ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN

Tôm càng xanh (TCX) (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) là loài tôm nƣớc ngọt có kích thƣớc lớn nhất trong họ Palaemonidae, chỉ phân bố ở vùng Tây Nam châu Á Thái Bình Dƣơng (Nguyễn Việt Thắng, 1993). Là một đối tƣợng thủy sản quan trọng trong sản xuất và khai thác, TCX đƣợc thuần dƣỡng để sản xuất tại nhiều khu vực trên thế giới. Việt Nam, đồng bằng sông Cửu Long có sản lƣợng tôm lớn nhất nƣớc. Trong chu kỳ phát triển của ấu trùng tôm càng xanh, bệnh đục thân trên ấu trùng TCX là một trong những bệnh nguy hiểm nhất đối với ngƣời sản xuất giống bởi khả năng gây chết rất cao, có thể lên đến 100% trong vòng 5 ngày. Trƣờng hợp đầu tiên đƣợc ghi nhận là vào năm 1995 ở Martinique, Pháp (Arcier và c.t.v., 1999), sau đó ở Hàn Quốc (Tung và c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian và c.t.v., 2003), gần đây nhất ở Ấn Độ (Hameed, 2003). Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh này hiện vẫn chƣa rõ. Hiện có nhiều phƣơng pháp hiện đại đƣợc ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản nhƣ là PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mô miễn dịch, lai tại chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, ... cho kết quả chính xác. Nhƣng đối với những bệnh mới có tác nhân gây bệnh mới chƣa biết đƣợc về cấu trúc di truyền, không thể tạo đƣợc mẫu dò (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, ....vì thế, không thể chẩn đoán đƣợc tác nhân gây bệnh. Phƣơng pháp mô học (histopathology) truyền thống đƣợc phát triển từ những năm đầu có kính hiển vi đã đƣợc ứng dụng một cách rộng rãi trên thế giới, từ các bệnh viện, các phòng nghiên cứu, các trung tâm xét nghiệm, các viện nghiên cứu, .... Đây là phƣơng pháp nghiên cứu căn bản, chủ yếu quan sát về cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định đƣợc chức năng cũng nhƣ các trạng thái bệnh lý của tế bào, đặc biệt là đối với một số bệnh mới ta chƣa có primer, probe, ... thì phƣơng pháp mô học truyền thống rất hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN Giáo viên hƣớng dẫn: TS LÝ THỊ THANH LOAN CN ĐOÀN VĂN CƢỜNG Sinh viên thực hiện: NGUYỄN MINH VÀNG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2007 LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh tận tình dạy, truyền đạt kiến thức cho em suốt thời gian em học tập trƣờng Em xin chân thành cảm ơn cô - TS Lý Thị Thanh Loan hƣớng dẫn em giải vấn đề em thắc mắc suốt trình làm đề tài nhƣ tạo điều kiện cho em hồnh thành khố luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị làm việc Trung Tâm quốc gia Quan Trắc, thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II, anh chị phịng Mơ học: anh Đoàn Văn Cƣờng, anh Phạm Văn Điền, chị Tuyết Anh, chị Lan tận tình bảo cho em phƣơng pháp thao tác thực hành đề tài suốt thời gian em làm đề tài Sau cùng, xin cảm ơn tồn thể gia đình mến u tồn thể bạn học chung khố 29, ngành Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Nơng Lâm thân thƣơng động viên, bảo, giúp đỡ, thƣơng yêu Vì bƣớc đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, khỏi khiếm khuyết sai lầm, mong đƣợc góp ý bảo thầy cô bạn sinh viên TP HCM, tháng năm 2007 Sinh viên thực hiện, NGUYỄN MINH VÀNG iii TĨM TẮT NGUYỄN MINH VÀNG, lớp Cơng nghệ sinh học, khóa 29, niên khóa 2003 – 2007, trƣờng Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam “ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) BỊ BỆNH ĐỤC THÂN” Giáo viên hƣớng dẫn: TS LÝ THỊ THANH LOAN CN ĐOÀN VĂN CƢỜNG Thời gian thực đề tài: 3/2007  9/2007 Bệnh đục thân Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879 