Phương pháp ISH, mô học truyền thống, RT-PCR được so sánh dựa trên các tiêu chí sau: độ chính xác, độ nhạy, tính hiệu quả, thực hiện trên 10 mẫu tôm post-larvae thu có biểu hiện lâm sàng của bệnh rất rõ ràng.
Bảng 4.4: Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bện h MrNV của ba phương pháp ISH, mô học truyền thống và RT-PCR trên tôm ấu trùng
Các phương pháp phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân
STT RT-PCR Mô học truyền thống ISH 1 ++ + + 2 ++ + + 3 + _ + 4 + + + 5 + _ + 6 + + + 7 + + + 8 + _ ++ 9 + + ++ 10 + + ++ Tổng cộng ∑Mẫu (+)/∑ mẫu kiểm tra 10/10 Tỉ lệ 100% 7/10 Tỉ lệ 70% 10/10 Tỉ lệ 100%.
0 20 40 60 80 100 120 RT-PCR MÔ HỌC ISH % Phát hiện phương pháp
Đồ thị 4.1. Tỷ lệ nhiễm MrNV trên 10 mẫu thu có biểu hiện bệnh
Bảng kết quả Bảng 4.3, cho thấy có sự khác biệt về khả năng phát hiện tế
bào nhiễm virus giữa phương pháp ISH và kỹ thuật RT-PCR với phương pháp mô học truyền thống. Phương pháp ISH và kỹ thuật RT-PCR phát hiện được 10 mẫu dương trong tổng 10 mẫu kiểm tra chiếm tỉ lệ 100%, trong khi với phương pháp mô học truyền thống chỉ phát hiện được 7 mẫu dương trong tổng 10 mẫu kiểm tra chiếm tỉ lệ 70%.
Đặc biệt khi quan sát dưới kính hiển vi quang học, các mẫu nhuộm ISH biểu hiện tế bào nhiễm rất rõ ràng trong ống thực bào của tế bào gan tụy, có thể phát hiện ngay ở vật kính 4X (Hình 4.8 B1), nhưng dưới vật kính này thì phương pháp mô học truyền thống không quan sát thấy sự hiện diện thể vùi trên tế bào gan tụy. Mà chỉ thấy được sự bất thường trong các ống gan tuy khi quan sát dưới vật kính 10X (Hình 4.8 A). Trên 3 mẫu C4, C6, C9, phương pháp ISH đều cho kết quả dương tính với tỷ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm khá cao nhưng mô học lại không phát hiện được (Bảng 4.4). Như vậy độ nhạy của phương pháp ISH cao hơn phương pháp mô học truyền thống.
A1 A2
B1 B2 B3
Hình 4.8: Tế bào nhiễm MrNV sau khi nhuộm ISH và mô học truyền thống. (chụp cùng một vị trí trên mẫu C8)
A1, A2: Mô học tế bào nhiễm MrNV trên gan tụy tôm với biểu hiện bất thường của gan tụy, H&E, X40(A1), X100(A2).
B1, B2, B3: ISH tế bào nhiễm MrNV trên gan tụy tôm (40X), (100X), (400X). Nhân tế bào nhiễm bắt màu rất đẹp và rõ nét.
Sự khác biệt này có thể lý giải như sau:
Sở dĩ phương pháp mô học truyền thống có độ nhạy thấp nhất là do khả năng phát hiện tế bào phụ thuộc rất nhiều vào kỹ thuật làm tiêu bản như quá trình đúc mẫu, chất lượng cắt. Khi tế bào nhiễm mầm bệnh đều có những biểu hiện khác biệt (như ở mô cơ thì xuất hiện sự hoại tử cơ (Hình 4.2), những thương tổn trong cơ có thể hình thành những ổ viêm trong cơ hay xuất hiện thể vùi trong khối gan tuỵ và cơ quan mang (Hình 4.3) với nhiều hình dạng như hình tròn bắt màu hồng đậm của thuốc nhuộm. Nhưng sẽ rất khó phát hiện giai đoạn xâm nhập đầu tiên của mầm bệnh bằng phương pháp mô học khi mức độ nhiễm mầm bệnh còn thấp và chưa có biến đổi tổ chức tế bào đặc trưng (Đỗ Thị Hoà, 2005). Vì vậy phương pháp mô học truyền thống kém hơn kỹ thuật RT-PCR và phương pháp lai tại chỗ về độ nhạy và
khả năng phát hiện mầm bệnh. Độ nhạy của phương pháp này phụ thuộc rất nhiều vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc mẫu.
