Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử trong đó tr ình tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi tế bào hoặc mô [1].
2.4.5.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật lai tại chỗ dựa trên cơ sở của sự lai đặc hiệu giữa mẫu d ò được đánh dấu với trình tự đích cần tìm theo nguyên tắc bổ sung giữa các nucleotide.
2.4.5.2. Kỹ thuật lai tại chỗ
Kỹ thuật in situ hybridization (Roche Applied Science, 2002).
Cố định mẫu trên lame Xử lý mẫu trên lame
- Bảo vệ mẫu: làm bất hoạt các enzyme nội bào, loại bỏ Rnase
- Thẩm thấu hóa: acid loãng, chất tẩy/cồn, protease
Tiền lai
Ủ với dung dịch lai (là dung dịch lai nhưng không có mẫu dò) ở nhiệt độ như quá trình lai.
Biến tính mẫu dò và trình tự đích
- pH hoặc nhiệt độ - Đồng thời hoặc riêng rẽ
Quá trình lai
Thành phần của dung dịch lai - Hỗn hợp denhartd
- Formamide - Dextran sulphate
- Muối, sodium phosphate - Nucleic acid
Sau quá trình lai
- Rửa mẫu dò một cách nghiêm ngặt để loại những phân tử lai không đặc hiệu
- Ủ với kháng thể
- Nhuộm bổ sung và dán lamelle
Quan sát trên kính và đọc kết quả
Mẫu dò a. Chọn mẫu dò Ds: DNA, cDNA Ss: RNA, oligonucleic b. Chuẩn bị mẫu dò - DNA, cDNA - RNA, tạo dòng trên vector - Oligonucleic, c. Đánh dấu mẫu dò - Đánh dấu ngẫu nhiên, pp nick, PCR Xác định các điều kiện của lai - Nhiệt độ lai, pH, nồng độ của formamide, muối - Thành phần của dung dịch lai - Nồng độ của mẫu dò
Cố định và cắt mẫu
Mẫu được cố định và xử lý mô bước đầu cũng giống như phương pháp mô học truyền thồng. Mẫu được cắt lát mỏng 4 - 7µm. Sau đó các lát cắt này sẽ được cố định trên một lam đã được phủ một lớp silane (lame dương) có tác dụng giúp cho mô không bị tách rời ra khỏi lam trong quá tr ình lai với mức độ rửa rất nhiều.
Xử lý mẫu trên lame
Bước này nhằm bất hoạt các emzyme nội b ào, loai bỏ các Rnase, giảm hiện tượng bắt màu không đặc hiệu. Thủy phân protein ngăn cản đ ược quá gây trở ngại cho sự tiếp xúc và lai giữa mẫu dò với trình tự đích bên trong mô.
Bất hoạt các enzyme nội bào
Trong quá trình phát hiện mẫu dò được đánh dấu các enzyme thường được sử dụng như Peroxidase, Ankaline Phosphatase. Tuy nhiên các enzyme này c ũng có sẵn trong tế bào do đó sẽ xảy ra hiện tượng bắt màu không đặc hiệu giữa enzyme nội sinh và enzyme sử dụng để phát hiện. Do vậy cần phải l àm bất hoạt các enzyme nội sinh trước [25].
Để bất hoạt Alkaline Phosphatase th ường sử dụng Levamisole nhưng thường enzyme này bị bất hoạt trong quá trình lai. Với enzyme Peroxidase thường được xử lý với 1% H2O2 trong methanol khoảng 30 phút [25].
Với Rnase được sử lý với mRNA trong SSC khoảng 60 phút [25].
Thẩm thấu hóa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xử lý HCL. Xử lý với HCL 0,2N với mục đích thủy phân được protein
xung quanh trình tự đích để giảm được sự bắt màu không đặc hiệu và rõ nét [25].
Xử lý chất tẩy, cồn. Các chất tẩy như triton X – 100, Sodium Dedecyl Sulfate và một số chất tẩy khác để tách liên kết của lipit trên màng tế bào giúp cho quá trình lai giữa mẫu dò và trình tự đích được dễ dàng [25]. Xử lý protein. Xử lý protein để thủy phân protein xung quanh tr ình tự
Acetyl hóa
Xử lý mẫu với acetic anhydride để acetyl hóa các nhóm điện tích d ương như nhóm amino của các acid amin. Sự acetyl hóa n ày sẽ giảm được sự lai không đặc hiệu của mẫu dò và loại bỏ được Biotin nội bào. Ngoài ra acetic anhydride còn ng ăn cản sự hoạt động của protein [29].
Tiền lai (prehybridization)
Trong lai tại chỗ, trước hết tiêu bản sẽ được ủ với dung dịch lai (nhưng không có mẫu dò) khoảng 1 – 2 giờ ở nhiệt độ như trong quá trình lai. Đảm bảo sự thẩm thấu được hết mẫu và khóa vị trí mà có thể làm gắn không đặc hiệu của mẫu dò. Với tiêu bản, bước này có thể là không cần thiết và có thể làm giảm tín hiệu lai vì lượng mẫu dò ít, bước này sẽ làm loãng nồng độ của mẫu dò [29].
Sự biến tính mẫu dò và trình tự đích
Các yếu tố thường sử dụng để biến tính mẫu dò đó là:
- Dùng pH hoặc nhiệt độ cao hay dùng đồng thời cả hai yếu tố nay.
Điều kiện biến tính mẫu dò có thể thay đổi theo thời gian hoặc nhi ệt độ [29]. Mẫu dò và trình tự đích sẽ được biến tính trước khi lai.
Lai (hybiridization)
Tiêu bản được ủ qua đêm với dung dịch lai (có chứa mẫu dò) ở nhiệt độ thích hợp để diễn ra sự lai đặc hiệu giữa mẫu d ò và trình tự đích [29].
Rửa mẫu dò
Sau khi lai, tiến hành rửa để loại bỏ các mẫu dò tự do và trình tự lai không đặc hiệu. Thông thường điều kiện của quá trình rửa cũng gần giống như hoặc thấp hơn trong giai đoạn lai [29].
Điều kiện rửa phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó chủ yếu phụ thuộc v ào nhiệt độ và nồng độ muối. Người ta thường tiến hành rửa trong dung dịch SSC.
Phát hiện phân tử lai
Phát hiện vị trí lai là rất quan trọng trong lai tại chỗ. Trình tự đích được phát hiện thông qua các vị trí lai của mẫu dò được đánh dấu. Mỗi loại mẫu dò được đánh dấu bằng những tác nhân khác nhau thì có những phương pháp phát hiện khác nhau [29].
Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Biotin thì người ta sử dụng Avidin, Streptavidin, Extra-Avidin và kháng thể của Biotin để phát hiên [1], [29].
Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Digoxigenin thì sử dụng kháng thể của Digoxigenin để phát hiện [29].
Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng chất phóng xạ th ì sử dụng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (hay tự chụp) để phát hiện [1].
Nếu mẫu dò được đánh dấu bằng Peroxidase (DNA và enzyme này hình thành một phức hệ vững chắc). Sau quá tr ình lai người ta cho màng lai tiếp xúc với một cơ chất của peroxidase có khả năng phát sáng khi biến đổi. Ánh sáng phát ra sẽ in dấu lên một phim và kết quả là những chấm trên phim [1].