bệnh nguy hiểm gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng gây chết 100% ấu trùng hậu ấu trùng tôm xanh Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, khảo sát biến đổi cấu trúc tế bào tổ chức mô tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân Để khảo sát biến đổi cấu trúc mô học, tiến hành thu mẫu tôm xanh hai địa điểm: An Giang (thu mẫu bệnh dấu hiệu đục thân) Bến Tre (thu mẫu bệnh có dấu hiệu đục thân) Kết phân tích mơ học cho thấy có bất thƣờng cấu trúc tế bào tổ chức mô quan mang, gan tụy, tôm xanh bị bệnh đục thân Sự xuất thể ẩn bên nhân tế bào quan gan tụy, thể vùi bên nhân tế bào quan mang hoại tử đặc điểm chung quan sát đƣợc mẫu tôm ấu trùng bị bệnh đục thân iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT B (B-cells): Blasenzellen cells (Tế bào B) DNA: Deoxyribonucleic Acid ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay F (F-cells): Fibrillenzellen cells (Tế bào F) FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations (Tổ chức lƣơng nông giới) HP: Hepatopancreas (Cơ quan gan tụy) HPV: Hepatopancreatic parvovirus IHHNV: Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus ILS: Interlamellar space INIs: Các thể vùi nhân tế bào INOs: Các thể ẩn nhân tế bào L: Lamellae (Phiến mang) LU: Lumen M: Muscle (Cơ) MBV: Monodon baculovirus MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus PCR: Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuổi Polymerase) R (R-cells): Restzellen cells (Tế bào R) RNA: Ribonucleic Acid RT-PCR: Reverse – transcription polymerase chain reaction (Phản ứng chuổi Polymerase phiên mã ngƣợc) TCX: Tôm xanh UNDP: United Nations Development Programe XSV: Extral small virus WSSV: White Spot Syndrome Virus (Virus gây hội chứng đốm trắng) v DANH SÁCH CÁC HÌNH TRANG Hình 2.1: Hình dạng bên ngồi lồi Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 Hình 2.2: Cấu tạo bên Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 Hình 2.3: Bản đồ vùng phân bố tự nhiên Macrobrachium rosenbergii giới Hình 2.4: Các khu vực sản xuất TCX giới Hình 2.5: Biểu đồ phân bố sản lƣợng TCX giới qua năm Hình 2.6: Dấu hiệu lâm sàng bệnh đục thân TCX 14 Hình 2.7: Hình dạng tế bào Enterococus KM002 dƣới kính hiển vi điện tử 15 Hình 2.8: Hình dạng XSV MrNV dƣới kính hiển vi điện tử 16 Hình 2.9: Vị trí Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) họ nodavirus 16 Hình 2.10: Cấu trúc tế bào quan gan tụy TCX 18 Hình 2.11: Cấu trúc tế bào quan mang TCX 19 Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô TCX 27 Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng quan gan tụy 28 Hình 4.3a: Thể ẩn bên nhân tế bào gan tụy TCX 29 Hình 4.3b: Thể ẩn bên nhân tế bào gan tụy TCX 30 Hình 4.4: Cấu trúc tế bào quan mang TCX 31 Hình 4.5: Thể vùi bên nhân tế bào trrên quan mang TCX 33 Hình 4.6: Sự hoại tử TCX bị đục thân 34 vi DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên An Giang 25 Bảng 4.2: Kết phân tích mơ học mẫu TCX thu định kỳ An Giang 26 Bảng 4.3: Kết phân tích mơ học mẫu TCX bệnh đục thân 32 Bảng 4.4: So sánh mẫu TCX bị đục thân không bị đục thân 35 vii MỤC LỤC TRANG LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT .iv DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH SÁCH CÁC HÌNH .vi DANH SÁCH CÁC BẢNG vii MỤC LỤC viii Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hình thái tơm xanh 2 Đặc điểm sinh học tôm xanh 2.2.1Sinh sản tôm xanh .4 2.2.2Môi trƣờng chu kỳ sống 2.2.3Phân bố Tình hình ni tôm xanh Việt Nam giới Các bệnh thƣờng gặp tôm xanh .9 2.7.1Bệnh ấu trùng tôm xanh .9 2.7.2Những bệnh thƣờng gặp tôm trƣởng thành 12 Bệnh đục thân 13 Các phƣơng pháp