2.6.1 Phƣơng pháp mô học truyền thống
Phƣơng pháp mô học truyền thống là phƣơng pháp dùng kính hiển vi quang học (độ phóng đại tối đa 1.200 lần) quan sát cấu trúc mô, cấu trúc tế bào, xác định các trạng thái bệnh lý của mô - tế bào. Mẫu đƣợc cố định trong dung dịch Davision (mẫu giáp xác) hoặc dung dịch Bouin (mẫu cá), sau đó đem xử lý, đúc parafin, cắt và nhuộm. Quan sát lát cắt bằng kính hiển vi quang học.
2.6.2 Phƣơng pháp phóng xạ tự chụp
Phƣơng pháp này dùng để khảo sát các hiện tƣợng bên trong mẫu mô bằng cách dùng phóng xạ. Ngƣời ta đƣa các tiền chất là các phân tử phóng xạ nhƣ: acid amin phóng xạ, nucleotide phóng xạ vào tế bào. Các phân tử này đƣợc tế bào tổng hợp thành các phân tử có cấu trúc lớn hơn. Tiêu bản đƣợc phủ một lớp tráng (lớp phim) và đƣợc bảo quản trong hộp tối. Các hạt Bromide bạc khi gặp phóng xạ sẽ hình thành các hạt bạc đen. Cấu trúc có chứa phân tử phóng xạ sẽ thấy có những hạt bạc đen. Mẫu đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang học hoặc kính hiển vi điện tử. Phƣơng pháp này cho biết nhiều hoạt động của nhiều cấu trúc ở cấp độ vi thể.
2.6.3 Phƣơng pháp hóa mô miễn dịch
Dựa trên lý thuyết kết gắn kháng nguyên với kháng thể. Kháng thể đƣợc dùng có chất đánh dấu để phát hiện và định vị các prôtein đặc hiệu. Tùy theo chất đánh dấu (huỳnh quang, men, hạt vàng) mà tiêu bản đƣợc quan sát ở các loại kính hiển vi khác nhau.
2.6.4 Phƣơng pháp lai tại chổ
Kỹ thuật này phù hợp để phát hiện các DNA bất thƣờng. Chuỗi DNA đƣợc biến tính bằng nhiệt độ hay hóa chất tạo dạng sợi đơn. Sau đó đƣợc gắn với đoạn dò (probe) chuyên biệt có đánh dấu.
2. 7 Cấu trúc tế bào chơ quan gan tụy và mang tôm càng xanh 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy 2.7.1 Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy
Hình 2.10: Cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy TCX (Cheng và Chen, 1998). Hp - tế bào F; Hpb - tế bào B; Hbr - tế bào R; Mfn – nhân tế bào biểu mô; Mef - lớp tế bào biểu mô; Sin – xoang tạo máu; Lm – lumen. Haematoxylin và Eosin.
Hình 2.10 mô tả cấu trúc tế bào cơ quan gan tụy (Cheng và Chen, 1998) trên
Macrobrachium rosenbergii không mang bệnh, cho thấy khá rõ cấu trúc của các tổ chức tế bào khác nhau.
Ở tôm bình thƣờng không mang bệnh, tiếp diện ngang của khối gan tụy cho thấy một cấu trúc gồm nhiều tuyến hình ống (tubule) liên kết chặt chẻ với nhau bằng một lớp biểu mô liên kết đơn. Tiếp diện ngang của thành trong của các tubule này có dạng hình hoa thị thông đến bộ máy tiêu hóa.
Các tế bào trong khối gan tụy đƣợc phân thành nhiều nhóm khác nhau: nhóm tế bào E (E-cells) (embryonic cells) ở giai đoạn đầu của sự phát triển (tế bào mầm), tìm thấy ở biên của tuyến hình ống; nhóm tế bào F (F-cells) (Fibrillezellen cells) bắt màu đen và không có không bào trên tiêu bản quan sát dƣới kính hiển vi quang học; nhóm tế bào B (B-cells) (Blasenzellen cells) hình cầu trong chứa dịch chất tiêu hóa; nhóm tế bào R (R-cells) (Restzellen cells) dự trữ năng lƣợng chứa những giọt lipid và mạng lƣới nội chất nhám. Một vài tế bào trên tiêu bản đang trong giai đoạn phân chia tế bào. Những kẻ hở giữa các tuyến hình ống đƣợc xem là bình thƣờng.
