ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (in situ hybridization) phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (macrobrachium rosenbergii de man, 1879)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN PHẠM THỊ THANH NHÀN ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ IN SITU HYBRIDIZATION PHÁT HIỆN TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

PHẠM THỊ THANH NHÀN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIZATION) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN

GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG

TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành Bệnh học Thủy Sản

Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2008

Trang 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

PHẠM THỊ THANH NHÀN

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI TẠI CHỖ (IN SITU HYBRIDIZATION) PHÁT HIỆN TÁC NHÂN

GÂY BỆNH ĐỤC THÂN TRÊN ẤU TRÙNG

TÔM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)

Trang 3

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trangđặc biệt là thầy cô trong bộ môn Bệnh Học Thuỷ Sản đ ã tận tình truyền đạt kiếnthức cho chúng em trong thời gian qua

Để hoàn thành tốt luân văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ tậntình của cán bộ trong viện nghiên cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II Vì vậy em:

Chân thành cảm ơn Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan đã hướng dẫn và tạo điềukiện tốt nhất để em hoàn thành báo cáo này

Chân thành cảm ơn CNSH Đoàn Văn Cường đã giúp đỡ và chỉ bảo cho emtrong quá trình thực hiện và hoàn thành báo cáo này

Chân thành cảm ơn anh Nguyễn Doãn Duẩn, người đã giúp đỡ em tận tình vàchỉ bảo cho em trong suốt quá trình thực hiện báo cáo này

Qua đây em cảm ơn các anh chị thuộc Trung Tâm Quan Trắc đặc biệt là anhchị trong phòng mô học và phòng sinh học phân tử Trung Tâm Quốc Gia QuanTrắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam

Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

Do trình độ bản thân còn hạn chế và thời gian có hạn nên trong báo cáokhông tránh khỏi sai sót, rất mong được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và bạn bè

Tp HCM tháng 11/2008Sinh viên thực hiệnPhạm Thị Thanh Nhàn

Trang 4

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH iii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh 3

2.1.1 Hình thái tôm càng xanh 3

2.1.2 Vòng đời 4

2.1.3 Đặc điểm sinh sản 4

2.1.4 Sự phân bố 5

2.1.5 Đặc điểm của ấu trùng 6

2.2 Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh 8

2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn 8

2.2.1.1 Bệnh hoại tử do vi khuẩn 8

2.2.1.2 Bệnh phát sáng 8

2.2.1.3 Bệnh đốm nâu 9

2.2.1.4 Bệnh do Ricketsia 9

2.2.2 Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN) 9

2.2.3 Bệnh do nguyên sinh động vật 10

2.2.4 Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh 10

2.2.4.1 Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng 10

2.2.4.2 Bệnh lột xác dính vỏ 10

2.3 Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh 11

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh 11

2.3.2 Dấu hiệu của bệnh đục thân 11

Trang 5

2.3.3.Tác nhân gây bệnh 12

2.3.4 Sự lây nhiễm 13

2.4 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh 14

2.4.1 Phương pháp lai Dot – blot 14

2.4.2 Phương pháp ELISA 15

2.4.3 Phương pháp RT – PCR 16

2.4.4 Phương pháp mô học truyền thống 17

2.4.5 Phương pháp lai tại chỗ 18 2.4.5.1 Nguyên tắc 18 2.4.5.2 Kỹ thuật lai tại chỗ 19

2.4.5.3 Mẫu dò 22

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 26

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 26

3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.2.1 Vật liệu và dụng cụ cho ứng dụng phương pháp lai tại chỗ và mô học truyền thống 26

3.2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

3.2.3.1 Phương pháp làm lame dương 28 3.2.3.2 Phương pháp tổng hợp và đánh dấu mẫu dò 28 3.2.3.3 Phương pháp mô học truyền thống và lai tại chỗ 31

3.2.3.4 Bố trí thí nghiệm 36

PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Kết quả ứng dụng kỹ thuật ISH phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân 37

4.2 Kết quả so sánh phương pháp ISH với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật RT-PCR 47

4.2.1 So sánh về độ nhạy và độ chính xác của 3 phương pháp 47

4.2.2 So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp RT-PCR, Mô học truyền thống và ISH 51

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT Ý KIẾN 53

5.1 KẾT LUẬN 53

5.2 ĐỀ XUẤT 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 6

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ

Bảng 2.1 Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh

(aquacop, 1983) 6

Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho đánh dấu mẫu dò 30

Đồ thị 4.1 Tỷ lệ nhiễm MrNV trên 10 mẫu thu có biểu hiện bệnh 48

Bảng 4.1 Bảng dấu hiệu lâm sàng của các mẫu 37

Bảng 4.2 Kết quả phân tích mô học tôm càng xanh 39

Bảng 4.3 Kết quả một số phương pháp sinh học phân tử 43

Bảng 4.4 Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh MrNV của ba phương pháp ISH, Mô học và RT-PCR trên tôm ấu trùng 47

Bảng 4.5 So sánh hiệu quả của cả 3 phương pháp RT-PCR, mô học truyền thống và ISH 51

Trang 7

DANH MỤC CÁC HÌNH.

Hình 2.1. Hình Virus MrNV (Bonami và ctv, 2005) 13

Hình 2.2. Hình Virus XSV (Bonami và ctv, 2005) 13

Hình 2.3 Sơ đồ tóm tắt kỹ thuật lai 19

Hình 2.4 Digoxigenin – UTP/dUTP/ddUTP, alkali-stable 25

Hình 3.1 Sơ đồ xử lý mẫu 32

Hình 3.2 Sơ đồ nhuộm mẫu tự động 33

Hình 4.1 Hình Post-larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những đốm trắng ở phần đuôi, phần bụng và phần đầu 38

Hình 4.2 Hình thái mô học tổ chức cơ tôm càng xanh 40

Hình 4.3 Hình tổ chức tế bào khối gan tụy 41

Hình 4.4 Sự xuất hiện thể vùi trên cơ quan mang của ấu trùng tôm càng xanh 41

Hình 4.5 Hình mô tôm khỏe mạnh mẫu A8 42

Hình 4.6 Tế bào nhiễm MrNV trên các cơ quan khác nhau của tôm sau khi nhuộm ISH 44

Hình 4.7 Tế bào nhiễm MrNV trên cơ quan gan tụy sau khi nhuộm ISH 46

Hình 4.8 Tế bào nhiễm MrNV sau khi nhuộm ISH và mô học truyền thống 49

Trang 8

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.

MrNV : Macrobrachium rosenbergii nodavirus.

RT-PCR : Reverse Transcriptase-Polymerase ChainReaction.

cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid

S - ELISA : Sandwich Enzyme Linked ImmunosorbentAssay

OIE :Office International Epizootic

FAO :Food and Agriculture Organization

Trang 9

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

Ngành thủy sản Việt Nam trong những năm gần đây đ ã đạt được nhữngthành tựu đáng khích lệ, tốc độ tăng trưởng hàng năm trên 20% và đang trở thànhmột trong những ngành kinh tế quan trọng của quốc gia Đặc biệt phải kể đến sựđóng góp to lớn của nghề nuôi tôm Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm n ước tangày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận rất cao cho nền kinh tế quốc dân ỞViệt Nam, trong 10 năm gần đây phong tr ào nuôi tôm nước lợ phát triển rất mạnh,đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển Đồng Bằng Sông Cửu Long nh ư Cà Mau,Bạc Liêu, Bến Tre, Đồng Tháp Bên cạnh đó, trong những năm gần đây tôm càngxanh cũng đang trên đã phát triển mạnh và cũng chiếm một vị trí quan trọng tr ên thịtrường Từ năm 2000 trở lại đây sản l ượng tôm càng xanh đều tăng rất mạnh và đạttới 10000 tấn trong năm 2002 (Bộ Thủy Sản, 2003)

