho gien LMP1 đột biến, có vị trí từ 168592 - 168174 và từ vị trí 168373 - 168174 (từ genom của EBV). Kết quả thu đợc nh sau: 1. Tỷ lệ gien LMP1 - EBV ở máu ngoại vi ngời khoẻ mạnh là 96,7% (29/30 ca dơng tính). 2. Tỷ lệ gien LMP1 - EBV ở cặp mẫu bệnh nhân UTVMH thể biểu mô không biệt hoá là 100% (20/ 20 trờng hợp dơng tính) 3. Tỷ lệ gien LMP1 ở bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH là 100% (5/ 5 trờng hợp dơng tính). 4. Trên điện di, 90% gien LMP1 - EBV ở mô sinh thiết vòm họng bệnh nhân UTVMH có hiện tợng đột biến mất đoạn trong khi gien LMP1 - EBV ở máu ngoại vi của những bệnh nhân này chỉ có 10% có đột biến mất đoạn. I. Đặt vấn đề EBV thuộc nhóm Herpes virút có lõi ADN xoắn kép, liên quan gần đến một vài khối u ác tính ở ngời trong đó có ung th vòm mũi họng (UTVMH), đặc biệt là với thể ung th biểu mô không biệt hoá. Mối liên quan này đợc chứng minh lần đầu tiên do sự xuất hiện kháng thể chống kháng nguyên EBV trong huyết thanh của bệnh nhân UTVMH. Mối liên quan này đợc khẳng định thêm bởi việc phát hiện sự có mặt của EBV trong những mẫu sinh thiết UTVMH. Hơn nữa, gần đây bản sao của EBV ở thể tiềm ẩn gồm EBNA1 và LMP1, LMP2 đã đợc tìm thấy trong các mẫu sinh thiết UTVMH. Trong số các protein mã hoá của virút EBV ở thể tiềm ẩn trên thì LMP1 là một protein quan trọng: có thể ức chế sự biệt hoá và gây biến chuyển tế bào biểu mô [7]. Theo kết quả nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trình tự gien LPM1 của các bệnh nhân UTVMH là khác nhau, đặc biệt có đột biến mất 30 bp ở đầu C tận so với gien LMP1 của dòng tế bào B95 8[5][6][7] Hơn nữa, có những bằng chứng cho rằng, đột biến mất 30bp của gien LMP1 là một nhân tố thúc đẩy sự phát triển của khối u (Li et al., 1996) [7]. Việc mất 30bp của gien LMP1 có thể làm thay đổi cấu trúc dẫn đến thay đổi chức năng của protein, ảnh hởng tới việc nhận biết protein bởi hệ thống miễn dịch [9]. Việt Nam là một nớc có tần suất UTVMH khá cao trong lúc các nớc Âu Mỹ thì quá thấp tuy rằng tỷ lệ nhiễm EBV trên toàn cầu là cao nh nhau (95 97%). Xuất phát từ tình hình thực tiễn này, chúng tôi tiến hành đề tài với mục đích: 91 TCNCYH 23 (3) 2003 1. Xác định tỷ lệ gien LMP1 ở ngời khoẻ mạnh và bệnh nhân UTVMH. 2. Xác định tỷ lệ gien LMP1 ở bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH. 3. Phát hiện đột biến gien LMP1 ở bệnh nhân UTVMH. II. Đối tợng và phơng pháp 1. Đối tợng Đối tợng nghiên cứu: - 20 cặp mẫu: máu ngoại vi và sinh thiết vòm họng bệnh nhân UTVMH thể không biệt hoá. Các mẫu này đợc thu thập tại bệnh viện K Hà Nội từ năm 2000 đến 2001. Đối tợng chứng: - 5 mẫu sinh thiết bệnh nhân ung th đầu, cổ khác không phải UTVMH. - 30 mẫu máu ngoại vi lấy từ ngời khoẻ mạnh về lâm sàng. Toàn bộ mẫu sinh thiết trên đợc bảo quản ở 70 0 C cho đến khi tiến hành tách chiết ADN. 2. Phơng pháp 2.1. Tách chiết ADN - ADN tách từ máu ngoại vi theo qui trình Perchlorate. - ADN tách từ mẫu sinh thiết theo qui trình của tác giả Chomczynski và Sacchi. 