Xác định đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư trực tràng tại việt nam

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN TRÊN GEN KRAS Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG TẠI VIỆT NAM Giáo viên hướng dẫn : TS NGUYỄN HUY HOÀNG Sinh viên thực : NGHIÊM THỊ BÍCH HẠNH Lớp : 11 -04, CNSH HÀ NỘI, - 2015 LỜI CÁM ƠN Lời xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Phó Viện trưởng, Trưởng phòng Hệ gen học chức năng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam – Người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ chia sẻ khó khăn cho suốt trình thực nghiên cứu hoàn thành khóa luận Tôi xin gửi lời cám ơn đặc biệt đến TS Nguyễn Thị Kim Liên - Phó phòng Hệ gen học chức theo sát giúp đỡ bảo cho suốt trình tiến hành thí nghiệm Qua biết ơn tất cô, anh, chị phòng dạy bảo nhiều điều thời gian thực tập phòng Tôi chân thành cám ơn thầy cô giáo giảng dạy Khoa Công nghệ Sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội truyền đạt cho kiến thức quý báu bổ ích suốt năm học vừa qua Cuối xin gửi lời tri ân tới bố mẹ, người thân gia đình bạn bè xung quanh chia sẻ khó khăn thử thách sống công việc để có kết Tôi xin chân thành cám ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng năm 2015 Sinh viên Nghiêm Thị Bích Hạnh Nghiêm Thị Bích Hạnh i Lớp 11 - MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG BIỂU vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1.1.Ung thư đại trực tràng 1.1.1 Khái niệm ung thư 1.1.3.Các nguyên nhân yếu tố nguy dẫn đến ung thư đại trực tràng 1.1.4 Chẩn đoán điều trị ung thư đại trực tràng 1.1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng sinh hóa 1.1.4.2 Chẩn đoán phương pháp sinh học phân tử 1.1.4.3.Điều trị bệnh ung thư đại trực tràng 1.1.5.2 Tình hình ung thư đại trực tràng Việt Nam 1.2 Gen KRAS 1.2.1 Cấu trúc gen KRAS 1.2.2 Chức năng, vai trò gen KRAS việc đáp ứng điều trị với liệu pháp phân tử đích 11 1.2.3 Tình hình nghiên cứu đột biến gen KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng giới Việt Nam 12 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1.Vật liệu hóa chất 14 2.1.1 Vật liệu 14 2.1.2 Hóachất 14 2.1.3 Thiết bị 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 16 2.2.2 Điện di DNA gel agarose 18 2.2.3 Đo quang phổ DNA 19 Nghiêm Thị Bích Hạnh ii Lớp 11 - 2.2.4.1 Nguyên lí kỹ thuật PCR 20 2.2.4.2.Nhân đoạn gen KRAS kỹ thuật PCR 21 2.2.5.Tinh sản phẩm PCR 22 2.2.6 Giải phân tích trình tự gen KRAS 23 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 3.1 Thu thập mẫu máu 25 3.2 Tách chiết DNA tổng số 25 3.3 Xác định nồng độ độ tinh mẫu DNA 26 3.4 Phản ứng PCR nhân gen 27 3.5 Thôi gel tinh sản phẩm PCR 28 PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 4.1 Kết luận 35 4.2 Kiến nghị 36 Nghiêm Thị Bích Hạnh iii Lớp 11 - DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT aa Amino acid bp Base pairs DNA Axit deoxyribonucleic CRC Colorectal cancer cDNA Complementary DNA dNTP Deoxynucleotit triphosphat ddNTP Dideoxynucleotide EGFR Epidermal growth factor receptor E.coli Escherichia coli EtBr Ethidium Bromide EMEA Europe, the Middle East and Africa G Guanine GDP Guanosine-5-Diphosphate GTP Guanosine-5-Triphosphat Kb Kilô bazơ kDa Kilô Dalton M Marker PCR Polymerase chain reaction Taq Thermus aquaticus Tm Nhiệt độ nóng chảy UV Ultraviolet WHO World health oganization PFS Progression free survival KRAS Kirsten – ras/V – ki – ras kirsten rat sarcomaviral oncogene homolog OD Nghiêm Thị Bích Hạnh Optical Density iv Lớp 11 - Kí hiệu viết tắt axit amin A Ala Alanine D Asp Axit aspartic C Cys Cysteine