nghiên cứu mô học 17 2.6.1Phƣơng pháp mô học truyền thống 17 2.6.2Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp .17 2.6.3Phƣơng pháp hóa mơ miễn dịch 17 2.6.4Phƣơng pháp lai chổ 17 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy mang tôm xanh 18 2.7.1Cấu trúc tế bào quan gan tụy 18 2.7.2Cấu trúc tế bào quan mang 19 Phần III BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 20 3.1 Bố trí thí nghiệm 20 3.1.1Thời gian địa điểm thực 20 viii 3.1.2Bố trí thí nghiệm 20 3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất .20 3.2.1Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 20 3.2.2Phƣơng pháp tiến hành 21 Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Kết 24 4.1.1Kết khảo sát mô học mẫu tơm xanh thu định kỳ khơng có dấu hiệu đục thân .24 4.1.2 Kết khảo sát mơ học tơm xanh có dấu hiệu đục thân 32 4.2 Thảo luận .34 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 Kết luận 37 Đề xuất 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 Tiếng Việt 38 Tiếng Anh 38 Danh sách trang website 42 ix Phần I ĐẶT VẤN ĐỀ Tôm xanh (TCX) (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879) lồi tơm nƣớc có kích thƣớc lớn họ Palaemonidae, phân bố vùng Tây Nam châu Á Thái Bình Dƣơng (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Là đối tƣợng thủy sản quan trọng sản xuất khai thác, TCX đƣợc dƣỡng để sản xuất nhiều khu vực giới Việt Nam, đồng sơng Cửu Long có sản lƣợng tơm lớn nƣớc Trong chu kỳ phát triển ấu trùng tôm xanh, bệnh đục thân ấu trùng TCX bệnh nguy hiểm ngƣời sản xuất giống khả gây chết cao, lên đến 100% vòng ngày Trƣờng hợp đƣợc ghi nhận vào năm 1995 Martinique, Pháp (Arcier c.t.v., 1999), sau Hàn Quốc (Tung c.t.v., 1999), Trung Quốc (Qian c.t.v., 2003), gần Ấn Độ (Hameed, 2003) Bệnh tác động chủ yếu vào giai đoạn TCX giống, tác nhân gây bệnh chƣa rõ Hiện có nhiều phƣơng pháp đại đƣợc ứng dụng vào chẩn đoán bệnh thủy sản nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction), RT-PCR (Reverse – transcription polymerase chain reaction), ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), hóa mơ miễn dịch, lai chổ (in situ hybridization), miễn dịch huỳnh quang, cho kết xác Nhƣng bệnh có tác nhân gây bệnh chƣa biết đƣợc cấu trúc di truyền, khơng thể tạo đƣợc mẫu dị (probe), đoạn mồi (primer), kháng thể, thế, khơng thể chẩn đốn đƣợc tác nhân gây bệnh Phƣơng pháp mô học (histopathology) truyền thống đƣợc phát triển từ năm đầu có kính hiển vi đƣợc ứng dụng cách rộng rãi giới, từ bệnh viện, phòng nghiên cứu, trung tâm xét nghiệm, viện nghiên cứu, Đây phƣơng pháp nghiên cứu bản, chủ yếu quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định đƣợc chức nhƣ trạng thái bệnh lý tế bào, đặc biệt số bệnh ta chƣa có primer, probe, phƣơng pháp mơ học truyền thống hiệu chẩn đốn mầm bệnh 30 Hình 4.3b: Thể ẩn bên nhân tế bào khối gan tụy TCX B – B-cells, E – E-cells, F – F-cells, IONs - thể ẩn bên nhân tế bào khối gan tụy, LU - lumen, R – R-cells Nhuộm Haematoxylin Eosin x 40 31 Trên quan mang bình thƣờng, sợi mang (lamellae) xếp đặng xen kẻ với khoảng trống (interlamellar space) (ILS) Bên sợi mang có lớp kitin mỏng bao bọc, kế lớp kitin lớp biểu mô mỏng bên chứa tế bào hồng cầu (hemocyte) (HC) Hình 4.4 cho thấy tổ chức tế bào khác bên quan mang Hình 4.4: Hình thái mơ học quan mang TCX ILS – interlamellar space, HC – Hồng cầu; L – phiến mang Nhuộm Haematoxylin Eosin, x 40 32 4.1.2 Kết khảo sát mô học tôm xanh có dấu hiệu đục thân Trong 11 mẫu TCX thu Bến Tre, dấu hiệu đục thân, ấu trùng TCX cịn có triệu chứng tƣơng tự mẫu thu An Giang: lờ đờ, giảm ăn, bất động, … Kết khảo sát mô học đƣợc ghi nhận Bảng 4.3 Bảng 4.3: Kết phân tích mơ học 11 mẫu TCX bị bệnh đục thân Trại giống STT Ngày thu Tuổi thu INOs (ngày) khối gan tụy INIs quan Hoại mang 25/07/2007 25 (L) - 5% (+) - -nt- -nt- - 20% (+) 50% (++) 26/07/25007 -nt- 10% (+) - 25% (+) Trại giống 4 27/07/2007 20 (L) - - 15% (+) -nt- 20 (L) - - 10% (+) -nt- 17 (L) 15% (+) 10% (+) 50% (++) -nt- 10 (PL) - 10% (+) 5% (+) 28/07/2007 21 (L) - - 30% (++) -nt- 21 (L) - - 5% (+) 10 -nt- 18 (L) - - 15% (+) 11 -nt- 19 (L) - 10% (+) - Ghi chú: (-) Khơng có dấu hiệu bất thƣờng (+) Tỉ lệ bất thƣờng < 30% (++) Tỉ lệ bất thƣờng 30% - 60% (+++) Tỉ lệ bất thƣờng > 60% L (larvae) ấu trùng; PL (postlarvae) hậu ấu trùng; INIs (intranuclear inclusion bodies) thể vùi bên nhân tế bào; INOs (intranuclear oclusion bodies) thể ẩn bên nhân tế bào Cũng theo quy trình nƣớc xanh cải tiến, tình hình chung trại giống Bến Tre không khác biệt nhiều so với An Giang, số lƣợng ấu trùng giảm chết đáng kể Đặc biệt xuất bệnh đục thân vài bể ƣơng Kết phân tích mơ học cho thấy 11 mẫu ấu trùng hậu ấu trùng thu đƣợc, có 5/11 mẫu (45,45%) vùi xuất nhân tế bào quan mang, 9/11 mẫu (81,82%) biểu 33 hoại tử cơ, 2/11 (18,2%) mẫu ẩn nhân quan gan tụy Trong có 3/11 mẫu (27,3%) vừa biểu hoại tử khối vừa vùi bên nhân tế bào quan mang, 1/11 (9,1%) mẫu có ba biểu hoại tử cơ, thể vùi bên nhân tế bào quan mang thể ẩn bên nhân tế bào gan tụy A B Hình 4.5: Thể vùi bên nhân (INIs) tế bào quan mang TCX (mủi tên) Nhuộm Haematocylin eosin, x40 (A), x10 (B) 34 Hình 4.5 cho thấy thể vùi bên nhân (INIs) tế bào phiến mang Dấu hiệu thể vùi bên nhân lần đƣợc ghi nhận đối tƣợng TCX Ngoài biểu thể vùi bên nhân, tiêu quan sát cịn cho thấy nhiều mẫu thu đƣợc có biểu hoại tử (>80%) Các bó hoại tử dấu hiệu chung phát đƣợc đối tƣợng TCX bị đục thân (Hình 4.6) A B C D Hình 4.6: Sự hoại tử xảy TCX bị đục thân MN (Muscle necrosis) hoại cơ, M (Muscle) cơ, HP (Hepatopancreas) khối gan tụy, DT (digestive tract) hệ thống tiêu hoá, C (Cutin) lớp kitin Nhuộm Haematoxylin Eosin, x 10 (A), x40 (B, C, D) 4.2 Thảo luận So sánh hai bảng kết phân tích mơ học (Bảng 4.2 Bảng 4.3), cho thấy có khác biệt Ở Bảng 4.2, kết phân tích mơ học mẫu tơm thu An Giang, có xuất thể ẩn bên nhân tế bào gan tụy, chiếm 39,1%; khơng có dấu hiệu hoại tử cơ, không xuất thể vùi nhân tế bào quan mang Ngƣợc lại, kết Bảng 4.3 cho thấy tần số xuất hoại tử cao (>80%), 35 ra, xuất thể vùi nhân tế bào quan mang có tần số lập lại cao (45,45%) Kết so sánh đƣợc trình bày Bảng 4.1 Bảng 4.4: So sánh bất thƣờng mẫu TCX bị đục thân không bị đục thân Mẫu không bị đục thân thu An Giang Mẫu bị đục thân thu Bến Tre - Tỉ lệ mẫu xuất thể ẩn tế bào - Tỉ lệ mẫu xuất thể ẩn tế bào gan tụy 9/23 (39,13%) gan tụy 2/11 (18,18%) - Khơng có thay đổi cấu trúc mô học - Tỉ lệ mẫu xuất thể vùi tế bào quan mang; không xuất thể mang 5/11 (45,45%) vùi tế bào mang - Khơng có thay đổi cấu trúc mơ học - Tỉ lệ mẫu bị hoại tử 9/11 (81,81%) khối Nhân tế bào nơi điều khiển trình hoạt động tế bào, trung tâm hoạt động, nơi xảy phản ứng sinh hóa quan trọng Là nơi điều hịa hoạt động tế bào, nhân chứa yếu tố di truyền xác định tính trạng tế bào Màng nhân dạng kép bao gồm hai màng bản, bao bọc vật liệu di truyền (DNA) bên Màng nhân đóng vai trò quan trọng việc điều hòa vận chuyển vật chất từ tế bào chất vào nhân ngƣợc lại Kích thƣớc lổ màng nhân nhỏ, phần tử bên muốn vào nhân phải đƣợc chuyên chở qua kênh vận chuyển Virus cấu trúc đặc biệt siêu nhỏ có khả xâm nhập vào nhân tế bào vật chủ, điều khiển hoạt động di truyền tế bào chất virus đoạn gen mang mật mã di truyền (DNA hay RNA) Hsieh c.t.v (2006) công bố trƣờng hợp nhân tế bào gan tụy xuất thể vùi bên nhân đối tƣợng TCX virus