2.2. Phản ứng PCR: - Trình tự cặp mồi: 168373: 5 - CTA GCG ACT CTG CTG GAA AT - 3 168174: 5 - CGC GGA TCC TTA GTC ATA GTA GCT TAG - 3 - Nguyên vật liệu để tiến hành phản ứng PCR gồm: 100ng ADN; 4àM mỗi mồi; 0,2 mM dNTP; 2.0mM MgCl 2 ; 1 đơn vị Taq ADN polymerase (Perkin Elmer) trong PCR buffer IX. Tổng thể tích phản ứng là 50àl. - Điều kiện chu trình nhiệt: 94 0 C/ 4 phút; 35 chu kỳ: 95 0 C/ 30 giây, 57 0 C/ 1 phút 30 giây, 70 0 C/ 2 phút 30 giây; 72 0 C/ 10 phút 4 0 C. 2.3. Phản ứng PCR lồng: 2.3.1. Phản ứng PCR lần thứ nhất: - Trình tự cặp mồi: 168592: 5 - ATC GCG ACT CTG CTG GAA AT - 3 168174: 5 - CGC GGA TCC TTA GTC ATA GTA GCT TAG - 3 - Nguyên vật liệu để tiến hành phản ứng PCR gồm: 100ng ADN; 4àM mỗi mồi; 0,2 mM dNTP; 3.0 mM MgCl 2 ; 1 đơn vị Taq ADN polymerase (Perkin Elmer) trong PCR buffer 1X. Tổng thể tích phản ứng là 50àl. - Điều kiện chu trình nhiệt: 94 0 C/ 10 phút; 35 chu kỳ: 95 0 C/ 45 giây, 55 0 C/ 1 phút 30 giây, 72 0 C/ 2 phút 30 giây; 72 0 C/ 10 phút 4 0 C. 2.3.2. Phản ứng PCR lần thứ hai: - Trình tự cặp mồi: giống nh cặp mồi để tiến hành phản ứng PCR (phần 2.2) - Nguyên vật liệu để tiến hành phản ứng PCR gồm: 2 àl sản phẩm PCR lần thứ nhất; 4àM mỗi mồi; 0,2 mM dNTP; 1.0 mM MgCl 2 ; 1 đơn vị Taq ADN polymerase (Perkin Elmer) trong PCR buffer 1X. Tổng thể tích phản ứng là 50àl. - Điều kiện chu trình nhiệt: 94 0 C/ 5 phút; 20 chu kỳ: 95 0 C/ 30 giây, 60 0 C/ 1 phút 30 giây, 72 0 C/ 1 phút; 72 0 C/ 10 phút 4 0 C. - Kiểm tra sản phẩm PCR và PCR lồng bằng cách điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE 1X, điện thế 100V, thời gian 1 giờ. 92 TCNCYH 23 (3) 2003 III. Kết quả 1. Kết quả tách chiết ADN Bảng 1: Hàm lợng và độ tinh khiết của ADN OD Đối tợng OD 260 OD 280 OD 260 / OD 280 ADN 0,1494 0,2831 1,894 - Hàm lợng ADN đợc đo bằng giá trị OD 260 trên quang phổ kế. - Độ tinh khiết của ADN đợc đo bằng chỉ số OD 260 / OD 280 sau khi đo trên quang phổ kế. Một đơn vị OD 260 = 0,1494 tơng ứng với dung dịch có nồng độ ADN sợi đôi là 0,1496 x 50 x 20 = 140,8àg/ ml. Hình 1: Điện di kiểm tra ADN trên gel agarose 0,8%, điện thế 100V, thời gian 20 phút. 1, 2, 3, 4, 5, 6: ADN tách từ máu ngoại vi của 6 ngời khoẻ mạnh 2. Xác định ADN - EBV ở máu ngoại vi Bảng 2: Tỷ lệ gien LPM1 - EBV ở máu ngoại vi (sử dụng cặp mồi để nhân đoạn ADN từ vị trí 168592 - 168174). Đối tợng % dơng tính Máu ngời khoẻ mạnh 96,7% (29/ 30 ca) Máu bệnh nhân UTVMH 100% (20/ 20) Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR vòng 2 trên gel agarose 2%, điện thế 100V, thời gian 1 giờ. Số 1, 2, 3, 4, 5: Ngời khoẻ mạnh M: thang ADN chuẩn 100 bp Số 21, 22, 23, 24, 25: Mẫu sinh thiết chứng. - Trên hình ảnh điện di cho thấy: sản phẩm PCR của chúng tôi có độ dài khoảng 230bp so với thang ADN chuẩn 100bp. 3. Tỷ lệ gien LMP1 đột biến mất 30bp ở mô sinh thiết Bảng 3: Phát hiện gien LMP1 đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật PCR Đối tợng % gien LMP1 đột biến mất đoạn Sinh thiết UTVMH 90% (18/ 20 mẫu) Sinh thiết UT vùng đầu cổ khác không phải UTVMH 0% (0/ 5 mẫu) Máu ngoại vi ngời khoẻ mạnh 0% (0/ 30 mẫu) Máu ngoại vi bệnh nhân UTVMH 10% (2/ 20 mẫu) 93 TCNCYH 23 (3) 2003 H ình 3: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR từ mẫu sinh thiết trên gel agarose 2%, điện thế 100V trong 1 giờ. Số 1, 2, 3, 4, 9,10: các mẫu UTVMH thể không biệt hoá M: thang ADN chuẩn 100bp Số 21: Bệnh nhân chứng Hình 4.A: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR (của các cặp mẫu) trên gel agarose 2%, điện thế 100V, thời gian 1 giờ. (Có sự chênh lệch giữa sản phẩm PCR của máu ngoại vi và của mô sinh thiết khối u vòm họng trên cùng một bệnh nhân UTVMH). T: sản phẩm PCR từ mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH B: sản phẩm PCR từ máu ngoại vi của bệnh nhân UTVMH Các mẫu số 1, 2, 3 gồm có B và T Số 4: Chỉ có B Bc: Mẫu máu chứng Tc: Mẫu sinh thiết chứng M: thang ADN chuẩn 100bp Hình 4.B (Không thấy có sự chênh lệch giữa sản phẩm PCR của máu ngoại vi và của mô sinh thiết khối u vòm họng trên cùng một bệnh nhân UTVMH). T: sản phẩm PCR từ mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH B: sản phẩm PCR từ máu ngoại vi của bệnh nhân UTVMH Các mẫu số 14, số 11, số 13, số 16: Gồm T và B M: thang ADN chuẩn 100bp IV. Bàn luận 1. Xác định gien LMP1 - EBV ở máu ngoại vi Đối tợng nghiên cứu của chúng tôi là 30 mẫu máu ngoại vi ngời khoẻ mạnh và 20 mẫu máu ngoại vi bệnh nhân UTVMH. Sau khi tách chiết đợc ADN tổng số từ những mẫu máu này, chúng tôi tiến hành phản ứng PCR lồng (Nested PCR) để nhân đoạn gien LMP1 từ vị trí 168592 đến vị trí 168174. Do số lợng ADN của EBV so với lợng ADN tổng số đợc tách ra từ máu ngoại vi của những ngời khoẻ mạnh là rất nhỏ, vì vậy trong nhiều trờng hợp nếu chỉ sử dụng PCR một lần, hay nói một cách khác là chỉ sử dụng một cặp mồi thì sẽ không tạo ra đợc đủ lợng sản phẩm PCR mong muốn vì lợng ADN của EBV khuôn quá thấp. Hơn nữa, chúng tôi không thể tăng nhiều ADN tổng số làm khuôn ban đầu vì điều này sẽ gây nên tính không đặc hiệu của phản ứng PCR và có thể cho ra nhiều sản phẩm phụ. Với kỹ thuật PCR lồng chúng tôi khắc phục nhợc điểm này. Sản phẩm PCR lần thứ nhất sau đó sẽ đợc dùng làm sợi khuôn cho phản ứng PCR