Tuy nhiên, nghề nuôi tôm càng xanh gặp phải không ít những khó khăn dodịch bệnh xảy ra Đặc biệt là gây thiệt hại rất lớn và là mối nguy cho nghề nuôi tômchủ yếu là bệnh do virus gây ra như bệnh đục thân do virus Đây là một bệnh rất lànguy hiểm và là một trong những bệnh gây thiệt hại nghi êm trọng cho người sảnxuất giống cũng như người nuôi tôm thương phẩm, tỷ lệ chết có thể đạt tới 100%chỉ trong vòng 5 ngày (Vijayan và cộng sự, 2003) Hiện nay bệnh n ày vẫn chưa cóbiện pháp chữa trị mà chủ yếu trong quá trình nuôi tiến hành phòng bệnh là chính

Vì vậy, việc chẩn đoán chính xác đ ược tác nhân để có thể đưa ra biện pháp xử lýđúng và kịp thời là rất quan trọng và cần thiết trong nuôi trồng thủy sản

Để tăng cường kiểm soát bệnh, cho đến nay đ ã có rất nhiều phương pháphiện đại đã và đang được phát triển và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh thủy sản nh ưphương pháp Mô học truyền thống, một số phương pháp dựa trên cơ chế miễn dịchđặc hiệu (ELISA, Dot-Blot), các kỹ thuật PCR (PCR, RT-PCR)…Tuy nhiên việctìm ra được phương pháp có tính đặc hiệu cao, tính nhạy cao và là một công cụ hữuhiệu để chẩn đoán được chính xác tác nhân gây bệnh th ì luôn là mối quan tâm củacác nhà nghiên cứu bệnh học thủy sản Và với phương pháp lai tại chỗ (In Situ

Trang 10

Hybridization) đó là kỹ thuật lai phân tử nhằm phát hiện tr ình tự nucleic nhất địnhtrong lát cắt mô Nên nó đáp ứng được yêu cầu trên và là công cụ hữu hiệu để chẩnđoán tác nhân mà phương pháp m ô học truyền thống không thể thực hiện đ ược.

Vì vậy, xuất phát từ thực tiễn cần thiết, đ ược sự đồng ý của khoa Nuôi TrồngThủy Sản, bộ môn Bệnh học Thủy Sản – trường Đại Học Nha Trang Dưới sựhướng dẫn của Tiến Sĩ Lý Thị Thanh Loan – Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng ThủySản II Em được phân công thực hiện đề tài:

“ Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (In Situ Hybridization) phát hiện tác

nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii De Man, 1879)”.

Mục tiêu:

Ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) để phát hiện sự hiện diện của tác nhân gâybệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh

Nội dung nghiên cứu:

- Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật lai tại chỗ (ISH) phát hiện tác nhân gây bệnh

đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh

- So sánh kết quả thu được của phương pháp ISH với phương pháp mô họctruyền thống và kỹ thuật RT-PCR về độ ổn đinh, độ nhạy, độ chính xác v à tính hiệuquả

Nghiên cứu đề tài này thành công sẽ là tiền đề để nghiên cứu phát triển phươngpháp lai tại chỗ và ứng dụng để phát hiện chính xác được tác nhân gây bệnh trên đốitượng thủy sản, cụ thể là bệnh đục thân do virus trên ấu trùng tôm càng xanh

Trang 11

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm càng xanh

2.1.1 Hình thái tôm càng xanh

Theo hệ thống phân loại của Holthius (1950), tôm càng xanh

Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 được phân loại như sau:

Lớp giáp xác Crustacea

Lớp phụ giáp xác bậc cao Malacostraca

Bộ mười chân Decapoda

Bộ phụ chân bơi Natantia

Phân bộ Caridea

Macrobrachium rosenbergii De Man 1879 là loài tôm càng xanh l ớn nhất

trong giống Macrobrachium Tôm càng xanh có cơ thể thon dài, đối xứng hai bên.Cấu tạo cơ thể gồm hai phần: phần đầu ngực phía trước, phần bụng phía sau [6]

Phần đầu ngực lớn có dạng hơi giống hình trụ bao gồm phần đầu với 5 đốtgần nhau mang 5 đôi phụ bộ và phần ngực với 8 đốt liền nhau mang 8 đôi phụ bộ.Phần đầu ngực được bao dưới tấm vỏ dày gọi là giáp đầu ngực [6]

Phần bụng gồm có 6 đốt có thể cử động v à một đốt đuôi, mỗi đốt mang mộtđôi phụ bộ gọi là chân bơi Mỗi đốt bụng có tấm vỏ bao Tấm vỏ phía tr ước xếpchồng lên tấm vỏ phía sau Tuy nhiên tấm vỏ của đốt bụng thứ hai phủ l ên cả haitấm vỏ trước và sau nó Các đốt bụng hơi tròn trên mặt lưng và dẹp hai bên Cơ thể

có dạng hơi cong như hình dấu phẩy, to ở phần đầu và thon nhỏ về phía sau [6], [9]

Tôm có chủy dài vượt vảy râu, uốn cong lên từ đoạn giữa chủy, gốc chủy ởnơi hốc mắt nhô cao lên thành mào Có từ 11-16 răng trên chủy (2-3 răng sau hốc

Trang 12

mắt) và 10 -15 răng dưới chủy.

Các phụ bộ có hình dạng, kích cỡ và chức năng khác nhau với hai đôi râu cóchức năng xúc giác, một đôi hàm lớn, hai đôi hàm nhỏ và ba đôi chân hàm có chứcnăng giữ và nghiền mồi Năm đôi chân ngực có chức năng để bò, năm đôi chânngực để bơi và một đôi chân đuôi có chức năng như bánh lái Hai đôi chân ngực đầutiên của tôm chuyển hóa thành hai đôi càng, đôi càng thứ hai to dùng để bắt mồi và

tự vệ [37]

Ở tôm nhỏ có màu sắc trong sáng, trên giáp đầu ngực có những sọc xanh đendọc hai bên Tôm trưởng thành có màu xanh dễ nhận đôi khi có màu nâu nhạt, cơthể có những vệt màu xanh hơi sậm ngang lưng xen kẽ với màu trắng trong của cơthể [6], [9]

2.1.2 Vòng đời

Theo Ling và cộng sự (1962) và Phương (2003), vòng đời của tôm càng xanhđược chia thành 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, hậu ấu trùng và tôm trưởng thành Khitôm trưởng thành, chúng thường sống ở vùng nước ngọt và chính nơi này sẽ xảy raquá trình thành thục, phát dục và giao vĩ đẻ trứng Khi ôm trứng chúng có xu h ướngbơi ra xa vùng nước lợ từ 6 -8‰

Ở đó ấu trùng được nở ra và sống trôi nổi theo kiểu phù du Sau 11 lần lộtxác với 12 giai đoạn biến thái, ấu tr ùng (Nauplii) biến thành hậu ấu trùng (Postlarvae) lúc này tôm con di cư về vùng nước ngọt sống và lớn lên ở đó [35],[37]

2.1.3 Đặc điểm sinh sản

Ở tôm trường thành, tôm đực thường có kích thước lớn hơn tôm cái cùngtuổi Đầu ngực tôm đực to hơn và khoang bụng hẹp hơn so với tôm cái Đôi càngthứ hai to, dài hơn và thường có màu xanh dương đậm Các gốc chân ngực của tômđực xếp khít nhau hơn so với tôm cái, hai lỗ sinh dục đực nằm đốt gốc của đôi chânngực thứ 5 [37]