IHHNV (infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus) Ngoài dấu thể vùi bên nhân tế bào khối gan tụy, IHHNV cịn cơng lên cấu trúc gây hoại tử Tôm bị nhiễm IHHNV tiêu thụ thức ăn kém, tôm dần trở nên yếu dễ dàng bị sốc môi trƣờng sống thay đổi (do biến đổi nhiệt độ (mƣa gió thất thƣờng, khoảng chênh lệch nhiệt độ ngày đêm lớn) nguồn nƣớc bị nhiễm khuẩn nghèo tảo, …) dẫn đến chết Theo dõi qui trình chăm sóc trại tơm, chúng tơi ghi nhận nhiều 36 yếu tố không thuận lợi cho ấu trùng tơm phát triển bình thƣờng Thứ nhất, thời điểm thu mẫu nhằm vào vụ nghịch, điều kiện thời tiết không thuận lợi, thời tiết thất thƣờng, lúc mƣa nhiều, khơng khí ẩm ƣớt, lúc nắng, nhiệt độ lên đến 35oC (trong nhà ƣơng giống) Một số bể ƣơng tảo chết hoàn toàn, màu nƣớc trở nên nâu Khảo sát cấu trúc tế bào TCX có dấu hiệu đục thân Bến Tre, kết cho thấy có xuất thể vùi bên nhân quan mang, tế bào quan gan tụy bình thƣờng có xuất hoại tử Theo tác giả Vijayan (2005); Qian c.t.v (2003); Bonami c.t.v., (2005), dấu hiệu đục dấu hiệu bệnh đục thân TCX Cũng theo tác giả này, có hai loại virus gây nên bệnh đục TCX đƣợc phát gần Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) Extral small virus (XSV) Tuy nhiên, tác giả cơng bố hình thái mô học bệnh đục thân hoại tử mà khơng có mơ tả thay đổi mang gan tụy nhƣ Theo Hsieh c.t.v (2006), có năm loại virus nhiễm TCX: IHHNV, HPV, WSSV, MrNV XSV Đồng thời mẫu TCX bị đục thân đƣợc xét nghiệm MBV với kỹ thuật PCR với mồi đặc hiệu MBV (Monodon baculovirus), kết không phát MBV mẫu tôm Cheng Chen (1998) mô tả hoại tử tế bào gan tụy mêlanin hóa với tập trung tế bào hồng cầu mơ liên kết tuyến hình ống khoảng trống khối gan tụy Theo tác giả này, biến đổi loại song cầu khuẩn giống Enterococcus (Enterococcus-like bacterium) gây Tôm bệnh có biểu chậm lớn, giảm ăn, hoạt động, bị đục chết Tiêu mô học mẫu tơm bệnh cho thấy mêlanine hóa mơ liên kết nối tuyến hình ống khối gan tụy, hoại tử kèm theo dấu hiệu mêlanine hóa sợi 37 Phần V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Qua kết khảo sát mẫu tôm ấu trùng bị đục không bị đục cho phép ghi nhận nhƣ sau: Trên mẫu ấu trùng hậu ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân nhƣng có dấu hiệu bất thƣờng (ít ăn, vận động, …), có xuất thể ẩn bên nhân tế bào quan gan tụy, ghi nhận khơng có xuất thể vùi bên nhân tế bào mang không ghi nhận bất thƣờng quan Trên mẫu ấu trùng hậu ấu trùng TCX bị bệnh đục thân có xuất hoại tử (81,81% tổng số mẫu), có xuất thể vùi bên nhân tế bào quan mang (45,45% tổng số mẫu), có xuất thể ẩn bên nhân tế bào gan tụy (18,18% tổng số mẫu) Đề xuất Điều kiện thời gian kinh phí có hạn, chúng tơi dừng lại việc khảo sát cấu trúc mô quan tôm ấu trùng chủ yếu, kết bƣớc đầu Do để xác định xác tác nhân gây bệnh đục thân, chúng tơi xin có số đề nghị sau: Khảo sát số lƣợng mẫu nhiều suốt chu kỳ ƣơng để xác định xác giai đoạn nhiễm bệnh ấu trùng Tiến hành song song phƣơng pháp RT-PCR mô học mẫu ấu trùng bệnh đục thân để xác định xác mầm bệnh nhiễm ấu trùng tôm xanh bệnh đục thân 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Việt Thắng, 1993 Một số đặc điểm sinh học ứng dụng qui trình kỹ thuật sản xuất giống TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) đồng Nam Bộ Luận án phó tiến sĩ khoa học nơng nghiệp, trƣờng đại học thủy sản Nha Trang, Việt Nam, 214 trang Nguyễn Việt Thắng, 1997 Đặc điểm sinh học kỹ thuật sản xuất giống tôm xanh Đồng Bằng Nam Bộ BCKH Phạm Duy Lãm, 2005 Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) Estra small virus (XSV) TCX (Macrobrachium rosenbergii) Khoá luận tốt nghiệp kỹ sƣ công nghệ sinh học, trƣờng đại học Nơng