Tiến hành khảo sát cấu trúc tế bào tôm càng xanh bị bệnh đục thân và tôm không có dấu hiệu bị bệnh để phát hiện ra virus gây bệnh đục thân v à biểu hiện mô học. Khảo sát 12 mẫu tôm thương phẩm và tôm postlarvae (giai đoạn 18 ngày tuổi đến 40 ngày tuổi) thu tại An Giang và Đồng Tháp và 8 mẫu tôm postlarvae cảm nhiễm có biểu hiện của bệnh đục thân (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Bảng dấu hiệu lâm sàng của các mẫu Loại tôm STT Kí hiệu
mẫu Nơi thu Dấu hiệu lâm sàng
1. A2 An Giang
2. A4 An Giang
Cơ thể yếu, lờ đờ, biếng ăn, nổi lên nhiều vào buổi sáng, cơ thể
có màu trắng đục 3. 421 An Giang 4. 422 An Giang 5. 423 An Giang 6. 424 An Giang 7. 425 An Giang Tôm lớn 8. 426 An Giang
Cơ thể yếu, bơi gần bờ, biếng ăn,
dấu hiệu trắng đục toàn bộ ở phân đuôi, cơ bụng và lan đến
phần đầu.
9. A5-1 An Giang
10. A5-2 An Giang
Cơ thể yếu, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, cơ
bụng và lan đếnphần đầu
11. A8 Đồng Tháp
12. A9 Đồng Tháp Cơ thể khỏe mạnh, không códấu hiệu bị bệnh đục thân.
13. C 4 Đồng Tháp 14. C 5 Đồng Tháp 15. C 6 Đồng Tháp 16. C 7 Đồng Tháp 17. C 8 Đồng Tháp 18. C 9 Đồng Tháp 19. C 10 Đồng Tháp Tôm post 20. C 11 Đồng Tháp
Cơ thể yếu, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, cơ
bụng và lan đến phần đầu.
Quan sát các mẫu thu được, ghi nhận tôm càng xanh hay ấu trùng và tôm postlarvae bị bệnh đục thân thường xuất hiện các dấu hiệu như cơ thể mờ đục, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần cơ đuôi sau đó lan dần đến phần cơ bụng và
phần đầu. Những mảng trắng này sẽ lan rộng ra toàn bộ phía đuôi và phần đầu. Khi tôm bị nhiễm nặng thì toàn bộ cơ thể bị trắng đục. Ban đầu tôm chết rải rác nh ưng tỷ lệ chết tích lũy cũng rất cao (Hình 4.1).
Kết quả phân tích mô học trên cơ của tôm càng xanh
Kết quả phân tích mô học mẫu tôm c àng xanh thu tại An Giang và Đồng Tháp được ghi nhận trong bảng 4.2.
Kết quả phân tích mô học của cơ tôm trưởng thành và ấu trùng tôm cho thấy có sự hoại tử cơ, những thương tổn trong các khối cơ như ở khối cơ dọc sự hoại tử cơ và tiêu hủy cơ tạo ra những khoảng trống trong c ơ (Hình 4.2 B).Trong 20 mẫu phân tích thì có 9/20 mẫu (45%) có biểu hiện hoại tử, xuất hiện những ổ vi êm trong cơ và biểu hiện bất thường của các khối cơ. Trong khi đó ở tôm càng xanh không co dấu hiệu bị bệnh đục thân thì các khối cơ phân bố đều đặn, giữa các khối cơ dọc, cơ ngang và sự phân bố đều đặn giữa các sợi cơ vân (Hình 4.2 A). Điều này cũng được Arcier và cộng sự (1999), Vijayan và cộng sự (2005) mô tả khi nghiên cứu mô cơ bị bệnh đục thân trên tôm càng xanh.
Hình 4.1. Hình Post- larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, phần bụng và phần đầu
Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học truyền thống (H&E) các mô ở tôm càng xanh
Kết quả phân tích mô học STT Thể vùi trong gan
tụy Thể vùi trên mang Hoại tử cơ
1. _ _ _ 2. _ _ + 3. _ _ + 4. _ _ + 5. _ _ + 6. _ _ + 7. _ _ + 8. _ _ + 9. + + + 10. + + + 11. _ _ _ 12. _ _ _ 13. _ _ _ 14. _ _ + 15. + _ _ 16. _ _ + 17. + _ _ 18. + _ _ 19. + + _ 20. + _ _ Tổng cộng ∑mẫu(+)/∑mẫu kiểm tra 7/20 Tỷ lệ 35% 3/20 Tỷ lệ 15% 9/20 Tỷ lệ 45%
A B Hình 4.2: Tổ chức mô cơ ở tôm càng xanh
A. Cấu trúc bình thường của mô cơ, (H&E)(100X) B. Sự hoại tử mô cơ (H&E) (100X)
MI- cơ cắt ngang, MII- cơ cắt dọc, MN – sự hoại tử cơ
Kết quả phân tích mô học trên gan tụy
Quan sát tế bào gan tụy, ghi nhận có sự xuất hiện của các thể vùi với nhiều hình dạng khác nhau trong tế bào chất ở trong tổ chức gan tụy của ấu tr ùng tôm bị bệnh (Hình 4.3). Với các tế bào bị nhiễm thể vùi trong nhân tế bào khối gan tụy trương lên chiếm hết cả tế bào không nhìn thấy nhân con bắt màu hồng của thuốc nhuộm (INOs). Đối với tế bào gan tụy bình thường, các tế bào sắp xếp kề nhau giữa chúng có một lớp tế bào liên kết, khoảng trống bên trong khối gan tụy bình thường. Với tế bào bình thường thì tế bào bắt màu nâu và nhìn thấy rõ nhân bên trong tế bào (E). Hsieh và cộng sự (2006) khi nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ở Thái Lan cùng nhận xét khi tế bào tôm bị bệnh cũng xuất hiện thể vùi trong khối gan tụy. Kết quả kiểm tra 20 mẫu thì 7/20 mẫu (35%) có sự xuất hiện của thể vùi trong nhân tế bào gan tụy.