Tôm cái thường có kích thước nhỏ hơn tôm đực, có phần đầu ngực và đôicàng thon nhỏ, ba tấm bụng đầu tiên ở tôm cái rộng và dài tạo thành khoang bụnglàm buồng ấp trứng Quá trình nở rộng của các tấm bụng này khi tôm tham gia sinh

Trang 13

sản lần đầu và đây cũng chính là đặc điểm quan trọng của tôm cái Lỗ sinh dục củacon cái nằm ở phần ức, ngay gốc đôi chân ngực thứ 3, có dạng tam giác Tr ên cácđốt giữa của các chân bơi còn có nhiều lông tơ hình thành ở thời kỳ lột xác tiền giao

vĩ có tác dụng cho trứng bám vào [6], [9], [16]

Buồng trứng của con cái nằm trên mặt lưng của phần đầu ngực, giữa dạ dày

và gan tụy Khi buồng trứng thành thục sẽ có màu vàng có thể nhìn thấy qua giápđầu ngực, trải dài từ sau mắt đến đổt đầu của phần bụng Ống dẫn trứng nối từbuồng trứng ở trước tim chạy dọc hai bên bụng đổ về phía túi ở đốt gốc của chânngực thứ 3 [6], [9]

Tôm thành thục và giao vĩ xảy ra hầu như quanh năm Mùa đẻ rộ của tômcàng xanh ở Đồng Bằng Nam Bộ tập trung từ tháng 4 – 6 và từ tháng 8 – 10 [11].Tôm càng xanh cái thành thục lần đầu tiên ở khoảng 3 – 3,5 tháng kể từ hậu ấutrùng 10- 15 ngày Kích cỡ tôm nhỏ nhất đạt thành thục từ 10 – 13 cm và 7,5g [9]

Quá trình lột xác tiền giao vĩ của tôm cá i sẽ tiết ra chất dẫn dụ có tác dụngkích thích tôm đực tìm đến Sau khi tôm lột xác 1 – 22 giờ, thường 3 – 6 giờ, tômbắt đầu giao vĩ Toàn bộ quá trình tiếp xúc và giao vĩ xảy ra trong vòng 20 – 35phút Sau khi giao vĩ 2 – 3 giờ có khi 6 – 24 giờ tôm cái bắt đầu đẻ trứng [6], [9]

Tôm thường đẻ trứng vào ban đêm, tôm cái thường di chuyển từ tầng đáy lêntầng giữa hay tầng mặt để đẻ Trong quá tr ình đẻ trứng, trứng được thụ tinh khi đingang túi chứa tinh Trứng sẽ lần lượt dính từng chùm vào các lông tơ của các đôichân bụng thứ tư, thứ ba, thứ hai, thứ nhất Thời gian đẻ trứng khoảng 10 – 60 phút,thường 15 – 25 phút Những tôm cái thành thục chín muồi nhưng không được giao

vĩ vẫn đẻ trứng trong vòng 24 giờ sau khi lột xác Những trứng này do không đượcthụ tinh nên sẽ rụng sau 1 – 2 ngày (FAO, 1985)

Trong quá trình ấp trứng, tôm cái thường dùng chân bụng quạt nước, tạodòng nước cung cấp dưỡng khí cho trứng Thời gian ấp cho đến khi trứng nở có thể

từ 15 – 23 ngày phụ thuộc vào nhiệt độ nước

2.1.4 Sự phân bố

Tôm càng xanh phân bố khắp các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới trên Thế Giới

Trang 14

Hiện nay được biết trên 100 loài, trong đó hơn một phần tư số này có ở châu Mỹ[9] Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tôm càng xanh phân bố ở tất cả các thủyvực nước ngọt (đầm, hồ, ao, sông) và các thủy vực nước lợ của nhiều vùng trên thếgiới.Tôm càng xanh phân bố chủ yếu ở Đông Nam Á và một khu vực khá hẹp củaĐông Bắc Á, giới hạn từ ấn Độ đến phía Đông của n ước Úc và đảo Solomon nhưThái Lan, Ấn Độ, Sigapore, Nhật Bản, Hồng Kông, Philippine, Ondonesia,Australia, Việt Nam và khu vực Tây Nam Thái Bình Dương chủ yếu khu vực từChâu Úc đến New Guinea [9].

Ở Việt Nam, tôm càng xanh phân bố tự nhiên từ Nha Trang trở vào đếnĐồng Bằng Nam Bộ và tập trung chủ yếu ở các vùng nước ngọt và vùng cửa sôngven biển ở Đồng Bằng Sông Cửu Long [35]

2.1.5 Đặc điểm của ấu trùng

Ấu trùng nở ra và sống trôi nổi theo kiêu phù du, sống trong vùng nước lợ 6 18‰ Ấu trùng có tính hướng quang mạnh, bơi chủ động bụng ngửa đuôi hướng vềphía trước Có thể cho ấu trùng ăn bằng các loại Artemia, Moina, thịt cá, thịt mực,Artemia tiền trưởng thành, trùng chỉ (giun đỏ), thức ăn chế biến, thức ăn nhân tạo Tuy nhiên, thức ăn thường được sử dụng nhất là ấu trùng Artemia và thức ăn chếbiến Ấu trùng qua 12 lần lột xác để trở thành hậu ấu trùng [36], [37]

-Bảng 2.1 Đặc điểm phát triển các giai đoạn của ấu tr ùng tôm càng xanh (Aquacop, 1983)

ngày

I Dài 2-2,1mm (đo từ mút chủy đến mút Telson), có

dạng tam giác mang 7 đôi lông ở phía sau

46K4h15phút 1-3

II Dài 2,2mm, mắt có cuống, đốt dứới cũng có dạngtam giác, mang 8 đôi lông ở phía sau. 94 k 14h 3 - 5

III

Dài 2,6 mm, nhánh ngoài của Telson ngắn hơn

Telson với tia trong chưa mang lông phía sau Gốc

chủy xuất hiện một gai chủy trên đầu

152 k 34h 5 - 8

Trang 15

Dài 3,2 – 3,4 mm, đốt đuôi hẹp ở phần sau, phía

trong chân đuôi có lông, sau gốc chủy có 2 gai trên

chủy Mỗi gai có 2 – 3 răng ở mép trước Nhánh

ngoài Telson dai bằng telson có dạng hình chữ

nhật nhánh ngoài chân ngực 4 mới nhú

205 k 34h 7 – 10

V

Dài 3,8 – 3,9 mm, đốt dưới có lông chim Hai gai

trên chủy có 4 – 5 răng Telson nhọn nhánh ngoài

VI

Dài 4 – 4,1mm, đốt đuôi kéo dài thêm và thu hẹp

lại phần sau có mang 3 đôi gai ở phía b ên và 5 đôi

lông cứng ở phía sau Hai đôi cạnh đôi giữa có

lông chim Nhánh ngoài telson dài quá mút telson,

chân bụng đã nhú

286k 45h 9 – 15

VII

Dài 4,1 – 4,2 mm, mầm chân bụng nhú lên với các

mức độ khác nhau, các mầm to thì chẻ 2 Mỗi gai

trên chủy có 5 – 6 răng, ở mép dưới xuất hiện

nhánh 3 của nhánh antene

330k 58h 10 - 17

VIII

Dài 4,4 – 4,7 mm, các chân bụng đều có 2 nhánh

chưa có mang lông hay chỉ có 1 – 2 lông ở nhánh

ngoài

262k 56h 11 – 18

IX Dài 5,6 – 5,8 mm, chân bụng phát triển dài thêm,nhánh ngoài có 4 – 5 lông cứng. 385k 69h 13 – 19