G Gly Glycine K Lys Lysine M Met Methionine T Thr Threonine V Val Valine Nghiêm Thị Bích Hạnh v Lớp 11 - DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1: Trình tự cặp mồi dùng cho PCR 14 Bảng 2: Thành phần phản ứng 21 Bảng 3: Kết đo quang phổ mẫu DNA tổng số 26 Nghiêm Thị Bích Hạnh vi Lớp 11 - DANH MỤC HÌNH Hình1 Cấu trúc ruột già Hình Vị trí gen K-RAS nhiễm sắc thể 12 10 Hình Mô hình protein KRAS với vùng quan trọng đánh dấu 11 Hình Sơ đồ phương pháp nghiên cứu 16 Hình Các bước tách chiết DNA 17 Hình Điện di kiểm tra DNA tổng số gel agarose 0,8% 25 Hình DNA nhân cặp mồi KR1có kích thước 445bp 27 Hình DNA nhân cặp mồi KR2 có kích thước 297bp 28 Hình DNA nhân cặp mồi KR3 có kích thước 375bp 28 Hình 10 Đột biến dị hợp tử M67V bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17 29 Hình 11 Đột biến dị hợp tử V103D bệnh nhân KR7 30 Hình 12 Đột biến dị hợp tử M111K bệnh nhân KR7, 30 Hình 13 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 67; B: cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí M67V 32 Hình 14 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 103; B: Cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí V103D 32 Hình 15 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 111; B: Cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí M111K 33 Nghiêm Thị Bích Hạnh vii Lớp 11 - MỞ ĐẦU Theo báo cáo thường niên Viện nghiên cứu ung thư Hoa Kỳ, hàng năm giới có thêm khoảng 12 triệu ca ung thư khoảng 7,6 triệu ca tử vong, tức trung bình ngày có 200 nghìn bệnh nhân ung thư tử vong Riêng khu vực Đông Đông Nam Á, có Việt Nam hàng năm có thêm khoảng 3,6 triệu ca ung thư với khoảng 2,5 triệu bệnh nhân tử vong [34] Ung thư đại trực tràng (Colorectal cancer – CRC) loại ung thư hay gặp đứng hàng thứ nữ hàng thứ nam giới giới [17] Đây nguyên nhân gây tử vong đứng hàng thứ sau ung thư phổi, ung thư dày ung thư gan giới [25] Là ung thư đường tiêu hóa có tiên lượng tốt Tuy nhiên, phát muộn giống tất loại ung thư khác, khả điều trị hiệu Vì vậy, cần phát ung thư giai đoạn sớm tổn thương tiền ung thư [29] Theo WHO (năm 2008), năm có khoảng 7,6 triệu người chết ung thư toàn giới, có khoảng 70% ca tử vong xảy nước có thu nhập thấp trung bình, có khoảng 30% ca ung thư ngăn chặn Một đặc điểm bật ung thư đại trực tràng có biểu cao thụ thể tăng trưởng biểu bì (Epidermal Growth Factor Receptor – EGFR) Nghiên cứu cho thấy việc điều hòa trình truyền tín hiệu từ thụ thể EGFR tới nhân tế bào có tham gia tích cực nhóm protein mang hoạt tính GTPase bật KRAS Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy có khoảng 25 - 40% bệnh nhân ung thư đại trực tràng mang đột biến gen KRAS Đồng thời thử nghiệm lâm sàng khẳng định cetuximab panitumumab (những thuốc định điều trị ung thư đại trực tràng nay) thật có tác dụng kéo dài thời gian sống thời gian sống không bệnh cho bệnh nhân không mang đột biến gen KRAS Điều có nghĩa việc chẩn đoán đột biến gen KRAS điều bắt buộc trước cân nhắc định phác đồ điều trị đích sử dụng thuốc ức chế EGFR (cetuximab panitumumab) cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng [35] Nghiêm Thị Bích Hạnh Lớp 11 - Những năm gần với phát triển mạnh mẽ sinh học phân tử, bệnh nhân ung thư việc chữa trị phương pháp điều trị truyền thống phẫu thuật, hóa trị, xạ trị họ hướng dẫn điều trị theo liệu pháp hiệu hơn, độc hại hơn, “ liệu pháp phân tử đích” Liệu pháp cho thấy có nhiều ưu điểm, đặc biệt bệnh nhân điều trị hóa học thất bại, liệu pháp tác dụng phụ ít, sử dụng kết hợp liệu pháp với phương pháp hóa học giúp kéo dài sống cho bệnh nhân KRAS proto – oncogene liên quan đến nhiều loại