A B Hình 4.3: Tổ chức tế bào khối gan tụy
E – nhân bình thường, INOs- thể vùi nội nhân, MII- cơ cắt dọc (H&E), X 10.
Kêt quả phân tích mô học trên mang
Quan sát thấy sự xuất hiện thể vùi hình oval và hình tròn trong các tế bào mang, sự xuất hiện thể vùi trong mang đó là dấu hiệu đầu tiên được ghi nhận (Hình
4.4). Nhưng sự xuất hiện thể vùi trên mang rất ít, chiếm 15% trong tổng số mẫu kiểm tra.
A B
A B
Hình 4.4: Sự xuất hiện thể vùi trên cơ quan mang của ấu trùng tôm càng xanh
Kết quả phát hiện mầm bệnh bằng kỹ thuật ISH
Trong quá trình thực hiện phương pháp lai tại chỗ (ISH), sử dụng mẫu dò DNA có đánh DIG, dưới kính hiển vi quang học phát hiện vùng nhiễm virus bắt màu đen dưới vật kính 4X và xuất hiện các thể vùi bắt màu đen dưới vật kính 4X (Hình 4.6) trong ống thực bào của khối gan tụy đó chính là sự hiện diện của RNA của virus MrNV (Hsieh và cộng sự, 2006). Vùng không nhiễm virus bắt màu xanh của thuốc nhuộm.
Cơ chế bắt màu đen của mẫu được giải thích như sau: Lát cắt cho lai với mẫu dò DNA có đánh dấu Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Sau bước này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính tr ên lame và mẫu dò được gắn thên Anti-DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase l àm hiển thị màu bằng dung dịch phát triển có chứa NBT v à BCIP. Xảy ra phản ứng oxy hóa khử giữa enzyme và NBT, BCIP, sự vận chuyển điện tử sẽ tạo ra sản phẩm hiện màu, dễ dàng quan sát được dưới kính hiển vi [25], [29].
Đồng thời đã phát hiện sự hiện diện của virus ở phần c ơ đuôi, cơ bụng, thực bào trong ống gan tụy, các phần phụ như ở chân bơi và chân bò(Hình 4.6).
Tuy nhiên qua quá trình thực hiện phương pháp lai thì không quan sát được sự nhiễm virus ở trên mang và tế bào biểu bì.
Với những ấu trùng tôm khỏe mạnh (mẫu A8) sử dụng RT-PCR để phát hiện cho kết quả âm tính và khi tiến hành lai thì không thấy có dấu hiệu của sự nhiễm virus trong tế bào (Hình 4.5). Chứng tỏ, RNA của MrNV không tìm thấy trong tế bào mô cơ của tôm khoẻ khi chẩn đoán và xét nghiệm bằng phương pháp lai tại chỗ.
A B
Hình 4.5: Hình mô tôm khỏe mạnh mẫu A8
Hình A: Mô cơ bình thường, H&E, ( 100X)
Bảng 4.3. Kết quả phát hiện MrNV và XSV với phương pháp ISH và kỹ thuật RT-PCR
STT Kí hiệu mẫu ISH RT-PCR
1. A2 + + 2. A4 + + 3. 421 _ _ 4. 422 _ _ 5. 423 _ _ 6. 424 _ _ 7. 425 _ _ 8. 426 _ _ 9. A5-1 + + 10. A5-2 + + 11. A8 _ _ 12. A9 _ _ 13. C 4 + + 14. C 5 + + 15. C 6 + + 16. C 7 + + 17. C 8 + + 18. C 9 + + 19. C 10 + + 20. C 11 + + Tỷ lệ phát hiện (%) 60% 60%
A1 A2
B1 B2
C1 C2
Hình 4.6: Tế bào nhiễm MrNV trên các cơ quan khác nhau của tôm sau khi nhuộm ISH
Hình A1, A2: Tế bào nhiễm MrNV trong thể thực bào của ống gan tụy (100X), (400X)
Hình B1, B2: Tế bào nhiễm MrNV trên phụ bộ của tôm (40X), (100X) Hình C1, C2: Tế bào nhiễm MrNV trên cơ (40X), (100X)
Kết quả xét nghiệm các mẫu tôm thu bằng kỹ thuật RT -PCR, ghi nhận mẫu có biểu hiện đặc trưng của bệnh như xuất hiện những mảng trắng đục toàn bộ cơ thể ấu trùng tôm, kém ăn (mẫu ký hiệu 421, 422, 423, 424, 425, 426), khi quan sát trên lát cắt mô thấy xuất hiện ổ viêm trong cơ, những thương tổn vùng cơ (Bảng 4.1) nhưng khi tiến hành xét nghiệm RT-PCR thì lại cho kết quả âm tính với MrNV v à XSV, tiến hành lai tại chỗ thì cũng không phát hiện sự nhiễm của virus (Bảng 4.3).