tiếp theo để nhân bản đoạn ADN của gien LMP1. ở lần chạy PCR thứ hai, chúng tôi sử dụng 2àl sản phẩm PCR lần thứ nhất để làm khuôn. Trên 30 mẫu ADN tách từ máu ngoại vi của ngời khoẻ mạnh phát hiện có 96,7% (29/ 30 mẫu dơng tính) có LMP1 - EBV. Trên 20 mẫu máu ngoại vi của bệnh nhân UTVMH, chúng 94 TCNCYH 23 (3) 2003 tôi thu đợc 100% (20/ 20 mẫu dơng tính) có LMP1 - EBV (Bảng 2; Hình 2). Kết quả này rất phù hợp với kết quả của các tác giả: Theo Kee - Ching G., Chen - Yi Hsu và cs, tỷ lệ nhiễm EBV ở ngời dân sống ở Đài Loan là 100%[8]. ở nớc ta, tỷ lệ những ngời trởng thành nhiễm EBV là 93% [2]. Nghiêm Đức Thuận cũng tìm thấy có genome EBV ở 100% bệnh nhân UTVMH thể không biệt hoá ở Việt Nam [3]. Bằng kỹ thuật miễn dịch, khi tiến hành nghiên cứu huyết thanh học của bệnh nhân UTVMH, nhóm tác giả Phan Thị Thu Anh, Đỗ Hoà Bình, Phan Thị Phi Phi và cộng sự thu đợc kết quả nh sau: tỷ lệ % IgG/ VCA dơng tính ở bệnh nhân trớc xạ trị là 92,3%, tỷ lệ IgA/ VCA dơng tính ở bệnh nhân trớc xạ trị là 85,7%. Sau khi xạ trị một mũi thì tỷ lệ IgG/ VCA và IgA/ VCA dơng tính đều là 100% [1]. Nh vậy, đối chiếu giữa hai phơng pháp khác nhau, một là tiến hành nghiên cứu trên gien (LMP1 - kỹ thuật sinh học phân tử), hai là tiến hành nghiên cứu trên sản phẩm của gien (kỹ thuật miễn dịch) thì đều cho một kết quả chung. Đó là: hầu hết dân c trên thế giới đều nhiễm EBV. Tuy nhiên, không phải tất cả những ngời nhiễm EBV đều mắc UTVMH. Vì vậy, bên cạnh EBV có thể còn rất nhiều yếu tố khác nh yếu tố cơ địa, yếu tố di truyền HLA và yếu tố gien nhạy cảm. 2. Tỷ lệ gien LMP1 - EBV ở mô sinh thiết So với ở máu ngoại vi, ở sinh thiết mô có hàm lợng EBV rất cao. Vì vậy, đối với những mẫu ADN tách từ mẫu sinh thiết, chúng tôi không tiến hành phản ứng PCR lồng mà chỉ tiến hành một lần với cặp mồi để nhân đoạn ADN - EBV từ vị trí 168373 - 168174. Kết quả cho thấy đoạn gien LMP1 đã đợc nhân lên một cách đặc hiệu, thể hiện một băng sáng rõ nét, có kích thớc khoảng 230bp (Hình 3; Bảng 3). Xuất phát từ cùng một hàm lợng ADN làm khuôn (khoảng 100 ng) để chạy phản ứng PCR, ở máu ngoại vi chúng tôi phải tiến hành PCR 2 lần, nhng ở tổ chức sinh thiết khối u chỉ tiến hành PCR một lần và điện di 4àl sản phẩm PCR so với điện di 10àl sản phẩm PCR ở máu ngoại vi. Kết quả là: sản phẩm PCR chạy từ sinh thiết khối u có băng ADN đậm hơn rất nhiều so với băng ADN - LMP1 là sản phẩm PCR đã chạy điện di từ máu ngoại vi. Kết quả này hoàn toàn đúng với lý thuyết cho rằng: hàm lợng ADN - EBV ở trong mô sinh thiết cao hơn rất nhiều so với ở máu ngoại vi. Trong 25 mẫu sinh thiết (gồm 5 mẫu bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải là UTVMH và 20 mẫu sinh thiết vòm bệnh nhân UTVMH) đều có gien LMP1 - EBV. Theo kết quả nghiên cứu của tác giả Nghiêm Đức Thuận [3]: trong tổng số 47 bệnh nhân UTVMH thể không biệt hoá phát hiện thấy có 85,11% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng (tác giả sử dụng cặp mồi EBNA - 2A). Tiếp tục sử dụng sản phẩm PCR với cặp mồi EBNA - 2A làm ADN dò cho kỹ thuật lai dot - blot thì tác giả phát hiện thấy 95,74% trờng hợp có ADN - EBV trong mẫu sinh thiết khối u vòm họng. Và phải tiến hành kỹ thuật RT - PCR với mồi EBNA - 1 tác giả mới xác định đợc 100% trờng hợp có hoạt tính mARN - EBV. Hơn nữa, đối với nhóm chứng bao gồm ung th đầu, cổ không phải UTVMH, tác giả Nghiêm Đức Thuận phát hiện đợc 3/ 11 trờng hợp có ADN - EBV (trong đó có 2/ 11 trờng hợp là ung th amidan khẩu cái, còn 1/ 11 trờng hợp là ung th sàng hàm). Điều này cho phép nghĩ rằng cặp mồi LMP1 chúng tôi sử dụng có độ nhạy nhng khi so sánh các cặp mồi EBNA - 2A, EBNA - 1 và LMP1 thì có lẽ EBNA - 1 đặc hiệu với UTVMH ở nớc ta hơn so với EBNA - 2A và LMP1. Tuy nhiên, một điều đặc biệt là trong 20 mẫu sinh thiết UTVMH, có 16 mẫu đơn ADN (80%) tách từ mô sinh thiết khối u vòm họng 95 TCNCYH 23 (3) 2003 của bệnh nhân UTVMH đợc nhân lên có độ dài khoảng 200bp và có 2 cặp mẫu (cả của máu ngoại vi và sinh thiết vòm họng). Nh vậy, có tất cả 18 mẫu sinh thiết khối u vòm họng sau khi chạy điện di sản phẩm PCR có đoạn gien LMP1 khoảng 200bp. Trên điện di, sản phẩm PCR của máu ngoại vi, của bệnh nhân ung th đầu, cổ không phải UTVMH, của bệnh nhân UTVMH và khi làm điện di song song các mẫu này thì thấy rằng: trong lúc các mẫu máu ngoại vi ngời bình thờng, máu ngoại vi ngời UTVMH (18/ 20 mẫu) và mô sinh thiết bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH đều chỉ thấy sản phẩm quãng 230bp thì 16 mẫu đơn sinh thiết vòm của bệnh nhân UTVMH và 2 cặp mẫu thấy sản phẩm quãng 200bp (tổng số là 18/ 20 mẫu) (Hình 4.A; Hình 4.B). Điều này khiến chúng tôi suy nghĩ là đã có đột biến mất đoạn ở gien LMP1 - EBV, khoảng 30bp hay ít, nhiều hơn. So sánh với kết quả một số tài liệu của những nớc có tần suất UTVMH rất cao, cao hơn cả nớc ta, cho thấy: 92% gien LMP1 có mặt trong mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH Trung Quốc trong đó có 82% gien LMP1 của những bệnh nhân này có đột biến mất 10 amino acid ở vị trí 346 - 355 acid amin hoặc đột biến mất 3bp từ vị trí 168287 - 168256 nucleotid ở đầu -C tận [10]. 100% gien LMP1 tách từ sinh thiết vòm của bệnh nhân Đài Loan bị UTVMH có đột biến mất 30bp [4]. 93% (34/ 37 ca dơng tính) gien LMP1 tách từ mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân UTVMH Hồng Kông bị UTVMH có đột biến mất 10 amino acid từ vị trí 346 - 355 hoặc đột biến mất 30bp từ vị trí 168285 - 168256 nucleotid ở đầu -C tận [5][6]. 