bệnh ung thư KRAS mã hóa cho GTPase nhỏ gồm 188 189 aa, tham gia vào trình truyền tín hiệu nội bào KRAS nằm đường truyền tín hiệu EGFR Protein KRAS hoạt động công tắc phân tử đường truyền tín hiệu nội bào quy định chức quan trọng cho tiến triển tế bào, bao gồm biệt hóa, phát triển chết theo chu trình Các đột biến gen KRAS dẫn đến hoạt động GTPase protein KRAS bị suy giảm, GTP không bị cắt thành GDP, hoạt động truyền tín hiệu protein KRAS diễn liên tục mà không cần tới có mặt kích thích đường truyền tín hiệu EGFR/HER [27] Đột biến gen KRAS xuất sớm ung thư đại trực tràng chiếm khoảng 30 - 40% [3] Vì vậy, bệnh nhân có đột biến gen KRAS có phản ứng điều trị với thuốc ức chế EGFR Đột biến gen KRAS thường xuyên codon 12, 13, 61 146 [6] Các phương pháp xác định đột biến chủ yếu sinh học phân tử như: tiến hành khuếch đại đoạn gen mong muốn nhờ mồi đặc hiệu, đọc trình tự đoạn nhân lên tìm đột biến Trong nghiên cứu đề tài này, với mong muốn hướng tới áp dụng liệu pháp điều trị đích cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng người bệnh Việt Nam, trước hết nghiên cứu cần tìm hiểu đột biến gen KRAS, vùng đột biến thường xuyên xuất hiện, kiểu đột biến, phương pháp kỹ thuật áp dụng để tìm đột biến, để từ bác sĩ đưa phác đồ điều trị thích hợp cho bệnh nhân cụ thể giúp giảm thời gian chi phí điều trị cho bệnh nhân Xuất phát từ vấn đề trên, khóa luận: “Xác định đột biến gen KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam” tiến hành với nội dung nghiên cứu bao gồm: Nghiêm Thị Bích Hạnh Lớp 11 - 3.3 Xác định nồng độ độ tinh mẫu DNA Sau tiến hành điện di kiểm tra, mẫu DNA tổng số đo OD bước sóng 260nm 280nm để xác định nồng độ DNA kiểm tra độ tinh Các bazơ nitơ hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại bước sóng 260nm Giá trị mật độ quang bước sóng 260nm (A260nm) mẫu đo cho phép xác định nồng độ DNA mẫu theo công thức nêu phần phương pháp: CDNA(ng/µl)= A260nm× 50 × độ pha loãng Để kiểm tra độ tinh dung dịch, đo thêm giá trị mật độ quang bước sóng 280nm (A280nm) 280nm bước sóng protein có mức hấp thụ cao Một dung dịch DNA xem tỷ số A260nm/A280nm DNA nằm khoảng 1,8 – Bảng 3: Kết đo quang phổ mẫu DNA tổng số Stt Mẫu Kết đo quang phổ mẫu máu DNA tổng số tách theo kit A260 A280 CDNA(ng/µl) A260nm/A280nm KR1 0,0268 0,0135 78 1,99 KR2 0,027 0,015 88 1,8 KR3 0,0252 0,013 102 1,94 KR6 0,0146 0,0073 79 KR7 0,023 0,0117 101 1,97 KR8 0,022 0,0114 97 1,93 KR9 0,025 0,0138 89 1,81 KR10 0,0256 0,0137 99 1,87 KR11 0,0236 0,013 95 1,82 10 KR12 0,020 0,0102 100 1,96 11 KR13 0,021 0,0116 94 1,81 12 KR14 0,022 0,012 92 1,83 13 KR15 0,0168 0,0086 89 1,95 14 KR16 0,021 0,011 103 1,91 15 KR17 0,015 0,0078 80 1,92 Kết cho thấy mẫu DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm có độ tinh cao đủ điều kiện làm khuôn cho phản ứng PCR Nghiêm Thị Bích Hạnh 26 Lớp 11 - 3.4 Phản ứng PCR nhân gen DNA mẫu nghiên cứu nhân đoạn PCR với cặp mồi ghi bảng Trong ba cặp mồi sử dụng nghiên cứu, cặp mồi KR1, KR2, KR3 dùng để nhân đoạn exon 1, 2, có kích thước tương ứng 445 bp, 297 bp 375 bp Nồng dộ dNTP phụ thuộc nhiều vào kích thước đoạn DNA cần nhân bản, nồng độ buffer nồng độ mồi Việc bổ sung dNTP nhiều làm giảm nhiệt độ nóng chảy, giảm hoạt động DNA polymerase Đối với phản ứng PCR, việc xây dựng chu trình nhiệt phù hợp yếu tố quan trọng nhất, yếu tố nhiệt độ đảm bảo cho giãn xoắn phân tử DNA, việc gắn mồi kéo dài chuỗi Chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng PCR trình bày mục 2.2.4.2 Ngoài yếu tố khác không phần quan trọng nhiệt độ gắn mồi Nhiệt độ gắn mồi tùy thuộc vào loại mồi cụ thể tính toán dựa nhiệt độ nóng