2.7.2 Cấu trúc tế bào cơ quan mang
Hình 2.11: Cấu trúc tế bào cơ quan mang (Li, Zhao và Yang, 2006), cho thấy sự sắp xếp tuần tự của các phiến mang (L - lamellae) và các khoảng trống (ILS - interlamellar space). HC - hemocyte; PC - pillar cell. Haematoxylin và Eosin, x 20.
TCX có 16 sợi mang, mỗi bên 8 sợi, dài 4 – 8 mm ở tôm chƣa trƣởng thành. Bề mặt của mỗi sợi mang đƣợc bao phủ bởi một lớp kitin mỏng, phía dƣới lớp kitin là một lớp biểu mô đơn. Trên mỗi sợi mang có nhiều phiến mang (lamellae), bên trong chứa hồng cầu và biểu mô (Hình 2.11).
Phần III
BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM VÀ PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
3.1 Bố trí thí nghiệm
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian: từ 4/2007 đến 8/2007.
Địa điểm phân tích: Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo môi trƣờng và Phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực Nam Bộ (trực thuộc Viện nghiên cứu nuôi trồng thuỷ sản II).
Địa điểm thu mẫu:
o Trại giống 1: Thị xã Long Xuyên, tỉnh An Giang.
o Trại giống 2: Huyện Châu Thành, An Giang.
o Trại giống 3: Xã Quới Sơn, Huyện Châu Thành, Bến Tre.
o Trại giống 4: Xã An Hiệp, Huyện Châu Thành, Bến Tre.
3.1.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc chia thành hai nhóm:
Thu mẫu định kỳ: tại trại giống chú Hùng và trại giống Hải Duyên.
o Tại trại giống 1: Thu mỗi lần 4 mẫu x 3 lần.
o Tại trại giống 2: thu 3 lần, lần 1 thu 9 mẫu (B1 B9), lần 2 thu 5 mẫu (B2, B3, B5, B6,B7), lần 3 thu 1 mẫu (B6).
Thu mẫu bệnh: tại trại giống 3 và trại giống 4.
3.2 Vật liệu, trang thiết bị, dụng cụ, hóa chất
3.2.1Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất cần chuẩn bị 3.2.1.1 Trang thiết bị 3.2.1.1 Trang thiết bị
Máy xử lý mẫu tự động Bình rót parafin
Bộ phận làm lạnh mẫu Máy cắt mẫu microtome
Nồi nƣớc có chỉnh nhiệt độ
Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính Tủ ấm
Máy nhuộm mẫu tự động Kính hiển vi quang học
3.2.1.2 Dụng cụ
Khung chứa mẫu có nấp đậy Đèn cồn
Kéo Panh
Khung inox dùng để đúc mẫu Lam Lamel 3.2.1.3 Hoá chất Cồn 70% Cồn 80% Cồn 90% Cồn tuyệt đối 99,5% Chloroform Parafin Xylen
Thuốc nhuộm Hematoxylin, Eosin Keo dán: Baum Canada
Formalin
Acid acetic glacial Nƣớc cất
3.2.2Phƣơng pháp tiến hành 3.2.2.1 Lấy mẫu 3.2.2.1 Lấy mẫu
Khối gan tụy của tôm bị tiêu hủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự tiêu hủy mô do các enzyme tiết ra từ các tế bào gan tụy đã chết), điều này có nghĩa là cấu trúc của khối gan tụy khi tôm chết sẽ bị phân huỷ rất nhanh. Do đó mẫu phải đƣợc cố định nhanh khi tôm vẫn còn sống, để đảm bảo cấu trúc mô học của khối gan tụy không bị thay đổi.