Lâm, TP Hồ Chí Minh, Việt Nam, 42 trang FAO, 2001 Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh động vật thuỷ sản Châu Á (Sách dịch từ tài liệu kỹ thuật thuỷ sản FAO, số 402, phần bổ xung 2) Nhà xuất Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam, 240 trang Tiếng Anh Aquacop, 1977 Macrobrachium rosenbergii De Man culture in Polynesia: progress in developing a mass intensive larval rearing technique in clear water proceedings of the World Mariculture Society 8, 311-326 Arcier J M., Herman F., Lightner D V., Redman R., Mari J., Bonami J R., 1999 A viral disease associated with mortalities in the hatchery – reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 38: 177 – 181 Bhavan P S., Geraldine P., 2000 Histophathology of the hepatopancreas and gills of the prawn Macrobrachium malcolmsonii exposed to endosulfan Aquatic toxicology 50, India, pages 331-339 Bonami J.R., Shi Z., Qian D and Widada J.S., 2005 White tail disease of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: separation of the associated virions and characterization of MrNV as a new type of nodavirus Journal of Fish Disease, 28, pages 23-31 39 Brock J A., D V Lightner and Bell T A., 1983 A review of four virus (BP, MBV, BMN and IHHNV) diseases of penaeid shrimp with particular reference to clinical significance, diagnosis and control in shrimp aquaculture Proc 71st Intl Council for the exploration of the sea, C M 1983/Gen: 10/1 – 18 10 Brower S M., 1998 Synopsis of infectious diseases and parasites of commercially exploited shellfish: Larval Mid-cycle Disease (MCD) of freshwater shrimp URL: http://pacrhqiis7/shelldis/pages/mcdsp_e.htm 11 Cheng W and Chen J.-C., 1998 Isolation and characterization of an Enterococcuslike bacterium causing muscle necrosis and mortality in Macrobrachium rosenbergii in Taiwan Diseases of Aquatic Organisms, 34, pages 93-101 12 Cheng W and Chen J.-C., 2002 The virulence of Enterococcus to freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii and its immune resistance under ammonia stress Fish and Shellfish Immunology, 12, pages 97-109 13 Cheng W., Chen S.-M., Wang F.-I., Hsu P.-I., Liu C.-H., Chen J.-C., 2003 Effects of temperature, pH, salinity and ammonia on the phagocytic activity and clearance efficiency of giant freshwater prawn Macrobrachiu rosenbergii to Lactococcus garvieae Aquaculture 219, pages 111-121 14 FAO, 2002 Farming freshwater prawns A manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosenbergii) FAO FISHERIES TECHNICAL PAPAR, 428 15 Forster J R M and J F Wickens 1972 Prawn culture in the United Kingdom, Laboratory Leaf let (new series), Directorate of Fisheries Research (Great Britan), 27: 32 pp 16 Fujimura T and Okamoto H., 1972 Notes on progress made in developing a mass culturing technique for Macrobrachium rosenbergii in Hawai In: T V R Pillay (Editor), Coastal Aquaculture in the Indo-Pacific Region Fishing News (Books) Ltd., London p 313-327 17 Hameed A S S., Charles M X., Anilkumar M., 2000 Tolerance of Macrobrachium rosenbergii to white spot syndrome virus Aquaculture 183, pages 207-213 40 18 Hameed A S S., 2003 White tail disease of Macrobrachium rosenbergii Aquaculture Division, department of Zoology, C Abdultlakeen college, Melvisharam-632 509, Tamil Nadu, India, pages 19 Hsieh C Y., Chuang P C., Chen L C., Tu C., Chien M S., Huang K C., Kao H F., Tung M C., Tsai S S., 2006 Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus (IHHNV) infections in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Aquaculture 258, pages 73-79 20 Holthuis L B., 1950 The decapoda of the Siboga expedition pt.10 The palaemonidae, collected by the Siboga and snellins expedition with remarks on other species Subfamily palaemoninae siboga exped 21 Hsieh C.