chảy (Tm) đoạn mồi: Tm =20C × (A+T) + 40C × (G+C) + 3,30C A, T, G, C: bazơ nitơ Sau tính nhiệt độ Tm theo lý thuyết, tiến hành chạy PCR nhiệt độ gắn khác chọn nhiệt độ gắn tối ưu 600C thời gian phút Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR với cặp mồi số mẫu thể hình sau: Hình DNA nhân cặp mồi KR1có kích thước 445 bp M: Marker DNA chuẩn kb; 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15: Sản phẩm PCR mẫu máu Nghiêm Thị Bích Hạnh 27 Lớp 11 - Hình DNA nhân cặp mồi KR2 có kích thước 297 bp M: Marker DNA chuẩn kb; 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 ,11, 12, 13: Sản phẩm PCR mẫu máu Hình DNA nhân cặp mồi KR3 có kích thước 375 bp M: Marker DNA chuẩn kb;1, 2: sản phẩm PCR mẫu máu Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy nhân đoạn đặc hiệu cho exon 1, 2, mẫu nghiên cứu với kích thước dự kiến Sản phẩm PCR có băng gọn rõ nét, đạt chất lượng số lượng để giải trình tự 3.5 Thôi gel tinh sản phẩm PCR Trên cột gel có màng chứa phân tử lực cao với DNA, cho dịch có chứa DNA qua cột, DNA cố định màng thành phần khác qua màng loại bỏ Khi bổ sung nước vào màng, DNA hòa tan thu lại vào ống cách ly tâm tốc độ cao (13000 vòng/phút) Nghiêm Thị Bích Hạnh 28 Lớp 11 - Dịch chứa DNA quan tâm (ví dụ, sản phẩm PCR) điện di agarose 0,8 % cắt lấy băng quan tâm Sau gel làm (thôi gel) theo hướng dẫn kit gel hãng Thermo cung cấp Sau gel điện di lại cho kết mẫu đạt chất lượng số lượng cho giải trình tự gen 3.6 Giải phân tích trình tự DNA Sản phẩm DNA tinh đọc trình tự cặp mồi nêu mục 2.1.2 Kết giải trình tự gen đưa lên phần mềm tin học BioEdit Trên phần mềm này, tiến hành so sánh trình tự DNA đọc với trình tự gen KRAS chuẩn ngân hàng gen người.Kết giải trình tự mẫu nghiên cứu phân tích phần mềm BioEdit so sánh với trình tự gen KRAS chuẩn người www.ensembl.org mã số ENSG00000133703 Kết phân tích trình tự ba đoạn exon khảo sát nghiên cứu cho thấy, số 15 mẫu nghiên cứu phát đột biến bệnh nhân KR7, KR9, KR10, KR11, KR12, KR14, KR15 KR17 (Hình 10, 11, 12) Hình 10 Đột biến dị hợp tử M67V bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17 Nghiêm Thị Bích Hạnh 29 Lớp 11 - Hình 11 Đột biến dị hợp tử V103D bệnh nhân KR7 Hình 12 Đột biến dị hợp tử M111K bệnh nhân KR7, Các đột biến gen KRAS dẫn đến thay đổi amino acid protein KRAS bệnh nhân Sự thay A>G vị trí 199 cDNA bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17 dẫn đến thay acid amin M67V (ATG>GTG) protein KRAS Sự thay A>T vị trí 308 cDNA bệnh nhân KR7 dẫn đến thay acid amin V103D (GAT>GTT) protein KRAS Sự thay T>A vị trí 332 cDNA bệnh nhân KR7, dẫn đến thay acid amin M111K (ATG>AAG) Như vậy, bệnh nhân tham gia nghiên cứu chưa xác định đột biến ảnh hưởng đến hiệu điều trị công bố nghiên cứu trước vị trí codon 12, 13, 61, 146 Kết số lượng bệnh nhân Nghiêm Thị Bích Hạnh 30 Lớp 11 - tham gia vào nghiên cứu chưa nhiều Tuy nhiên, kết phù hợp với tỷ lệ xảy đột biến gen KRAS 30 – 40% bệnh nhân ung thư đại trực tràng [23], [2] Theo Ren đồng tác giả [21], nghiên cứu 4687 bệnh nhân ung thư đại trực tràng phát khoảng 29% bệnh nhân mang đột biến codon 12, 13 phát bệnh nhân mang đột biến codon 61 Đột biến codon 61, 146 154 xác định chiếm 1% bệnh nhân ung thư đại trực tràng [9] Bên cạnh Janakiraman đồng tác giả [16], xác định đột biến vị trí khác Q22K, E31K K117N KRAS bệnh nhân ung thư đại trực tràng Tuy nhiên, ảnh hưởng đột biến lên khả đáp ứng điều trị bệnh nhân chưa nghiên cứu Người ta xác định bốn vùng RAS protein: Vùng thứ bao gồm 85 amino acid đầu N hình thành nên ba dạng họ RAS protein (KRAS, NRAS HRAS) Vùng thứ hai bao gồm 80 amino acid có tương đồng