X Dài 6 – 6,2 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp Xuất

hiện 3 – 4 gai chủy phía trên 492k 76h 15 – 27

XI Dài 6,6 – 8 mm, chân ngực 1 và 2 có kẹp hoàn

chỉnh Nhánh trong và nhánh ngoài chân bụng đều

mang lông Phí dưới thùy có 2 – 3 răng

567k 93h 17 – 30

XII Dài 8,2 – 9,7 mm, chủy có 8 – 9 răng, ở phía trên

đốt đuôi mang 5 đốt gai ở phía sau, 2 đôi giữa có

dạng lông chim Tôm bơi thẳng và ưa bò trên đáy

và thành của bể

650k112h

19 - 35

Trang 16

2.2.Bệnh trên ấu trùng tôm càng xanh

2.2.1.Các bệnh do vi khuẩn

2.2.1.1 Bệnh hoại tử do vi khuẩn

Tác nhân gây bệnh: Các nhóm vi khuẩn Pseudomonas và vi khuẩn dạng sợi

Leucothrix Chúng hiện diện trên các sợi mang và trên các phần phụ Ngoài ra các

yếu tố như nhiệt độ thay đồi đột ngột, mật độ ấu tr ùng cao, chăm sóc quản lý khôngtốt sẽ làm giảm sức đề kháng của cở thể tôm v à làm cho bệnh trở nên ngày càngtrầm trọng hơn [6]

Đối tượng nhiễm: Thường xảy ra ở giai đoạn ấu trùng đặc biệt là giai đoạn

IV – V nhiễm cao [6]

Triệu chứng bệnh: Những ấu trùng bị bệnh thân thường có màu xanh xám,

không ăn yếu ớt và rớt xuống đáy bể Trên râu và các phần phụ xuất hiện các đốmnâu, hoại tử trên các phụ bộ Các điểm hoại tử phát triển rất nhanh, nếu khô ng được

xử lý kịp thời thì tỷ lệ chết rất nhanh [6]

Giai đoạn cấp tính thì ấu trùng có màu xanh nhạt, dạ dày rỗng yếu dần vàchìm xuống đáy bể chết [21]

2.2.1.2 Bệnh phát sáng

Tác nhân gây bệnh: Vi khuẩn phát sáng Vibrio harveyi gây bệnh trên các ấu

trùng giai đoạn sớm, bệnh thường gặp cả trên đối tượng tôm nước ngọt và nướcmặn [6]

Triệu chứng bệnh: Sự phát sáng có thể quan sát dễ d àng vào ban đêm.

Ngoài ra còn quan sát được cơ thể tôm mờ đục, bơi lội yếu dần và chết Đây là mộtbệnh nghiêm trọng có thể gây chết đến 100% Vi khuẩn n ày rất nhạy cảm vớiChloramphenicol và Novobiocin nhưng kháng l ại Streptomycin [5], [6]

2.2.1.3 Bệnh đốm nâu

Bệnh này hay còn được gọi là bệnh đốm đen, bệnh trên vỏ

Tác nhân gây bệnh: Có thể do các nhóm vi khuẩn như Aeromonas,

Pseudomonas [14] Ngoài ra các yếu tố như môi trường ô nhiễm, mật độ nuôi quá

Trang 17

dày, chế độ cho ăn và chăm sóc quản lý không tốt cũng gây cho bệnh phát triểnnhanh và tỷ lệ chết cao hơn [8], [14].

Bệnh này xuất hiện ở tất cả các giai đoạn phát triển c ủa tôm, bệnh này gâythiệt hại về kinh tế rất lớn, năng suất có thể giảm tới 30% [7], [8]

Triệu chứng bệnh: Tôm bị bệnh thường xuất hiện những đốm có màu nâu,

sau đó chuyển dần sang màu đen Tại các vết đen viêm dẫn đến lở loét Các vết nàynằm phía trong của lớp vỏ kitin nên khi tôm lột vỏ thì các vết này không mất đi.Tôm bị bệnh nặng thường kém ăn, gầy yếu, các phần phụ bị cụt hết v à chết [7], [8]

2.2.1.4 Bệnh do Ricketsia

Triệu chứng bệnh: Sự suy thoái khối gan tụy của ấu tr ùng bị bệnh.

Tác hại: Bệnh này gây thiệt hại rất lớn đến sản lượng tôm postlarvae, tỷ lệ tử

vong có thể đạt đến 95% Giai đoạn ấu trùng rất dễ mẫn cảm với bệnh này, đặc biệt

là giai đoạn ấu trùng IV – V [21]

2.2.2 Bệnh hoại cơ (Idiopathic Muscle Necrosis) (IMN )

Bệnh này được biết với nhiều tên gọi khác như bệnh trắng cơ (white muscledisease), bệnh hoại tử cơ (muscle necrosis), bệnh đục cơ (muscle opacity hoặc milkprawn disease) [31]

Tác nhân gây bệnh: Bệnh xảy ra khi tôm bị sốc môi tr ường, do không đảm

bảo vệ sinh, do thay đổi mật độ, giảm ox y hòa tan lớn, do mật độ nuôi quá dày.Bệnh có thể cũng xảy ra sau khi đem tôm post-larvae về nuôi được 1 hoặc 2 ngày

Bệnh này gây tỷ lệ chết cao ở ấu trùng tôm do sự chết hoại các sợi cơ TheoNash và cộng sự, 1987, cho rằng bệnh này gây chết 60% ở giai đoạn postlarvae 28ngày tuổi trong trại sản xuất giống ở Thái Lan

2.2.3 Bệnh do nguyên sinh động vật

Tác nhân gây bệnh: Các động vật nguyên sinh được tìm thấy trên tôm càng

xanh như Zoothamnium, Epistylis, Vorticella, Opercularia, Vaginicola, Cothurnia , Lagenophrys, Acineta, Podophria, Tokophrya và Ephelota [21] Chúng thường sống

ngoại sinh trên thân, các phần phụ và mang của tôm

Trang 18

Triệu chứng của bệnh: Khi ấu trùng bị nhiễm cơ thể có màu hơi đục Nếu

nhiễm nhẹ bệnh có thể hết sau khi lột xác Nếu nhiễm nặng nó gây ngăn cản quátrình lột xác, tôm khó khăn trong quá tr ình bơi lội, chìm dần xuống đáy và chết [6]

Tác hại của bệnh không chỉ làm tôm chậm lớn mà còn là nơi mà vi khuẩn rất

dễ xâm nhập và gây bệnh Những ao nuôi kém vệ sinh, n ước ô nhiễm, ít thay nướcthì tôm rất dễ nhiễm bệnh

2.2.4 Một số bệnh chưa xác định rõ tác nhân gây bệnh

2.2.4.1 Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larval Mid Cycle Disease- MCD)

Bệnh này thường xảy ra trong các giai đoạn ấu tr ùng từ IV – XI (Anderson

và cộng sự, 1990) Bệnh này gây thiệt hại lớn cho nghề ương giống tôm càng xanh[21]

Nguyên nhân gây bệnh: Vẫn chưa được xác định [6] Triệu chứng của bệnh

tương tự như bệnh hoại tử do vi khuẩn [6] MCD cũng có thể là một loại bệnh do rấtnhiều nguyên nhân khác [21]

Triệu chứng bệnh: Ấu trùng bị bệnh thường bỏ ăn và xảy ra hiện tượng ăn

thịt lẫn nhau, những con yếu, bị bệnh sẽ bị con khỏe h ơn ăn thịt Ấu trùng nhiễmbệnh có màu xám lơ, bơi lội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc Chúng chếthàng loạt và nhanh chóng trong vòng 2-3 ngày Thường khi bắt đầu chết, màu sắc

ấu trùng biến đổi trở lên nhạt hơn (mất sắc tố) [9], [10]

2.2.4.2 Bệnh lột xác dính vỏ

Bệnh này chủ yếu xảy ra ở giai đoạn ấu trùng, đặc biệt là sự lột xác biến tháisang giai đoạn postlarvae