Dung dịch Davision có thành phần nhƣ sau:
Acid acetic glacial : 115ml Cồn 95% : 330ml Formalin : 200ml Nƣớc cất : 335ml
Hoà tan các thành phần lại với nhau và bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Theo FAO (2000), nên ngâm trực tiếp ấu trùng và hậu ấu trùng (Postlarvae) (PL) giai đoạn sớm trong dung dịch cố định với tỉ lệ tối thiểu là 10 thể tích dung dịch cố định với 1 thể tích mô tôm. Thể tích này rất quan trọng trong việc bảo quản mẫu có hiệu quả, việc cố gắng làm giảm tỉ lệ này để giảm chi phí có thể làm cho mẫu mô không đạt yêu cầu cho quá trình đọc mẫu.
3.2.2.2 Xử lý mẫu
Mẫu tôm post sau khi cố định xong tiến hành xử lý mẫu. Mẫu đƣợc lấy ra khỏi dung dịch cố định và tiến hành xử lý mẫu, với sơ đồ nhƣ sau:
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ. Sau khi xử lý xong tiến hành đúc mẫu.
3.2.2.3 Cách đúc mẫu
Mục đích của việc đúc mẫu là làm cho mẫu tôm đƣợc cố định để có thể cắt với lát mỏng (khoảng 5µm) cho việc quan sát trên kính hiển vi dễ dàng, chính xác không làm thay đổi cấu trúc của các tổ chức tế bào.
Đặt mẫu vào đáy khuôn inox sao cho mặt tiếp xúc của mẫu với đáy khuôn là lớn nhất. Thực hiện bƣớc này tốt thì hình ảnh khối gan tụy và cơ quan mang có diện tích lớn, dễ quan sát cấu trúc mô bên trong.
Rót parafin vào khuôn, cố gắng giữ mẫu sao cho mẫu ở trung tâm khuôn (để khi tiến hành cắt mẫu và quan sát trên kính hiển vi đƣợc tốt hơn), đậy nắp cassette lại.
Đặt khuôn inox lên trên bề măt của dụng cụ làm lạnh, đợi khoảng 15 phút sau tách khối parafin ra đặt trực tiếp lên bàn lạnh.
3.2.2.4 Cách cắt mẫu
Dùng máy cắt microtome, lát cắt có độ dày 5 – 6 micromet.
Lát cắt đƣợc đặt lên lam, cho vài giọt cồn 70% lên, làm căng bề mặt mẫu bằng cách cho qua bể nƣớc ấm khoảng 40oC, sau đó đính mẫu lên lam và đặt vào bàn ấm ở nhiệt độ 40oC trong vòng 4 đến 6 giờ thì tiến hành nhuộm mẫu.
3.2.2.5 Nhuộm mẫu
Theo phƣơng pháp của Sheenhan và Hrapchak (1980), dùng thuốc nhuộm là Haematoxylin và Eosin.
Sơ đồ nhuộm mẫu:
Nhỏ một giọt keo Boume Canada ngay lên trên tiêu bản mẫu và đặt lamel lên, ép sát lame lên lam kính, cố gắng tránh sự hình thành bọt khí bên trong.
3.2.2.6 Quan sát trên kính hiển vi
Đặt tiêu bản lên kính hiển vi, tiến hành quan sát hình thái cấu tạo tế bào khối gan tụy, cơ quan mang, cơ của mẫu.
Phần IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả
Bằng phƣơng pháp mô học truyền thống, chúng tôi đã khảo sát cấu trúc tế bào TCX (Macrobrachium rosenbergii De Man 1879) bị bệnh đục thân và không bị bệnh đục thân nhƣng có những dấu hiệu bất thƣờng. Tổng số mẫu tôm chúng tôi thu đƣợc là 34 mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng tại An Giang và Bến Tre, các mẫu ấu trùng tôm đƣợc thu đều có dấu hiệu giảm ăn, ít vận động, bơi lội thất thƣờng (bơi lờ đờ, bơi theo đƣờng xoắn ốc, …) trong đó có 11 mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng thu tại Bến Tre bị đục thân.
4.1.1 Kết quả khảo sát mô học mẫu tôm càng xanh thu định kỳ không có dấu hiệu đục thân hiệu đục thân
Các đặc điểm chung của mẫu ấu trùng và hậu ấu trùng TCX thu tại An Giang đƣợc trình bày trong Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Dấu hiệu lâm sàng mẫu tôm thu ngẫu nhiên tại An Giang
Trại
giống Đợt Kí
hiệu Ngày thu Tuổi thu
(ngày) Tình hình chung
Dấu hiệu lâm sàng mẫu thu
1
I
B1 16/06/2007 18 (L)
- Sản xuất giống theo qui trình nƣớc xanh cải tiến.