trình tự thấp (70 – 80%) Những vùng quan trọng chức truyền tín hiệu protein KRAS hình thành nên vùng G-domain (amino acid – 165) Vùng G-domain protein KRAS gồm vùng liên kết GTP, vòng liên kết P-loop-phosphate (amino acid 10 – 16 56 – 59) phản ứng với b-phosphate cphosphate GTP Vùng 116 – 119 152 -165 phản ứng với base guanine Vị trí M67 V103 nằm vùng xoắn α helicase B C cấu trúc phân tử protein KRAS Phân tích ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS cho thấy đột biến M67V, V103D, M111K làm thay đổi đáng kể cấu trúc không gian protein KRAS vị trí (Hình 13, 14, 15) Đặc biệt, đột biến vị trí M67V làm xuất thêm cầu nối hydro với amino acid vị trí 67(Hình 13B) Nghiêm Thị Bích Hạnh 31 Lớp 11 - Hình 13 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 67; B: cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí M67V Hình 14 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 103; B: Cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí V103D Nghiêm Thị Bích Hạnh 32 Lớp 11 - Hình 15 Ảnh hưởng đột biến lên cấu trúc 3D phân tử protein KRAS A: Cấu trúc bình thường protein KRAS vị trí 111; B: Cấu trúc protein KRAS bị đột biến vị trí M111K Nghiên cứu Jancik đồng tác giả [16], cho thấy, đột biến kích hoạt gen KRAS làm chức bật tắt từ chế độ hoạt động sang chế độ bất hoạt protein KRAS, dẫn đến làm thay đổi tế bào làm tăng khả kháng với liệu pháp hóa học liệu pháp điều trị đích với chất ức chế thụ thể EGFR Protein KRAS trì bất hoạt liên kết với GTP Sự bật tắt từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động điều hòa tín hiệu nội bào Khi GTP gắn vào protein KRAS, làm biến đổi hình dạng hai vùng protein KRAS khiến chuyển sang trạng thái hoạt động Đây hai vùng quan trọng biết đến vùng “Switch I” (amino acid 30 – 38) vùng “Switch II” (amino acid 59 – 67), hình thành nên vòng phản ứng lại kích thích, điều khiển đặc trưng liên kết GTPase với phân tử phản ứng kích thích Vùng “Switch I II” đóng vai trò quan trọng liên kết yếu tố điều hòa yếu tố ảnh hưởng [31] Sự thay đổi hình dạng protein KRAS ảnh hưởng đến phản ứng với vùng multiple downstream transducers - GTPase-activating proteins (GAPs) làm tăng hoạt tính GTPase phân tử RAS protein lên 100 000 lần [12] Sự thay đổi ảnh hưởng đến phản ứng với yếu tố guanine – exchanging/releasing Nghiêm Thị Bích Hạnh 33 Lớp 11 - (GEFs/GRFs) đẩy mạnh giải phóng GTP Protein KRAS có chất GTPase kích thích GAPs hoạt động đồng hồ bấm liên quan tới phản ứng trực tiếp với yếu tố ảnh hưởng [10] Các đột biến bất thường protein KRAS làm tác dụng điều hòa nhiều yếu tố, ảnh hưởng đến vài đường quan trọng tế bào Kết nghiên cứu cho thấy, bên cạnh đột biến xác định rõ ảnh hưởng hiệu điều trị đột biến codon 12, 13, 146 161, đột biến điểm vùng Switch I, II hay vùng G ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính protein KRAS Vì vậy, đột biến xác định bệnh nhân ung thư đại trực tràng Việt Nam đột biến công bố cần nghiên cứu sâu ảnh hưởng chúng lên kết điều trị bệnh nhân ung thư đại trực tràng Nghiêm Thị Bích Hạnh 34 Lớp 11 - PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã thu thập tách chiết DNA tổng số 15 mẫu máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng tiến hành nhân đoạn exon 1, 2, gen KRAS với kích thước tương ứng 445 bp, 297 bp, 375 bp Đã tiến hành giải trình tự đoạn exon gen KRAS 15 bệnh nhân phát đột biến dị hợp tử M67V (199A>G ), (ATG>GTG) bệnh nhân KR10, 11, 12, 14, 15, 17; V103D (308A>T), (GAT>GTT) bệnh nhân KR7; M111K (332T>A), (ATG>AAG) bệnh nhân KR7, Đã tiến hành phân tích ảnh hưởng đột biến M67V, V103D, M111K lên cấu trúc 3D protein KRAS, kết đột