Nguyên nhân gây bệnh: Vẫn chưa được xác định, có thể là do chất lượng

nước kém, lọc không kỹ hoặc do dinh dưỡng không tốt, thiếu [9]

Triệu chứng bệnh: Ấu trùng bị bệnh này không thể lột vỏ hoàn toàn ra khỏi

các phần phụ, mắt hay chủy khi chúng thay vỏ, l àm tôm không hoạt động được,không ăn được chết nhiều ở giai đoạn 11, không phát triển đến hậu ấu tr ùng [9].Hay sau khi lột vỏ thì bị di tật các phụ bộ làm cho chúng khó khăn trong quá tr ình

di chuyển và dần dần chết Tỷ lệ chết có thể lên tới 80% [6]

Trang 19

2.3 Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh

Bệnh đục thân hay còn gọi là bệnh đục cơ, bệnh trắng đuôi [16], [18], [30] Bệnh này được nghiên cứu và phát hiện đầu tiên ở Guadeoupe [19] Sau đóbệnh xuất hiện ở Martinique ( Ấ n Độ) và Đài Loan [31], 5 tỉnh khác ở Trung Quốc[24]], Thái Lan [32]

Bệnh này gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành công nghiệp nuôitrồng thủy sản của Ấn Độ và các trại nuôi tôm càng xanh [26], [28] Bệnh này cóthể gây chết rất nhiều, tỷ lệ tử vong có thể đạt tới 100% [27], [28]

Ở Việt Nam, bệnh đục thân là một bệnh mới xuất hiện trên tôm càng xanh,các nghiên cứu ở nước ta còn ít, mới chỉ bước đầu khảo sát dấu hiệu để tìm ra tácnhân Có hai luận văn tốt nghiệp của sinh viên thực hiện tại Viện Nghiên Cứu NuôiTrồng Thủy Sản II

2.3.2 Dấu hiệu của bệnh đục thân

Dấu hiệu của bệnh trắng đuôi được quan sát thấy ở tất cả các giai đoạn pháttriển của ấu trùng

Ấu trùng bị bệnh có dấu hiệu lờ đờ, bỏ ăn, mờ đục ở phần c ơ đuôi sau đó landần khắp cơ thể và phần đầu cuối cùng là toàn bộ cơ của phần đầu ngực và phầnbụng đều có màu trắng đục [26] Ấu trùng bị bệnh nặng cơ thể có màu trắng đục bịchết từ 2 – 3 ngày sau lần đầu chuyển post-larvae trong bể ương, mức độ chết đạtcực đại vào ngày thứ năm kể từ khi quan sát thấy các biểu hiện lần đầu tiên của

Trang 20

bệnh dẫn đến phải xả bỏ hoàn toàn trong bể ương, tỉ lệ chết rất khác nhau có thể đạt95% [22, [26], [28].

Khi quan sát mô tôm bị nhiễm ở phân đuôi và phần ngực, mô liên kết giữacác vi quản của khối gan tụy thấy sự hoại tử củ a khối cơ, sự hiện diện của các thểvirus [33]

2.3.3 Tác nhân gây bệnh

Tác nhân gây bệnh được phát hiện đầu tiên do Arcier và cộng sự (1999) xác

định do Nodavirus gây ra, được đặt tên là Macrobrachium rosenbergii nodavirus

(MrNV) Sau đó Qian và cộng sự (2003), phát hiện thêm một loại virus khác có tên

là extra small virus (XSV) XSV và MrNV đư ợc phát hiện trên tôm bị bệnh đục

thân thu từ Trung Quốc [24] Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus

(MrNV) và extra small virus (XSV) đư ợc tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuôi[16] Hiện nay, bệnh này chưa có một biện pháp điều trị nào cho hiệu quả vì vậy cáctrại nuôi, bể ương cần có biện pháp quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh

MrNV là một virus có dạng hình cầu đa diện 20 mặt, không có m àng bao

bọc, có đường kính khoảng 26 – 27 nm (Hình 2.1) Bộ gen của MrNV gồm 2 sợi

đơn RNA (RNA – 1 và RNA – 2) với kích thước tương ứng là 2,9kb và 1,3kb Vỏcapsid là một chuỗi protein có khối lượng 43kDa [16] Với những đặc điểm này vàkết quả giải trình tự đoạn RNA1 của MrNV thì MrNV được xếp vào họNodaviridae [16]

XSV là một tiểu thể giống virus có kích th ước nhỏ hơn virus MrNV, hình đa

diện 20 mặt, không có màng bao, có đường kính 14 - 16 nm (Hình 2.2) Bộ gen của

XSV là một sợi đơn RNA có kích thước khoảng 0,8 – 0,9 kb [24] Sau khi giải trình

tự bộ gen của XSV cho thấy RNA d ài 796 nucleotide và một đoạn poly (A) khoảng

15 – 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3’[29] Phân tích protein bằng SDS – PAGE chothấy thể XSV chứa hai polypeptide l à capsid 17 kDa (CP – 17) và capsid 16 (CP –16) [24]

Trang 21

Hình 2.1: Virus MrNV Hình 2.2: Virus XSV (Bonami và ctv, 2005)

Vai trò và mối quan hệ giữa MrNV và XSV chưa được rõ ràng Một điểmđặc biệt là MrNV có thể xuất hiện một mình trong các mẫu tôm bệnh, trong khi đóXSV chỉ xuất hiện trong các mẫu tôm bệnh khi đ ã nhiễm MrNV [24] Nên sự hiệndiện đồng thời của MrNV và XSV trong bệnh trắng đuôi được đặt ra giả thuyết làvai trò của mỗi loại virus này như thế nào trong việc phát triển cũng như trong quátrình phát sinh mầm bệnh? Theo Widada và Bonami (2004) cho rằng XSV không cógen mã hóa cho RNA polymease Nên có gi ả thuyết cho rằng XSV là một satellitevirus và XSV sử dụng enzyme RNA polymerase của MrNV nh ưng XSV sẽ mã hóamột chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầmbệnh của MrNV thì không xác định được [36] XSV là một kiểu virus satellite đầutiên được báo cáo là gây bệnh ở động vật và được ghi nhận là một satellite –nodavirus cộng hưởng đầu tiên [36]

2.3.4 Sự lây nhiễm

Virus MrNV và XSV truyền từ bố mẹ sang con, virus này hiện diện trong môsinh trứng và trứng đã thụ tinh Thế hệ con sinh ra từ tôm bố mẹ bị nhiễm virus sẽchết 100% khi phát triển đến giai đoạn postlarvae Tôm càng xanh bố mẹ mangvirus nhưng lại không quan sát thấy sự xuất hiện của dấu hiệu đặc tr ưng của bệnhtrắng đuôi [32] Vì thế chúng trở thành một vật mang virus rất là nguy hiểm

Artemia và một số loài tôm có thể là những vật mang virus rất nguy hiểmdẫn đến sự lây lan MrNV và XSV theo chiều ngang Artemia bố mẹ mang mầmbệnh của virus này sẽ truyền cho thế hệ con của chúng Khi tôm c àng xanh giống

Trang 22

được cho ăn nauplii của artemia đ ã bị nhiễm virus này thì tôm giống này sẽ bị chết

ngay chỉ sau vài ngày [32] Một số loài tôm như Penaeus monodon, Penaeus indicus, Penaeus japonicus là những vật mang virus này mặc dù virus này không

gây chết những loài tôm này [32]

2.4 Các phương pháp chuẩn đoán bệnh đục thân trên tôm càng xanh

Có rất nhiều phương pháp nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh nhưphương pháp mô học [15], [33]; kỹ thuật Northern blot [24]; kỹ thuật dot-blot [31];

kỹ thuật S-ELISA [26]; phương pháp lai tại chỗ [18], [30] Phương pháp RT-PCR[18], [27], [30], [31], [35], [36]