- Chất lƣợng nƣớc bể nuôi không đƣợc đảm bảo, ban đầu tốt, tảo phát triển nhiều, sau chất lƣợng suy giảm, tảo không phát triển đƣợc, màu nƣớc chuyển sang trong và nâu. - Tỉ lệ chết tăng dần theo sự phát triển của ấu trùng tôm TCX. - Không bị đục thân. - Lờ đờ, biếng ăn, biếng động. - Mất phƣơng hƣớng, bơi xoay vòng. B2 -nt- 19 (L) B3 -nt- 20 (L) B4 -nt- 21 (L) II B1 29/06/2007 31 (L) B2 -nt- 32 (L) B3 -nt- 33 (L) B4 -nt- 34 (L) 2 I B1 16/06/2007 PL 4 B2 -nt- 16 (L) B3 -nt- 16 (L) B4 -nt- PL 5 B5 -nt- 16 (L) B6 -nt- 14 (L) B7 -nt- 17 (L) B8 -nt- 17 (L) B9 -nt- 14 (L) II B2 29/06/2007 39 (PL) B3 -nt- 27 (L) B5 -nt- 40 (PL) B6 -nt- 40 (PL) B7 -nt- 37 (PL) III B6 06/07/2007 49 (PL)
Bảng 4.1 cho thấy tất cả các mẫu TCX thu đƣợc ở An Giang đều không có dấu hiệu của bệnh đục thân, kết quả phân tích mô học của các mẫu TCX này sẽ làm căn cứ để xác định những khác biệt về sự thay đổi cấu trúc mô học của TCX bệnh đục thân so với bình thƣờng và so với các mẫu bệnh không gây hiện tƣợng đục thân.
Kết quả phân tích mô học các mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang đƣợc ghi nhận trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học mẫu TCX thu định kỳ tại An Giang Trại giống Đợt Số thứ tự Kí hiệu
Kết quả phân tích mô học Thể ẩn trong gan tụy Thể vùi trên mang Hoại tử cơ Ký sinh trùng trên mang 1 I 1 B1 - - - - 2 B2 25% (+) - - - 3 B3 - - - - 4 B4 - - - - II 5 B1 - - - - 6 B2 - - - - 7 B3 20% (+) - - 20% (+) 8 B4 - - - - 2 I 9 B1 20% (+) - - - 10 B2 10% (+) - - - 11 B3 - - - - 12 B4 - - - - 13 B5 - - - - 14 B6 - - - - 15 B7 20% (+) - - - 16 B8 25% (+) - - - 17 B9 55% (+) - - - II 18 B2 - - - - 19 B3 - - - - 20 B5 - - - - 21 B6 10% (+) - - - 22 B7 18% (+) - - - III 23 B6 - - - -
Ghi chú: (-) Không có dấu hiệu bất thƣờng. (+) Tỉ lệ bất thƣờng < 30%. (++) Tỉ lệ bất thƣờng 30% - 60%. (+++) Tỉ lệ bất thƣờng > 60%.
Kết quả phân tích cho thấy có 9/23 (39,13%) mẫu có thể ẩn bên trong nhân (INOs) của các tế bào trên khối gan tụy, 1/23 (4%) mẫu có ký sinh trùng trên cơ quan mang. Chỉ có một mẫu (mẫu số 7) có cả hai biểu hiện ký sinh trùng cơ quan mang và thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy. Không có mẫu nào biểu hiện thể vùi bên trong nhân (INIs) của các tế bào trên khối gan tụy và cơ quan mang; không có bất thƣờng trên cơ quan mang và các khối cơ. Tỉ lệ bất thƣờng (thể ẩn trên khối gan tụy là thấp (+).
Hình 4.1: Cấu trúc tế bào tổ chức mô cơ TCX. MI - cơ cắt ngang, MII - cơ cắt dọc, N - nhân của các tế bào cơ. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40.