76,2% gien LMP1 tách từ mô sinh thiết khối u vòm họng của bệnh nhân Guangxi và Shanhai bị UTVMH có đột biến mất 30bp [10]. Khi nghiên cứu chung với số mẫu lớn ở ngời Châu á, tỷ lệ đột biến mất 30bp của gien LMP1 là 86% (với số mẫu nghiên cứu là 187 mẫu). Bảng 4: So sánh tỷ lệ chủng EBV có gien LMP1 đột biến mất khoảng 30bp của bệnh nhân UTVMH Việt Nam so với một số nớc khác trên thế giới STT LMP1 Nớc LMP1 đột biến mất khoảng 30bp LMP1 không bị đột biến mất khoảng 30bp 1 Nga 0% (0/ 6 mẫu) 100% (6/ 6 mẫu) 2 Trung Quốc 84% (36/ 47 mẫu) 16% (7/ 47 mẫu) 3 Việt Nam 90% (18/ 20 mẫu) 10% (2/20 mẫu) 4 Hồng Kông 92% (34/ 37 mẫu) 8% (3/37 mẫu) 5 Đài Loan 100% 0% Những kết quả này cho thấy chủng EBV có gien LMP1 đột biến mất 30bp nhiều nhất là ở Đài Loan. Một điều đặc biệt là không thấy có đột biến mất 30bp của gien LMP1 ở bệnh nhân UTVMH gốc Nga, tuy nhiên vẫn thấy đột biến này ở bệnh nhân mắc bệnh Hodgkin [9]. Trong 5 mẫu sinh thiết chứng (lấy từ các bệnh nhân ung th amidan khẩu cái và ung th hạ họng thanh quản) đều phát hiện thấy ADN - EBV với hàm lợng rất cao, tuy rằng gien LMP1 - EBV không bị đột biến giống nh ở bệnh nhân UTVMH. Nh vậy, phải chăng EBV trong các mẫu sinh thiết này có liên quan với bệnh sinh hay chỉ là từ tế bào máu có trong khối u? Nhận xét này cũng mở ra một nghiên cứu mới có thể tiến hành trong tơng lai. 96 TCNCYH 23 (3) 2003 Nh vậy, tiến hành kỹ thuật PCR và PCR lồng với cặp mồi để nhân đoạn gien LMP1 - EBV không những phát hiện đợc sự có mặt ADN - EBV ở trong cơ thể ngời khoẻ mạnh, ở bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH và bệnh nhân UTVMH mà còn phát hiện đợc đột biến mất đoạn của gien LMP1 - EBV xảy ra phổ biến ở bệnh nhân UTVMH. 3. Đánh giá mối liên quan giữa đột biến mất đoạn của gien LMP1 trong định hớng chẩn đoán sớm và tiên lợng UTVMH Kiểu hình nhiễm EBV ở thể tiềm ẩn đợc chia làm 3 nhóm (týp I, II và III) tuỳ theo sự biểu lộ của 10 gien tiềm ẩn. Thể tiềm ẩn của týp I chỉ có EBER và EBNA1 đợc biểu lộ nh ở u lympho Burkitt. ở týp III, toàn bộ gien tiềm ẩn đợc biểu lộ nh ở trong tế bào biến chuyển (LCL). ở týp II, LMP1, LMP2A và LMP2B cộng thêm EBER và EBNA1 của týp I đợc biểu lộ nh trong UTVMH và bệnh Hodgkin. Ngời ta biết rõ là thể không biệt hoá (UCNT) và ít biệt hoá của UTVMH thờng có liên quan với vai trò của LMP1. Theo nghiên cứu của Đỗ Hoà Bình và cộng sự (số liệu đã gửi trên tạp chí Nghiên cứu y học, 2002): bằng phơng pháp hoá miễn dịch mô và miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, tác giả thấy rằng protein LMP1 đợc biểu lộ ở 53/ 80 trờng hợp (66%), trong khi đó có 27/ 80 (37%) trờng hợp không biểu lộ LMP1. Hơn nữa, trong 44 trờng hợp biểu lộ LMP1 có tới 33 trờng hợp (75%) đã đáp ứng rất tốt