2.4.1 Phương pháp lai Dot – blot

Nguyên tắc

Kỹ thuật lai Dot – blot là một trong các kỹ thuật lai trên pha rắn, một tronghai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, tức là trình tự cần tìm) được cố địnhtrên một giá thể rắn, gọi là các màng lai Có hai loại màng lai: Màng lai bằngnitrocellulose- được sử dụng đầu tiên nhưng hiện nay không còn thông dụng vàmàng lai bằng nylon Ngày nay người ta thường sử dụng màng lai bằng nylon do có

độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau [1]

Phương pháp này cho phép định lượng tương đối một RNA đặc trưng trongmột hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra Phương pháp này người

ta không chuyển các nucleic acid từ gel lên màng lai mà đặt trực tiếp một lượngmẫu nhỏ lên màng lai hành một điểm – dot hay một khe – slot) Các RNA được cốđịnh trên màng lai sẽ được cho lai với mẫu dò đã được đánh dấu [1]

Mẫu dò là một đoạn DNA thu được từ RNA-1 của MrNV Đoạn DNA đượcđánh dấu bằng PCR với tác nhân là digoxygenine Mẫu dò này được sử dụng để laivới mẫu RNA- 1 thu được từ mẫu tôm bị nhiễm Mỗi mẫu (1µl) là một điểm trênmàng lai Mẫu sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai v à tiên lai, mẫu

dò được thêm vào để quá trình lai xảy ra Tiến hành rửa để loại đi mẫu dò không lai

ra khỏi màng lai Rồi thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG có gắn enzymeAlkaline phosphatase để phát hiện các phân tử có trên màng lai.Các kháng thể này

Trang 23

sẽ kết hợp với DIG có trong các thể lai giữa tr ình tự đích và mẫu dò Rửa tiếp đểloại bỏ các kháng thể tự do Sau đó ủ với c ơ chất của enzyme để thực hiện phản ứngmàu ngay trên màng lai.

Ứng dụng: J Sri Widada và cộng sự (2003; 2004) đã sử dụng kỹ thuật lai

Dot-blot để phát hiện virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh Với mẫu dò là mộtđoạn acid nucleic từ genome của virus đ ược tạo dòng trong các vector như

tpCR2.1-TOBO

2.4.2 Phương pháp ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay)

Đây là một phương pháp thử nghiệm hấp thu miễn dich nhờ enzym kết nốivới kháng thể đơn dòng và đa dòng Đây là một trong các kỹ thuật phân tích miễndịch dùng để phát hiện kháng nguyên một cách đặc hiệu

Nguyên tắc

Sử dụng kháng thể phủ lên các đĩa giếng, nếu có sự hiện diện của khángnguyên mục tiêu trong dung dịch mẫu thì kháng nguyên sẽ bị giữ lại trên bề mặtgiếng bởi kháng thể Các kháng nguyên này sẽ được phát hiên nhờ kháng thể thứcấp có gắn enzyme alkaline phosphate Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào giếng cácenzyme này sẽ xúc tác phản ứng thủy phân c ơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu.Bằng cách theo dõi sự biến đổi của màu có thể phát hiện sự hiện diện của khángnguyên

Kỹ thuật S-ELISA (Sandwich-ELISA) được Romestand và Bonami (2003)

sử dụng để chẩn đoán bệnh đục thân tr ên tôm càng xanh Sử dụng kháng thể củanodavirus, IgG (Immunoglobulin G) đ ể phát hiện protein capsid của MrNV Cáckháng thể này được đánh dấu bằng Biotin, sau đó sử dụng hệ thống Avidin -Peroxidase để phát hiện Đây là một phương pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh,

độ đặc hiệu và độ nhạy cao [26]

Trang 24

2.4.3 Phương pháp RT – PCR (Reverse Transcriptase - Polymerase Chain

Reaction)

Nguyên tắc

Vật chất di truyền của MrNV và XSV đều là RNA [16], [24] Enzyme Taq

polymerase không hoạt động trên RNA [1] nên không thể sử dụng trực tiếp kỹ thuậtPCR để nghiên cứu bệnh đục thân trên tôm càng xanh Do đó người ta phải sử dụngphối hợp kỹ thuật PCR với enzyme phiên mã ngược là reverse transcriptase Kỹthuật RT – PCR được ứng dụng trong việc khuyếch đại các cDNA, l à sản phẩm của

sự phiên mã ngược trước đó từ RNA

Kỹ thuật RT – PCR gồm 2 giai đoạn: giai đoạn phiên mã ngược và giai đoạnkhuyếch đại cDNA

Giai đoạn phiên mã ngược:

Giai đoạn khuyếch đại cDNA

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) do Karl Mullis và c ộng sự phát minh

năm 1985 [1], được sử dụng để khuyếch đại DNA.

Nguyên tắc

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từmạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạnDNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn v à DNApolymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã đượchình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase Thực vậy, nếu tacung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một tr ình tự DNA, ta

sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa l à để khuếch đạimột trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo cácmồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ng ược(antisnes primer) [1]

PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗichu kỳ gồm 3 giai đoạn:

Trang 25

Giai đoạn biến tính (Denaturation): Được tiến hành ở nhiệt độ cao

90-950C trong thời gian 30 giây-60 giây Các liên kết hidro bị phá vỡ, sợi DNA xoắnkép trở thành sợi đơn [1]

Giai đoạn bắt cặp (Annealing): khi nhiệt độ được hạ xuống thì các đoạn

mồi sẽ bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3’ theo nguyên tắc bổ sung.Nhiệt độ của giai đoạn này tùy thuộc vào Tm của các cặp mồi được sử dụng, thôngthường từ 40-700C trong 30 giây - 60 giây [1]

Giai đoạn tổng hợp (Elongation): Khi nhiệt độ tăng lên 70-720C thì cácenzyme DNA polymerase sẽ hoạt động gắn thêm các nucleotide vào cuối các đoạnmồi theo nguyên tắc bổ sung với sợi DNA khuôn v à kéo dài theo chiều 5’-3’ Thờigian của giai đoạn này tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA cần khuyếch đại,thường kéo dài từ 30 giây đến vài chục phút [12]

Một chu kỳ bao gồm 3 bước như trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, mỗi lầnlặp lại làm tăng gấp đôi số lượng các bản sao trước đó, nghĩa là số lượng các bảnsao được tăng lên theo cấp số nhân [1]

2.4.4 Phương pháp mô học truyền thống

Mô học là khoa học nghiên cứu sự phát triển, cách cấu tạo v à sự hoạt độngcủa các mô, các cơ quan của động vật, thực vật Từ đó mô học giúp chẩn đoán bệnhdựa trên những biến đổi vi thể của cấu trúc tế b ào, mô, cơ quan

Các bước làm tiêu bản mô học truyền thống (Theo Lightner D V,1996)

 Cố định mẫu

Mục đích của giai đoạn này là giữ mẫu ở trạng thái tế bào ít thay đổi nhất so với khisống và ngăn chặn những biến đổi sau khi chết

 Xử lý mẫu

Mục đích: Khử nước và làm trong mẫu sau đó tẩm parraffin

Khử nước: Là làm thế nào để rút hết nước trong mẫu mô ra mà không làm

mô và tế bào bị co, không làm vị trí của các thành phần cấu tạo trong mô thay đổi.Mẫu sau khi cố định sẽ được rửa qua nước sau đó ngâm trong cồn để khử n ước

Trang 26

Ngâm trong cồn với nồng độ cồn tăng dần để m ô không bị thay đổi, không bị co,không bị trương Còn nếu ngâm ngay vào cồn nguyên chất sẽ làm mô bị co lại.