Hình 4.1 Mô tả cấu trúc bình thƣờng của mô TCX không bệnh. Lát cắt cho thấy sự sắp xếpxen kẻ giữa các bó cơ ngang (MI) và dọc (MII), các khoảng trống giữa các sợi cơ là bình thƣờng, các hạt bắt màu đậm là hạch nhân tế bào cơ (N).
Hình 4.2 mô tả cấu trúc mô học bình thƣờng của khối gan tụy TCX. Các tuyến gan tụy xếp kề nhau, giữa chúng có một lớp tế bào liên kết (Mef). Thành tuyến đƣợc cấu tạo từ nhiều loại tế bào: tế bào E, F, R, B. Nhìn chung, mô tế bào gan tụy đang ở giai đoạn phát triển, nhiều tế bào mầm (tế bào E), ít tế bào dự trử (R), ít tế bào B. Các khoảng trống bên trong khối gan tụy đƣợc xem là bình thƣờng.
Hình 4.2: Các tổ chức tế bào bình thƣờng của cơ quan gan tụy. B – B-cells, E – E- cells, F – F-cells, LU – lumen, MII - cơ cắt dọc, Mef – mô liên kết, N(Mef) - nhân tế bào mô liên kết, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin. x 40.
Sự xuất hiện các thể ẩn bên trong nhân đƣợc ghi nhận trong Hình 4.3 và Hình 4.4.
Hình 4.3a: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên gan tụy TCX. B–B-cells, E– E-cells, IONs-thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy, LU - lumen, MII - cơ cắt dọc, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40 (A), x 100 (B).
B A
Hình 4.3b: Thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy TCX. B – B-cells, E – E-cells, F – F-cells, IONs - thể ẩn bên trong nhân của các tế bào trên khối gan tụy, LU - lumen, R – R-cells. Nhuộm Haematoxylin và Eosin. x 40.
Trên cơ quan mang bình thƣờng, các sợi mang (lamellae) sắp xếp đều đặng xen kẻ với những khoảng trống (interlamellar space) (ILS). Bên ngoài các sợi mang có một lớp kitin mỏng bao bọc, kế lớp kitin là lớp biểu mô mỏng bên trong chứa các tế bào hồng cầu (hemocyte) (HC).
Hình 4.4 cho thấy các tổ chức tế bào khác nhau bên trong cơ quan mang.
Hình 4.4: Hình thái mô học cơ quan mang TCX. ILS – interlamellar space, HC – Hồng cầu; L – phiến mang. Nhuộm Haematoxylin và Eosin, x 40.
4.1.2. Kết quả khảo sát mô học tôm càng xanh có dấu hiệu đục thân
Trong 11 mẫu TCX thu tại Bến Tre, ngoài những dấu hiệu đục thân, ấu trùng TCX còn có những triệu chứng tƣơng tự các mẫu thu tại An Giang: lờ đờ, giảm ăn, bất động, …. Kết quả khảo sát mô học đƣợc ghi nhận trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3: Kết quả phân tích mô học 11 mẫu TCX bị bệnh đục thân Trại giống 3
STT Ngày thu Tuổi thu (ngày)
INOs trong khối gan tụy
INIs trong cơ quan mang Hoại cơ 1 25/07/2007 25 (L) - 5% (+) - 2 -nt- -nt- - 20% (+) 50% (++) 3 26/07/25007 -nt- 10% (+) - 25% (+) Trại giống 4 4 27/07/2007 20 (L) - - 15% (+) 5 -nt- 20 (L) - - 10% (+) 6 -nt- 17 (L) 15% (+) 10% (+) 50% (++) 7 -nt- 10 (PL) - 10% (+) 5% (+) 8 28/07/2007 21 (L) - - 30% (++) 9 -nt- 21 (L) - - 5% (+) 10 -nt- 18 (L) - - 15% (+) 11 -nt- 19 (L) - 10% (+) -
Ghi chú: (-) Không có dấu hiệu bất thƣờng. (+) Tỉ lệ bất thƣờng < 30%. (++) Tỉ lệ bất thƣờng 30% - 60%. (+++) Tỉ lệ bất thƣờng > 60%. L (larvae) ấu trùng; PL