Phương pháp ISH: Phương pháp này dựa trên cơ sở sự lai đặc hiệu
của mẫu dò được đánh dấu với trình tự đích cần tìm theo nguyên tắc bổ sung giữa các nucleotid. Mẫu dò là một bản sao của gen của virus MrNV, nó chỉ lai với gen của virus này mà thôi nên qua sự lai của mẫu dò với trình tự đích nên ta có thể phát hiện và định vị được trình tự ấy trong lát cắt mô. Nên với một lượng virus nhiễm trong tế bào thì chắc chắn sẽ phát hiện và định vị được virus đó ngay trong lát cắt mô. Với ISH người đọc mẫu dễ dàng nhận biết được tế bào nhiễm trên cơ đuôi, cơ bụng, tế bào gan tụy, các phần phụ như chân bơi ngay ở vật kính nhỏ (Hình 4.6), và cường độ nhiễm được phát hiện sẽ nhiều hơn và rõ nét hơn. Do đó mà phát hiện được nhiều cá thể bị nhiễm và nhiều tế bào nhiễm hơn mô học truyền thống.
Ưu điểm của phương pháp này là phát hiện được cơ quan đích của virus. Phát hiện được tác nhân gây bệnh qua biểu hiện trên tiêu bản mẫu. Khi kiểm tra đòi hỏi độ chính xác, kỹ thuật cao chẩn đoán chính xác được bệnh để có biện pháp chữa trị kịp thời thì ISH là một giải pháp rất thích hợp để nghiên cứu sâu (Sri Widada và cộng sự, 2003). Khi lai tại chỗ, sử dụng mẫu dò DNA có đánh dấu DIG, mẫu dò đặc trưng cho MrNV, đó là một nghiên cứu sâu để chẩn đoán chính xác được tác nhân (Hsieh và cộng sự, 2006)
Do điều kiện thời gian có giới hạn số mẫu thu đ ược chưa nhiều vì thế số mẫu không đủ để có thể so sánh được độ nhạy của hai phương pháp RT-PCR.
Nhưng phương pháp RT-PCR có khả năng phát hiện cao do RNA của virus được khuyếch đại 2 lần nên dễ dàng phát hiện được virus. Phương pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lượng rất thấp. Trong quá trình xét nghiệm mẫu được đồng nhất trên tất cả các bộ phận của cơ thể nên khả năng phát hiện mầm bệnh cao. RT-PCR là một phương pháp rất nhiều ứng dụng bởi vì RT-PCR là phương pháp kiểm tra sức khoẻ và phát hiện được giai đoạn sớm của virus khi lượng virus trong tế bào còn ít và ở dạng tiềm ẩn (Sri Widada và cộng sự, 2003).
Đối với bệnh này, phương pháp RT-PCR là một phương pháp rất có hiệu quả khi phát hiện tác nhân gây bệnh. Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu và ứng dụng phương pháp này trong phát hiện bệnh đục thân trên ấu trùng tôm như: Sri Widada và cộng sự (2003); Qian và cộng sự (2003); Bonami và cộng sự (2005); Sahul Hameed và cộng sự (2004); Shekhar và cộng sự (2006); Yoganandhan và cộng sự (2006). Nhưng vẫn chỉ phát hiện được mầm bệnh chứ không thể xác định được cơ quan đích của mầm bệnh như phương pháp lai tại chỗ.