biến vị trí M67V làm xuất thêm cầu nối hydro với amino acid vị trí 67 Nghiêm Thị Bích Hạnh 35 Lớp 11 - 4.2 Kiến nghị - Tiếp tục thu thập mẫu máu bệnh nhân mắc bệnh ung thư đại trực tràng - Tiến hành tách DNA, nhân đọc trình tự đoạn exon gen KRAS để tìm đột biến có ảnh hưởng đến hiệu điều trị đích Nghiêm Thị Bích Hạnh 36 Lớp 11 - TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Khuất Hữu Thanh (2004) Cơ sở di truyền phân tử kĩ thuật gene, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội Tài liệu nước Amado RG, Wolf M, Peeters M, Van cutsem E, Siena S, Freeman DJ, Juan T, Sikorski R, Suggs S, Radinsky R, Patterson SD, Chang DD (2008) Wildtype KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer J Clin Oncol 26: 1626-1634 Arrington AK, Heinrich EL,Lee W, Duldulao M, Patel S, Sanchez J, Garcia-Aguilar J, Kim J (2012) Prognostic and Predictive Roles of KRAS Mutation in Colorectal cancer Int J Mol Sci 13: 12153-12168 Baba Y, Nosho K, Shima K, et al (2011) Phosphorylated AKT expression is associated with PI3KCA mutation, low stage, and favorable outcome in 717 colorectal cancers Cancer 2011 Apr; 117(7): 1399-1408 Brink M, de Goeij AFPM, Weijenberg MP, Roemen GMJM, Pachen MMM, Smits KM, de Bruine AP, Goldbohm RA, van den Brandt PA (2003) K-ras oncogene mutations in sporadic colorectal cancer in the Netherlands Cohort Study Carcinogenesis 24: 703-710 Chretien AS, Harle A, Meyer-Lefebvre M, Rouyer M, Husson M, Ramacci C, Harter V, Genin P, Leroux A, Merlin JL (2013) Optimization of routine KRAS mutation PCR-based testing procedure for rational individualized first-linetargeted therapy selection in metastatic colorectal cancer Cancer Med 2: 11-20 Cunningham D, Atkin W, Lenz HJ, Lynch HT, Minsky B, Nordlinger B, Starling N (2010) Colorectal cancer Lancet 375 (9719): 1030–47 De Roock W, De Vriendt V, Normanno N, et al (2011) KRAS, BRAF, PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer Lancet Oncol; 12(6):594-603 De Roock W, Claes B, Bernasconi D, et al (2011) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA, and PTEN mutations: implications for targeted therapies in metastatic colorectal cancer Lancet Oncol; 12(6): 594-603 Nghiêm Thị Bích Hạnh 37 Lớp 11 - 10 Dienstmann R, Vilar E, and Tabernero J (2011) Molecular predictors of response to chemotherapy in colorectal cancer.Cancer J ; 17(6): 114-126 11 Forbes S, Clements J, Dawson E, Bamford S, Webb T, Dogan A, Flanagan A, Teague J, Wooster R, Futreal PA, Stratton MR (2006) Cosmic 2005 Br J Cancer 94: 318-322 12 Gideon P, John J, Frech M, Lautwein A, Clark R, Schefler JE, Wittinghofer A (1992) Mutational and kinetic analyses of the GTPase-activating protein (GAP)-p21 interaction: the C-terminal domain of GAP is not sufficient for full activity Molecular and Cellular Biology 12(5): 2050-2056 13 Giglione C, Parrini MC, Baouz S, Bernardi A, Parmeggiani A (1997) A new function of p120-GTPase-activating protein: prevention of the guanine nucleotide exchange factor-stimulated nucleotide exchange on the active form of Ha-Ras p21 Jounal of Biological Chemistry 272 (40): 25128-25134 14 Hagan S, Orr M, Doyle B (2013) Targeted therapies in colorectal cancer— anintegrative view by PPPM The EPMA Journal (4): 15 Janakiraman M, Vakiani E, Zeng Z, Pratilas CA, Taylor BS, Chitale D, Halilovic E, Wilson M, Huberman K, Filho JCR, Persaud Y, Levine DA, Fagin JA, Jhanwar SC, Mariadason JM, Lash A, Ladanyi M, Saltz LB, Heguy A, Paty PB, Solit DB (2010) Genomic and Biological Characterization of Exon KRAS Mutations in Human Cancer Cancer Res 70: 5901-5911 16 Jancik S, Drabek J, Radzioch