-Y., Wu Z.-B., Tung, Tu C., Lo S.-P., Chang T.-C., Chang C.-D., Chen S.C., Hsieh Y.-C and Tsai S.-S., 2006 In situ hybridization and RT-PCR detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De Man), in Taiwan Journal of Fish Diseases, 29, pages 665-671 22 Johnson S K, 1978 Handbook of shrimp diseases, Sea Grant Publ NO TAMU – SG – 90 – 601, Texas A & M Univ., 25 pages 23 Li N., Zhao Y., Yang J., 2006 Impact of waterborne copper on the structure of gills and hepatopancreas and its impact on the content of metallothionein in juvenile giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (Crustacea: Decapoda) toxicology, Archives of environmental contamination and 10.1007/s00244-005-0214-5, China 24 New M B & Valenti W C., 2000 Freshwater prawn culture, the farming of Macrobrachium rosenbergii Blackwell science, 446 pages 25 New M B., 2001 Farming freshwater prawns, a manual for the culture of the giant river prawn (Macrobrachium rosenbergii) FAO Fisheries Technical paper 428 26 Qian D., Shi Z., Zhang S., Cao Z., Liu W., Li L., Xie Y., Cambournac and Bonami J.-R., 2003 Extra small virus-like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii Journal of Fish Disease, 26, pages 521-527 41 27 Sheenhan D C and B B Hrapchak, 1980 Theory and practice of histotechnology C V Mosby Co., St Louis, 481 pages 28 Sae-oui D., Tansutapanich A and Ruangpan L 1987 Vibrio harveyi: Luminous bacteria causing disease in Penaeus merguiensis Tech Pap No Brackishwater Fisheries Division Dept of Fisheries, Thailand, 11p 29 Tonguthai K., 1992 Diseases of the freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand In: M Shariff, R.P Subasinghe and J.R Arthur (eds.) Diseases in Asian Aquaculture I Fish Health Section, Asian Fisheries Society Manila, Philippines, pages 89-95 30 Tonguthai K., 1997 Diseases of the freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii The aquatic animal health research Institute Department of Fisheries, Kasetsart University Campus, Jatujak, Bangkok 10900, Thailand, pages 31 Tung C W., Wang C S and Chen S N., 1999 Histological and electron microscopy study on Macrobrachium muscle virus (MMV) infection in the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii (De Man), cultures in Taiwan Journal of Fish Diseases 22: 319 – 324 32 Vijayan K K., Raj V S., Alavandi S V., Sekhar V T and Santiago T C., 2005 Incidence of white muscle disease, a viral like disease associated with mortalities in hatchery-reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachiu rosenbergii (De Man) from the southeast coast of India Aquaculture Research, 36, pages 311-316 33 Widada J S., Durand S., Cambournac L., Quian D., Shi Z., Dejoughe E., Richard V and Bonami J R., 2003 Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot-blot, in situ hybridization and RT-PCR Journal of Fish Diseases, 26, pages 583-590 34 Widada J S and Bonami J.-R., 2004 Characteristics of the monocistronic genome of extra small virus, a virus-like particle associated with Macrobrachium rosenbergii nodavirus: possible candidate for a new species of satellite virus Journal of General virology, 85, pages 643-646 42 35 Yoganandhan K., Learvibhas M., Sriwongpuk S., Limsuwan C., 2006 White tail disease of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii in Thailand Diseases of Aquatic Organisms, 69, pages 255-258 Danh sách trang website http://www.aginternetwork.org.net http://worldfishcenter.org http://vi.wikipedia.org http://www.fao.org