Làm trong mẫu: Mục đích của phương pháp này là tẩy hết cồn ngấm trong

mẫu mô Dung dịch sử dụng thường là chloroform

Ngấm paraffin: Mục đích cho dung môi của paraffin trong mô được tẩy hết

 Đúc mẫu

Thực chất là vùi miếng mô vào một khối paraffin để sau khi vùi paraffin vàmiếng mô liên kết với nhau thành một khối thống nhất, giúp cho việc cắt mẫu th ànhnhững lát mỏng được dễ dàng hơn

Ứng dụng: C-Y Hsieh và cộng sự (2006) nghiên cứu mô học của tôm càng

xanh bị bệnh đục thân, kết quả cho thấy có sự hoại tử cơ, những thương tổn trong

mô cơ, hình thành những ổ viêm trong cơ và xuất hiện các thể vùi ưa kiềm trongkhối gan tụy, trên lá mang

2.4.5 Phương pháp lai tại chỗ

Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó tr ình tự nucleic acid cần tìm(trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô mà không cần qua giai đoạn táchchiết chúng ra khỏi tế bào hoặc mô [1]

2.4.5.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật lai tại chỗ dựa trên cơ sở của sự lai đặc hiệu giữa mẫu d ò được đánhdấu với trình tự đích cần tìm theo nguyên tắc bổ sung giữa các nucleotide

Trang 27

2.4.5.2 Kỹ thuật lai tại chỗ

Kỹ thuật in situ hybridization (Roche Applied Science, 2002)

Cố định mẫu trên lame

Xử lý mẫu trên lame

- Bảo vệ mẫu: làm bất hoạt các enzyme nội bào,

loại bỏ Rnase

- Thẩm thấu hóa: acid loãng, chất tẩy/cồn, protease

Tiền lai

Ủ với dung dịch lai (là dung dịch lai nhưng không có

mẫu dò) ở nhiệt độ như quá trình lai

Sau quá trình lai

- Rửa mẫu dò một cách nghiêm ngặt để loại những

phân tử lai không đặc hiệu

- Ủ với kháng thể

- Nhuộm bổ sung và dán lamelle

Quan sát trên kính và đọc kết quả

Mẫu dò

a Chọn mẫu dòDs: DNA, cDNASs: RNA, oligonucleic

Xác định các điều kiệncủa lai

- Nhiệt độ lai, pH,nồng độ củaformamide, muối

- Thành phần của dungdịch lai

- Nồng độ của mẫu dò

Hình 2.3: Sơ đồ tóm tắt kỹ thuật lai

Trang 28

 Cố định và cắt mẫu

Mẫu được cố định và xử lý mô bước đầu cũng giống như phương pháp mô họctruyền thồng Mẫu được cắt lát mỏng 4 - 7µm Sau đó các lát cắt này sẽ được cốđịnh trên một lam đã được phủ một lớp silane (lame dương) có tác dụng giúp cho

mô không bị tách rời ra khỏi lam trong quá tr ình lai với mức độ rửa rất nhiều

 Xử lý mẫu trên lame

Bước này nhằm bất hoạt các emzyme nội b ào, loai bỏ các Rnase, giảm hiệntượng bắt màu không đặc hiệu Thủy phân protein ngăn cản đ ược quá gây trở ngạicho sự tiếp xúc và lai giữa mẫu dò với trình tự đích bên trong mô

 Bất hoạt các enzyme nội bào

Trong quá trình phát hiện mẫu dò được đánh dấu các enzyme thường được

sử dụng như Peroxidase, Ankaline Phosphatase Tuy nhiên các enzyme này c ũng cósẵn trong tế bào do đó sẽ xảy ra hiện tượng bắt màu không đặc hiệu giữa enzymenội sinh và enzyme sử dụng để phát hiện Do vậy cần phải l àm bất hoạt các enzymenội sinh trước [25]

Để bất hoạt Alkaline Phosphatase th ường sử dụng Levamisole nhưng thườngenzyme này bị bất hoạt trong quá trình lai Với enzyme Peroxidase thường được xử

lý với 1% H2O2 trong methanol khoảng 30 phút [25]

Với Rnase được sử lý với mRNA trong SSC khoảng 60 phút [25]

 Thẩm thấu hóa

 Xử lý HCL Xử lý với HCL 0,2N với mục đích thủy phân được protein

xung quanh trình tự đích để giảm được sự bắt màu không đặc hiệu và rõnét [25]

 Xử lý chất tẩy, cồn Các chất tẩy như triton X – 100, Sodium Dedecyl

Sulfate và một số chất tẩy khác để tách liên kết của lipit trên màng tế bàogiúp cho quá trình lai giữa mẫu dò và trình tự đích được dễ dàng [25]

 Xử lý protein Xử lý protein để thủy phân protein xung quanh tr ình tự

đích [25]

Trang 29

 Acetyl hóa

Xử lý mẫu với acetic anhydride để acetyl hóa các nhóm điện tích d ương nhưnhóm amino của các acid amin Sự acetyl hóa n ày sẽ giảm được sự lai không đặchiệu của mẫu dò và loại bỏ được Biotin nội bào Ngoài ra acetic anhydride còn ng ăncản sự hoạt động của protein [29]

 Tiền lai (prehybridization)

Trong lai tại chỗ, trước hết tiêu bản sẽ được ủ với dung dịch lai (nhưng không cómẫu dò) khoảng 1 – 2 giờ ở nhiệt độ như trong quá trình lai Đảm bảo sự thẩm thấuđược hết mẫu và khóa vị trí mà có thể làm gắn không đặc hiệu của mẫu dò Với tiêubản, bước này có thể là không cần thiết và có thể làm giảm tín hiệu lai vì lượng mẫu

dò ít, bước này sẽ làm loãng nồng độ của mẫu dò [29]

 Sự biến tính mẫu dò và trình tự đích

Các yếu tố thường sử dụng để biến tính mẫu dò đó là:

- Dùng pH hoặc nhiệt độ cao hay dùng đồng thời cả hai yếu tố nay

Điều kiện biến tính mẫu dò có thể thay đổi theo thời gian hoặc nhi ệt độ [29] Mẫu

dò và trình tự đích sẽ được biến tính trước khi lai

Điều kiện rửa phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó chủ yếu phụ thuộc v àonhiệt độ và nồng độ muối Người ta thường tiến hành rửa trong dung dịch SSC

 Phát hiện phân tử lai

Phát hiện vị trí lai là rất quan trọng trong lai tại chỗ Trình tự đích được phát hiệnthông qua các vị trí lai của mẫu dò được đánh dấu Mỗi loại mẫu dò được đánh dấubằng những tác nhân khác nhau thì có những phương pháp phát hiện khác nhau [29]

Trang 30

Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin thì người ta sử dụng Avidin,Streptavidin, Extra-Avidin và kháng thể của Biotin để phát hiên [1], [29].

Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Digoxigenin thì sử dụng kháng thể củaDigoxigenin để phát hiện [29]

Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng chất phóng xạ th ì sử dụng kỹ thuật phóng

xạ tự ghi (hay tự chụp) để phát hiện [1]

Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Peroxidase (DNA và enzyme này hìnhthành một phức hệ vững chắc) Sau quá tr ình lai người ta cho màng lai tiếp xúc vớimột cơ chất của peroxidase có khả năng phát sáng khi biến đổi Ánh sáng phát ra sẽ

in dấu lên một phim và kết quả là những chấm trên phim [1]

 Mẫu dò DNA sợi đơn

 Mẫu dò DNA sợi kép

 Mẫu dò RNA

Trang 31

Phương pháp đánh dấu

Có rất nhiều phương pháp đánh như phương pháp nick -translation, thiết lậpmồi ngẫu nhiên (random primer labeling), PCR, mẫu dò kết thúc, in vitrotranslation Một số công ty bán kít và hóa chất để đánh dấu mẫu dò [29]

 Phương pháp Nick-Translation

Phương pháp này sử dụng hai loại enzyme: Deoxyribonuclease (DNase I) v àDNA polymerase [29]

Nguyên tắc: Dnase I sẽ cắt phân tử DNA ở nhiều vị trí tạo th ành những “lỗ

thủng” phân bố một cách ngẫu nhiên trên cả hai mặt Từ những lỗ thủng này, DNApolymerase I một mặt sẽ cắt dần các mạch bị cắt theo chiều 5’ -3’ nhờ hoạt tínhexonuclease 5’-3’mặt khác tổng hợp bù đoạn bị thiếu nhờ hoạt tính polymerase Do

đó trong hỗn hợp tham gia phản ứng có sự hiện diện của một loại nucleotide đánhdấu nên đoạn DNA sẽ được đánh dấu trên khắp chiều dài phân tử Sau phản ứng cácnucleotide tự do được loại bỏ có thể bắng phương pháp sắc ký lọc gel [1], [29]

 Phương pháp Random Primer Labeling (thiết lập mồi ngẫu nhiên)

Phương pháp này thích hợp với đoạn DNA ngắn (ngắn hơn 40ng) [29]

Nguyên tắc: Mẫu dò được làm biến tình bằng phương pháp sốc nhiệt Thêm vào

phản ứng một hỗn hợp các oligonucleotide tổng hợp (th ường dùng là cáchexanucleotide có 6 nucleotide) Các hexanucleotide này có th ể tương ứng với tất cảcác trình tự tổ hợp có thể có trên lý thuyết [1] Như vậy, chắc chắn sẽ có một sốhexanucleotide trong hỗn hợp bắt cặp được với hai mạch đơn của mẫu dò Lúc đó,chúng đóng vai trò là mồi cho các DNA polymerase hoạt động tổng hợp mạch bổsung DNA pol thường được sử dụng là đoạn Klenow hoặc T7 DNA pol [1]

 Phương pháp đánh dấu đầu cuối

Các oligonucleotide được tổng hợp dưới dạng mạch đơn rồi được đánh dấusau đó ở đầu 3’ enzyme terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) Các enzymenày sẽ xúc tác cho việc gắn các nucleotides đã được đánh dấu và đầu 3’ – OH củanhững đoạn DNA đơn hoặc kép trong nhiệt độ phản ứng [29] Sau phản ứng cácnucleotide tự do được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, sắc ký lỏng cao á p [1] Phương

Trang 32

pháp này đặc biệt được sử dụng để đánh dấu mẫu dò oligonucleotide (mẫu dò ngắnhơn 100bp) mà các phương pháp đánh d ấu mẫu dò khác như nick translation hayrandom primer không thích hợp, đặc biệt tốc độ của phương pháp này rất nhanh vàchính xác [29].

 Phương pháp đánh dấu mẫu dò RNA

Trình tự DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA phải được đưa vào một vector cómang các promoter dạng SP6, T3, T7 Các vector này được cắt ra thành dạng mạchthẳng, sau đó RNA polymerase thích h ợp được thêm vào phản ứng cùng với cácnucleotide đánh dấu RNA polymerase sẽ phiên mã trình tự DNA bắt đầu từpromoter, tạo ra một lượng lớn RNA được đánh dấu Sau phản ứng vector có mangtrình tự DNA gốc bị Dnase I phân hủy Các enzyme được loại bỏ qua tách chiếtbằng phenol và RNA được tinh sạch trên sắc ký lọc gel [1]

Ưu điểm: Độ nhạy cao cho tín hiệu mạnh với thời gian ph ơi sáng ngắn.

Nhược điểm: Có hại cho sức khỏe con người, cần nhiều biện pháp an toàn tốn

kém trong thao tác và xử lý chất thải [1]

 Đánh dấu bằng phương pháp hóa học

Sử dụng phương pháp hóa học để đánh dấu mẫu dò khắc phục được nhượcđiểm của việc đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ Nhưng lại có độ nhạy thấp Hóachất được sử dụng để đánh dấu như Biotin, Digoxigenin…

 Digoxigenin (DIG)

Digoxigenin liên kết Uridine ở vị trí C-5 qua một cánh tay bao gồm 11nguyên tử cacbon [25]

Trang 33

Hình 2.4 Digoxigenin – UTP/dUTP/ddUTP, alkali-stable

Phương pháp đánh dấu mẫu dò Digoxigenin được nghiên cứu và phát triểnbởi Roche applied science Năm 1990 m ột lọat các nghiên cứu của các nhà khoahọc như kesslerr, Muhlegger, Ruger và cộng sự, Martin và cộng sự, cho ra đời và bộkit đầu tiên đánh dấu mẫu dò DNA bởi DIG được sản xuất năm 1987 [25]

Trong lai mẫu dò được đánh dấu bởi DIG sau khi lai với tr ình tự đích người

ta sử dụng kháng thể của digoxigenin ( Anti-DIG) để phát hiện vị trí lai Kháng thểkết hợp với enzyme Ankaline Phosphatase, Peroxidase, Fluorescein, Rhodamin[25]

Ứng dụng: Các kết quả nghiên cứu của Sri Widada và cộng sự (2003), Hsieh

và cộng sự (2006) ,Wang và cộng sự (2008) đã nghiên cứu bệnh đục thân trên tômcàng xanh bằng phương pháp lai tại chỗ Sử dụng mầu dò DNA được đánh dấu bởiDigoxigenin đã phát hiện được MrNV Kết quả sự lây nhiễm virus ở các mô phầnbụng, phần đầu ngực, chân bơi và các phụ bộ, trong khối gan tụy

Trang 34

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Thời gian: Thực hiện từ tháng 08/2008 – 11/2008

Địa điểm: Trung tâm Quốc gia Quan trắc Cảnh báo Môi trường và Phòng

ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷsản II

3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU

3.2.1 Vật liệu và dụng cụ cho ứng dụng phương pháp lai tại chỗ và mô học truyền thống

Vật liệu

Mẫu tôm thương phẩm và tôm postlarvae (giai đoạn 18 ngày đến 40 ngàytuổi) có nguồn gốc từ các ao nuôi tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp Đối với tômthương phẩm thì cố định mẫu mang, gan, phần cơ Phải cố định nhanh khi tôm vẫncòn sống để đảm bảo cấu trúc mô học của mẫu bởi v ì khối gan tụy của tôm bị tiêuhủy rất nhanh sau khi tôm chết (sự ti êu hủy mô do chất dịch tự tiêu tiết ra từ tế bàogan tụy đã chết) Thu cả con để giữ mẫu

Mẫu tôm postlarvae sau khi cảm nhiễm đã được cố định trong dung dịchDavidsson

Dụng cụ và thiết bị

 Máy xử lý mẫu tự động

 Bình rót parafin

 Bộ phận làm lạnh mẫu

 Máy cắt mẫu microtome

 Nồi nước có chỉnh nhiệt độ

 Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính

 Tủ ấm

 Máy nhuộm mẫu tự động

 Kính hiển vi quang học

Trang 35

 Khay thủy tinh rửa mẫu

 Nhiệt kế

 Gang tay y tế, khẩu trang, lame dương, lam, lamelle, cassette và n ắp, képpanh, khuôn inox, lọ chứa mẫu tôm, bút chì, micropipette, eppendoff, bình tamgiác, ống đong, lọ thủy tinh đựng hóa chất, đầu type, đồng hồ hẹn giờ

 Thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin

 Keo dán Baume Canada

 Nước cất