D, Hajduch M (2010) Clinical Relevance of KRAS in Human Cancers Journal of Biomedicine and Biotechnology doi:10.1155/2010/150960 17 Jemal A, Bray, F, Center, MM, Ferlay, J, Ward, E, Forman, D (2011) Global cancer statistics CA: a cancer journal for clinicians 61 (2): 69–9 18 Lopez-Alcala C, Alvarez-Moya B, Villalonga P, Calvo M, Bachs O, Agell N (2008) Identification of Essential Interacting Elements in K-Ras/Calmodulin Binding and Its Role in K-Ras Localization Journal of Biological Chemistry 283: 10621-10631 Nghiêm Thị Bích Hạnh 38 Lớp 11 - 19 McGrath JP, Capon DJ, Smith DH (1983) Structure and organization of the human Ki-ras proto-oncogene and a related processed pseudogene Nature 304 (5926): 501– 06 20 Raponi M, Winkler H, Dracopoli NC (2008) KRAS mutations predict response to EGFR inhibitors Cur Opin Pharmacol 8: 413-418 21 Ren JJ, Li GX, Ge J, Li X, Zhao YS (2012) Is K-ras Gene Mutation a Prognostic Factor for Colorectal Cancer: A Systematic Review and Meta-analysis Dis Colon Rectum 55: 913-923 22 Sambrook, Maniatis, T., and Fritisch, E.F., (Eds) (1989) Molecular cloning: a laboratory manural, New York 23 Smith G, Carey FA, Beattie J, Wilkie Murray JV, Lightfoot TJ, Coxhead J R, Garner C, Steele RJC, Wolf CR (2002) Mutations in APC, Kirsten-ras, and p53alternative genetic pathways to colorectal cancer Proc Natl Acad Sci U S A 99: 9433-9438 24 Watson AJ, Collins, PD (2011) Colon cancer: a civilization disorder Digestive diseases (Basel, Switzerland) 29 (2): 222–8 25 WHO "Cancer" World Health Organization Retrieved January 5, 2011 26 Wicki A, Herrmann R, Christofori G (2010) Kras in metastatic colorectal cancer Swiss Med Wkly 140: W13112 27 Zenker M, L, K, Schulz A, L, Barth H, et al (2007), expansion of the genotypic and phenotypic spectrum in patients with KRAS germline mutation, J Med Genet, 44, pp 131-135 Nghiêm Thị Bích Hạnh 39 Lớp 11 - Tài liệu trang web 28 http:// benhvienk.com/pcut/tim-hieu-benh-ung-thu/376-nhung-khai-niemco-ban-ve-benh-ung-thu 29 http:// bạch mai.gov.vn/index.php?option=com content&task=view&id=1252 30 http:// www.parkwaycancercentre.com/vn/ tim-hieu-ve-ung-thu/cac-loaiung-thu/ung-thu-dai truc trang 31 http://hyvong.com.vn/vi/tim-hieu-ve-ung-thu/cac-loai-ung-thu/ung-thudai-truc-trang 32 http:// www.hoanmy.com/saigon/carcinom-tuyen-cua-dai-trang-colonadenocarcinoma 33 http://www.khoahocphothong.com.vn/news/detail/38423/nghien-cuu-xacdinh-dot-bien-gen-quyet-dinh-tinh-dap-ung-thuoc-trong-dieu-tri-ung-thu-dai-tructrang-va-ung-thu-phoi.html 34 http://vietq.vn/nhan-rong-lieu-phap-dieu-tri-dich-gop-phan-cuu-chuabenh-nhan-ung-thu-d42088.html 35 http://www.ungthudaitructrang.com/2014/03/quy-trinh-xac-inh-ot- bien-gene-kras.html 36 http://geneprotein.net/en/news/information-society/165-nhan-mg-liu- phap-tr-ich-gop-phn-cu-cha-bnh-nhan-ung-th.html Nghiêm Thị Bích Hạnh 40 Lớp 11 - [...]... này thay đổi ở mỗi loại bệnh ung thư bao gồm: 36% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 20% bệnh nhân ung thư phổi và 65 – 100% bệnh nhân ung thư tuyến tụy [20] Tỷ lệ này được xác định là 30 – 60% bệnh nhân ung thư đại trực tràng, 60% bệnh nhân ung thư tuyến tụy, 33% bệnh nhân ung thư mật, 17% bệnh nhân ung thư buồng trứng, 15% bệnh nhân ung thư màng trong dạ con và 30 – 40% bệnh nhân ung thư phổi các... đích ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng có đột biến trên gen KRAS [3] 1.2.3 Tình hình nghiên cứu về đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng trên thế giới và tại Việt Nam Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu cho thấy đột biến trên gen KRAS có ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị bằng liệu pháp phân tử đích Đột biến trên gen KRAS xảy ra với tần xuất 17 – 25% ở tất cả các loại ung thư [3] Tuy... của bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng - Tách chiết và bảo quản DNA tổng số - Xác định đột biến trên gen KRAS bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự gen - So sánh và phân tích những thay đổi nucleotide và thay đổi amino acid trên KRAS Mục tiêu của đề tài: Phát hiện những đột biến trên gen KRAS ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng Ý nghĩa của đề tài: Kết quả nghiên cứu ở mức độ gen ở bệnh nhân mắc ung thư. .. niệm ung thư đại trực tràng Ung thư đại trực tràng là ung thư phát khởi nguyên thủy từ các mô đại tràng (phần dài nhất của ruột già) hoặc trực tràng (vài cm cuối cùng của ruột già trước hậu môn) Ung thư đại trực tràng có thể gặp ở bất cứ vị trí nào của đại tràng: trực tràng, đại tràng sigma (đại tràng chậu hông), đại tràng xuống, đại tràng ngang, đại tràng lên và manh tràng Khoảng 42% ung thư nằm tại. .. [28] Gần 90% đột biến làm mất hoạt tính của protein KRAS là đột biến tại codon 12 – 13 trên exon 1 và 5% là đột biến tại codon 61 trên exon 2 Amino acid 12 và 13 là vị trí GTP-binding P-loop và amino acid 61 nằm trên vùng switch-I [21] Đối với bệnh ung thư đại trực tràng, đột biến ở codon 12 và 13 trên gen KRAS xảy ra ở 25 – 40% bệnh nhân [4] Đột biến điểm ở codon 12 và 13 cũng được xác định là gây... đại trực tràng và trên mẫu máu Theo nghiên cứu GS.TS Tạ Thành Văn – Trường Đại Học Y Hà Nội với đề tài: “Nghiên cứu xác định đột biến gen quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị ung thư đại trực tràng và ung thư phổi”.Đề tài nghiên cứu nhằm thực hiện các mục tiêu: xác định tỷ lệ đột biến EGFR, KRAS đối với bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và gen KRAS và BRAF đối với bệnh nhân ung thư đại trực. .. tổng số các loại ung thư, là loại ung thư phổ biến thứ ba trên thế giới sau ung thư phổi (1,8 triệu, 13%) và ung thư vú (1,7 triệu, 11,9%) Theo số liệu thống kê của Globocan 2008, ung thư đại trực tràng là bệnh ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới (chiếm 10% tổng các loại ung thư) và thứ hai ở nữ giới (chiếm 9,4% tổng các loại ung thư) Gần 60% các trường hợp ung thư đại trực tràng xảy ra ở các nước phát... hình ung thư đại trực tràng ở Việt Nam Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ ung thư nhiều nhất thế giới Mỗi năm cả nước có thêm khoảng 150.000 ca mắc mới các bệnh ung thư và 75.000 ca tử vong do ung thư, đứng thứ 2 chỉ sau bệnh tim mạch (Hiệp hội ung thư Việt Nam) 5 loại ung thư hàng đầu ở nam giới là phổi, gan, đại trực tràng, dạ dày và vòm hầu (chiếm 58%); còn ở nữ giới là vú, cổ tử cung, đại trực. .. đại trực tràng: thiết lập bản đồ đột biến gen, công bố các dạng đột biến và các vùng đột biến trọng điểm, đánh giá hiệu quả điều trị ung thư ở hai nhóm bệnh nhân sử dụng liệu pháp điều trị đích và liệu pháp hóa hoặc xạ trị, chế tạo thử nghiệm được 2 bộ kit (mỗi bộ 100 test) chẩn đoán nhanh đột biến gen EGFR, KRAS ở các bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ và ung thư đại trực tràng ở Việt Nam [33]... nhân rằng một số gen bị đột biến có thể trở thành đích để phát triển các thuốc điều trị đích ung thư đại trực tràng [10],[9],[24] Điều trị đích chống lại EGFR có cetuximab và panitumumab Đột biến điểm ở codon 12, 13 cũng được xác định là gây ra đáp ứng thấp với việc điều trị bằng cetuximab và panitumumab ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng [6] Khoảng 4/10 số bệnh nhân mắc ung thư đại trực tràng có đột