http://www.oceansatlas.org PHỤ LỤC PHỤ LỤC A: Body segments in Macrobrachium rosenbergii and appendage function Body section Segment Appendage names Functions of appendages and related structure Embryonic segment (not visible in adults) CEPHALON 1st antennae nd Tactile and sensory perception (statocyst) Front portion of 2 antennae Tactile the Mandibles Cutting and grinding food cephalothorax 1st maxillae (mxillulae) Food handling 2nd maxillae Food handling; water circulation through the gill chamber (scphognathite) st maxillipeds Feeding/food handling 2nd maxillipeds Feeding/food handling 3rd maxillipeds Feeding/food handling st 10 pereiopods (chelipeds) Food capture 11 2nd pereiopods (chelipeds) Food capture; agonistic and mating behaviour 10 3rd pereiopods Walking;female gonophores between base of THORAX Rear portion of the cephalothorax legs 13 4th pereiopods Walking 14 5th pereiopods Walking; male gonophores between base of legs 15 st pleopods Swimming (swimmerets) 16 2nd pleopods Swimming; copulation in males (swimmerets) 17 ABDOMEN 3rd pleopods Swimming (swimmerets) 18 4th pleopods Swimming (swimmerets) 19 5th pleopods Swimming (swimmerets) 20 uropods Propulsion, together with the central telson PHỤ LỤC B: Hình thái ấu trùng tơm xanh qua giai đoạn phát triển (Nguyễn Việt Thắng, 1993) Giai đoạn Hình thái phát triển Thời gian tính Ghi sau nở (ngày) 46 +/- h 15’ 1–3 94 +/- 14 h 3–5 152 +/- 21 h 5–8 205 +/- 34 h – 10 244 +/- 36 h ? 286 +/- 45 h – 15 330 – 58 h 10 – 17 262 – 56 h 11 – 18 385 +/- 69 h 13 – 19 492 +/- 76 h 15 – 27 567 +/- 93 h 17 - ? 650 +/- 112 h 19 – 35 Dài – 2,1 mm (đo từ mút chủy đến mút telson), mắt chƣa có I cuống, đốt (telson) có dạng tam giác mang đơi lơng phía sau II Dài 2,2 mm, mắt có cuống, đốt có dạng tam giác, mang đơi lơng phía sau Dài 2,6 – 3,3 mm, nhánh ngồi telson ngắn telson với III tia chƣa mang lơng phía sau, gốc chủy xuất gai chủy đầu Dài 3,2 – 3,4 mm, đốt đuôi hẹp phần sau, phía chân IV có lơng, sau gốc chủy có hai gai chủy, gai có – mép trƣớc, nhánh ngồi telson dài telson có dạng hình chữ nhật, nhánh chân ngực nhú V Dài 3,8 – 3,9 mm, đốt dƣới có lơng chim, hai gai chủy có - telson nhọn, nhánh chân ngực xuất đốt Dài – 4,1 mm, đốt đuôi kéo dài thêm thu hẹp lại, phần sau VI có mang đơi gai phía bên đơi lơng cứng phía sau, hai đơi cạnh đơi có lơng chim, nhánh ngồi telson dài mút telson, chân bụng nhú Dài 4,1 – 4,2 mm, mầm chân bụng nhú lên với mức độ khác VII nhau, mầm to chẻ hai, gai chủy có – răng, mép dƣới xuất nhánh nhánh antene VIII IX X Dài 4,4 – 4,7 mm (các chân bụng có hai nhánh chƣa mang lơng hay có – lơng nhánh ngồi) Dài 5,6 – 5,8 mm, chân bụng phát triển dài thêm, nhánh ngồi có – lơng cứng Dài – 6,2 mm, chân ngực có kẹp, xuất – gai chủy phía Dài 6,6 – mm, chân ngực có kẹp hồn chỉnh, nhánh XI nhánh ngồi chân bụng có mang lơng, phía dƣới chủy có – Dài 8,2 – 9,7 mm, chủy có – phía đốt mang XII (PL) đốt gai phía sau, hai đơi có dạng lơng chim tơm bơi thẳng ƣa bò đáy thành bể ... ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ỨNG DỤNG PHƢƠNG PHÁP MÔ HỌC TRUYỀN THỐNG KHẢO SÁT SỰ BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC TẾ BÀO TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbegii. .. kinh tế nghiêm trọng gây chết 100% ấu trùng hậu ấu trùng tôm xanh Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, khảo sát biến đổi cấu trúc tế bào tổ chức mô tôm xanh (Macrobrachium rosenbergii) bị đục thân. ..  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) ấu trùng TCX không bị bệnh đục thân  Khảo sát cấu trúc tế bào (cơ quan mang, gan tụy, cơ) ấu trùng TCX bị bệnh đục thân  So sánh biến đổi