sau xạ trị (u tan, hết hạch), mặc dù trớc đó hạch lan rộng. Tỷ lệ tái phát sớm và di căn của nhóm này là 14/ 44 (25%). Ngợc lại, trong số 21 trờng hợp không biểu lộ LMP1, chỉ có 7 trờng hợp có dấu hiệu tiên lợng tốt nh nhóm có LMP1 dơng tính, còn lại 14/ 21 trờng hợp (67%) có tiên lợng xấu, với đáp ứng sau xạ trị kém (u thu nhỏ một phần, hạch còn tồn tại), có biểu hiện tái phát sớm sau < 6 tháng và di căn nhiều nơi, mặc dù trớc đó u và hạch không lan rộng nh nhóm LMP1 dơng tính. Nh vậy, những trờng hợp có LMP1 dơng tính thì cùng với u, hạch có xu hớng lan rộng hơn những trờng hợp âm tính với LMP1, nhng tiên lợng vẫn tốt hơn. Nhận xét này gợi ý có thể xem protein LMP1 nh là một dấu ấn EBV có giá trị, góp phần tiên lợng UTVMH. Kết quả của chúng tôi cho thấy 100% bệnh nhân UTVMH đều có gien LMP1 trong đó 90% có đột biến mất đoạn; nhng tác giả Đỗ Hoà Bình khi nghiên cứu 80 trờng hợp thì sản phẩm chỉ biểu lộ protein LMP1 ở 66% trờng hợp. Nh vậy rõ ràng rằng từ gien đến sản phẩm gien còn có nhiều cơ chế khác chi phối. Không những thế, theo tác giả Đỗ Hoà Bình, 75% bệnh nhân biểu lộ protein LMP1 có tiên lợng tốt, 25% là tiên lợng xấu. Còn theo kết quả của chúng tôi chỉ có 10% gien LMP1 không đột biến, còn 90% gien LMP1 là đột biến. Nh vậy, dù là gien LMP1 có đột biến nhỏ hay không đột biến thì có lẽ nó vẫn có tính sinh miễn dịch và đợc nhận biết bởi tế bào T diệt đặc hiệu khối u (cytotoxic T - lymphocyte - CTL). V. Kết luận Bằng kỹ thuật PCR và PCR lồng, sử dụng hai cặp mồi đặc hiệu cho gien LMP1, chúng tôi không những phát hiện đợc sự có mặt của gien LMP1 ở máu ngoại vi ngời khoẻ mạnh; máu ngoại vi và tổ chức sinh thiết bệnh nhân UTVMH; tổ chức sinh thiết bệnh nhân ung th vùng đầu, cổ không phải UTVMH mà còn phát hiện đợc đột biến mất đoạn gien LMP1 EBV ở bệnh nhân UTVMH, do đó loại tế bào u khỏi cơ thể. Tài liệu tham khảo 1. Phan Thu Anh, Đỗ Hoà Bình, Phan Thị Phi Phi và cs.: Huyết thanh học chống VCA, EA ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng, Y học Việt Nam. 1991, 158: 129 - 132. 2. Phan Thu Anh, Phan Thị Phi Phi, Đỗ Hoà Bình và cs.: Góp phần nghiên cứu ung th vòm mũi họng ở Việt Nam. Tình hình nhiễm EBV ở một số lứa tuổi ngời dân Việt Nam, Y học thực hành. 1987, 5- 6: 41 - 42. 3. Nghiêm Đức Thuận : Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học ung th vòm mũi họng và hoạt tính của gen virút Epstein - Barr trong UTVMH, Luận văn Tiến sỹ Y học. 2001. 4. Chang Y. S., Su I. J., Chung P. J., Shu C. H., Ng C. K., Wu S. J., Liu S. T.: Deletion 97 TCNCYH 23 (3) 2003 of an Epstein - Barr virus variant in T - cell lymphoma tissues identical to the distinct strain observed in nasopharyngeal carcinoma in the Taiwanese population, Int. J. Cancer. 