Với những mẫu A5, C4, C5, C6, C7, C8, C9, C10, C11, có biểu hiện đặc trưng của bệnh như xuất hiện những mảng trắng ở phần đuôi sau đó lan đến phần bụng và phần đầu, quan sát mô học thấy xuất hiện hoại tử c ơ, thể vùi trong tế bào gan tụy và trên cơ quan mang. Khi tiến hành xét nghiệm RT-PCR cho kết quả dương tính với virus MrNV (Bảng 4.1); (Bảng 4.3). Khi tiến hành lai có sử dụng mẫu dò DNA đánh dấu DIG đặc trưng cho virus MrNV, quan sát dư ới kính hiển vi quang học thấy những tế bào kết tủa màu đen, màu này cho biết sự hiện diện tương ứng RNA của virus MrNV (Sri Widada và cộng sự, 2003). Qua đó cho thấy khả năng phát hiện MrNV bằng kỹ thuật RT-PCR và phương pháp ISH có s ự tương đồng. Như vậy với cả hai phương pháp này đều phát hiện thấy sự hiện diện của virus MrNV trên ấu trùng tôm càng xanh bị bệnh đục thân.
Với mẫu dò DNA có đánh dấu DIG, theo Widada và cộng sự (2003) đã phát hiện sự hiện diện của virus MrNV trên cơ bụng, cơ đuôi và phần phụ như chân bơi nhưng tác giả lại không quan sát thấy sự nhiễm virus ở tế b ào gan tụy tôm bị bệnh đục thân tại Trung Quốc. Theo Hsieh và cộng sự (2006) phát hiện sự nhiễm virus mô cơ, gan tụy nhưng lại không phát hiện được sự nhiễm virus ở phần phụ tôm bị bệnh ở Thái Lan. Trong báo cáo gần đây nhất, với mẫu dò này Wang và cộng sự (2008) phát hiện sự nhiễm virus ở mô cơ nhưng lại không phát hiện thấy ở phần phụ và gan tụy. Qua đó cho thấy kết quả thu được qua quá trình lai tại chỗ với mẫu tôm ở Đồng Tháp và An Giang tương ứng với các kết quả của các nghiên cứu này (Hình 4.7).
A B
Hình 4.7. Tế bào nhiễm MrNV trên cơ quan gan tụy sau khi nhuộm ISH
Hình A: tiêu bản của nghiên cứu này.
Hình B: Tiêu bản của Hsieh và cộng sự (2006).
Bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh đã được rất nhiều tác giả trên thế giới nghiên cứu để tìm ra tác nhân gây bệnh. Vijayan và cộng sự (2005), ghi nhận tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn gram dương là Lactococcus nhiễm trên tôm ở Ấn Độ. Nhưng dấu hiệu lâm sàng của bệnh đó là sự xuất hiện vết trắng đục sau lan dần về phía đầu ngực và toàn bộ cơ thể. Khi quan sát mô học thấy xuất hiện các ổ viêm trong cơ. Không thấy quan sát được sự xuất hiện của thể vùi. Trong báo cáo của Peng và cộng sự (1998) nghiên cứu về virus gây hội chứng đốm trắng (WSSV) nhiễm trên tôm càng xanh, ghi nhận xuất hiện thể vùi trong tế bào biểu mô và mô liên kết ở phần đầu, không quan sát thấy thể v ùi trên cơ quan mang và gan tụy, cũng có dấu hiệu xuất hiện những đốm trắng ở cơ bụng và phần đầu. Nhưng có sự khác biệt với bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh về những thương tổn mô cơ và sự hoại tử cơ. Qua nghiên cứu này, kiểm chứng qua phương pháp lai tại chỗ ghi nhận khi tôm nhiễm virus MrNV th ì có dấu hiệu sự hoại tử cơ, xuất hiện thể vùi trong tế bào gan tụy, không hình thành những ổ viêm trong cơ. Do đó dấu hiệu đặc trưng của bệnh đục thân khi nhiễm virus đó là biểu hiện mô học là sự hoại tử cơ, xuất hiện thể vùi trong tế bào gan tụy và cơ quan mang, không xuất hiện những ổ viêm trong cơ khi phân tích mô h ọc các cơ quan này.