1995, 62: 673 - 677. 5. Cheung S. T., Lo K. W., Leung S. F., Chan W. Y., Choi P. H., Johnson P. J., Lee J. C., Huang D. P.:Prevalance of LMP1 deletion variant of Epstein-Barr virus in nasopharyngeal carcinoma and gastric tumor in Hong Kong, Int. J. Cancer. 1996, 66: 711 - 712. 6. Cheung Siu - Tim, Leung Sing - Fai, Lo Kwok - Wai, Chui K. W., Tam J. S. L., Fok T. F., Johnson Philip J.: Specific latent membrane protein 1 gene sequences in type 1 and type 2 Epstein-Barr virus from nasopharyngeal, Int. J. Cancer.1998, 76: 399 - 406. 7. Hu Lifu : Nasopharyngeal carcinoma and Epstein - Barr virus, LuËn ¸n TiÕn sü. 1996. 8. Kee-Ching G.Jeng, Chen-Yi Hsu, Ming-Tsung Liu, Tsung-Te Chung, Shih-Tung Liu: Prevalence of Taiwan variant of Epstein- Barr virus in throat washings from patients with head and neck tumors in Taiwan, Journal of Clinical microbiology, Vol.32, No.1: 28-31. 9. Peter Hahn, Elena Novikova, Liana Scherback, Constatin Janik, Oleg Pavlish, Viktor Arkhipov, John Nicholis, Nikolaus Muller - Lantzsch, Vladimir Gurtsevitch and Friendrich A. Grasser ; The LMP1 gene isolated from Russian nasopharyngeal carcinoma has no 30bp deletion, Int. J. Cancer. 2001, 91: 815 - 821. 10. Xiao - Shi Zhang, Kun - Hua Song, Hai - Quiang Mai, Wei - Hua Jia et al: The 30 - bp deletion variant: a polymorphism of latent membrane protein 1 prevalent in endemic and non - endemic areas of nasopharyngeal carcinoma in China, Cancer Letters. 2002, 176: 65 - 73. Summary The prevelance and deleted mutations of LMP1 - EVB gene in UCNT - NPC patients The aim of this study is to investigate the prevalence of LMP1 gene. We have studied on 20 couple samples of nasopharyngeal carcinoma patients (included blood and biopsy); 5 patients with other head and neck tumor and 30 blood samples of healthy persons. The primers located from position 168592 to 168174 and from 168373 to 168174 of the strain HEHS B95 – 8 were used. Our finding indicated that: 1. The prevalence of LMP1 - EBV gene in peripheral blood of healthy persons are 96.7% (29/ 30 positive cases). 2. Prevalent LMP1 - EBV gene in 20 UCNT nasopharyngeal carcinoma patients are 100% (20/ 20 positive cases). 3. Prevalence LMP1 - EBV gene in patients with other head and neck tumor are 100% (5/ 5 positive cases). 4. On the electrophoresis showed that 90% biopsies of nasopharyngeal carcinoma patients having deletion in LMP1 gene. 98 . lệ gien LMP1 đột biến mất 30bp ở mô sinh thiết Bảng 3: Phát hiện gien LMP1 đột biến mất đoạn bằng kỹ thuật PCR Đối tợng % gien LMP1 đột biến mất đoạn. TCNCYH 23 (3) 2003 Tần suất và sự đột biến mất đoạn gien lmp1 ở bệnh nhân ung th vòm mũi họng Phạm Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi