3.2.3.1. Phương pháp làm lame dương
- Chuẩn bị 2% dung dịch AES:
+ AES 2%(A – 3648) 5ml
+ Acetone 250ml
- Lắc đều dung dịch sau đó đổ ra khay thủy tinh rồi ngâm lame v ào trong thời gian 1 – 5 phút.
- Lấy lame ra và để khô ở nhiệt độ phòng trong 1 – 2 giờ. - Ngâm nhiều lần các lame trong các khay n ước cất.
- Sau đó để khô lame ở nhiệt độ phòng rồi cất lame vào hộp tối để ở nhiệt độ phòng.
Sử dụng lame trong vòng 60 ngày. Cứ 255ml dung dịch ASE 2% phù hợp ngâm 200 lame.
3.2.3.2. Phương pháp tổng hợp và đánh dấu mẫu dò (Roche Applied Science, 2006)
Giai đoạn 1: Thực hiện phản ứng RT- PCR khuyếch đại một trình tự trên RNA 1
của MrNV
Sử dụng cặp mồi: MrNV1F: TCCAACACCTCGCATAGC MrNV1R: CACTCTTAACCCCCACTCC Kích thước sản phẩm: 590 (Sahul Hameed, 2004).
Bổ sung các hóa chất sau vào các tube phản ứng. Hóa chất Thể tích cần sử dụng Nước DEPC 60 µl Mồi MrNV1R: 3 µl Mồi MrNV1F: 3 µl Mix: 75 µl Enzyme RT: 3 µl RNA mẫu : 2 µl
Thực hiện phản ứng RT-PCR. Thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt theo các chu kỳ sau:
Phiên mã ngược 520C trong 30 phút Biến tính chung 940C trong 2 phút Biến tính 940C trong 40 giây Bắt cặp 550C trong 40 giây Tổng hợp 680C trong 60 giây
Hoàn thiện quá trình tổng hợp 720C trong 7 phút Giữ ở nhiệt độ 40C
Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng PCR tổng hợp và đánh dấu mẫu dò
Sử dụng 2 µl sản phẩm ở giai đoạn 1 làm khuôn cho phản ứng. Sử dụng cặp mồi nhưGiai đoạn 1.
Bước 1: Giải đông hóa chất và bảo quản trong đá lạnh
Vortex và ly tâm tất cả các hóa chất trước khi sử dụng.
Bước 2: Chuẩn bị dung dịch mồi xuôi và mồi ngược cho phản ứng với nồng độ 10X Bước 3: Bổ sung các thành phần vào tube phản ứng theo Bảng 3.1.
Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho đánh dấu mẫu d ò Thể tích cần sử dụng Hóa chất Mẫu dò đánh dấu DIG Mẫu dò đối chứng không đánh dấu Nồng độ
Nước Bổ sung đủ 50 µl Bổ sung đủ 50 µl Đệm PCR có MgCl2 10X (vial 3) 5 µl 5 µl 1 X Mix PCR tổng hợp mẫu dò đánh
dấu DIG (vial 2) 5 µl -
200 µM dATP, dCTP, dGTP, 130 µM dtTP, 70 µM DIG-dUTP Dung dịch dNTP (vial 4) - 5 µl 200 µM mỗi dNTP
Mồi xuôi cho phản ứng PCR
(10X) 5 µl 5 µl 0,1-1 µM
Mồi ngược cho phản ứng PCR
(10X) 5 µl 5 µl 0,1-1 µM
Mix enzyme
(vial1) 0,75 µl 0,75 µl
Tổng thể tích 50 µl 50 µl
Bước 4: Trộn đều các thành phần trong tube phản ứng Bước 5: Chạy PCR
Thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt theo các chu kỳ sau: Phiên mã ngược 520C trong 30 phút
Biến tính chung 940C trong 2 phút Biến tính 940C trong 40 giây Bắt cặp 550C trong 40 giây Tổng hợp 680C trong 60 giây
Hoàn thiện quá trình tổng hợp 720C trong 7 phút Sử dụng 5 µl mẫu để tiến hành điện di
Phần còn lại giữ ở nhiệt độ +2 đến +80C hoặc -15 đến -250C trước khi sử dụng. Nếu giữ ở -15 đến -250C thì mẫu dò có thể sử dụng được trong vòng 1 năm.
Bước 6: Điện di sản phẩm trên gel để chọn mẫu dò
Tiến hành điện di trên gel 2% cùng với thang DNA. Sau khi điện di chuyển bản gel lên bàn đọc tia tử ngoại. Tiến hành quan sát và so sánh kết quả với thang DNA.
3.2.3.3.Phương pháp mô học truyền thống và lai tại chỗ (ISH) Quy trình mô học (Lighner, 1996 )
-Cố định mẫu trong dung dịch cố định.
Cố định mẫu trong dung dịch Davidsson có các th ành phần như sau:
Cồn 95% 330ml
Formalin 220ml
Acid acetic 115ml
Nước cất 335ml
Cũng có thể cố định mẫu ấu trùng trong dung dịch RNA-friendly (R-F) (Manual of OIE, 2003). Có các thành phần như sau:
Cồn 95% 407ml
Formalin 100% 349ml
Ammonium hydroxide 22ml
Nước cất 222ml
pH 6 – 7
Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng nhỏ, bỏ
vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson.
Với tôm thương phẩm: Cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang v à gan tụy,cắt phần cơ có dấu hiệu để vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch Davidson.
Tỷ lệ mẫu : hóa chất = 1 : 10
- Xử lý mẫu.
Mẫu được lấy ra khỏi dung dịch cố định v à được chuyển vào cassette. Rồi rửa mẫu đã cố định trong dung dịch dưới vòi nước chảy 1 – 2giờ. Sau đó xử lý mẫu theo quy trình nhưSơ đồ 3.1.
Quy trình được thực hiện bằng máy LEICA TP 1020 (Đức).
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ.
- Đúc mẫu.
Đúc mẫu trong paraffin sao cho mẫu ở trung tâm khuôn v à phần mô cần cắt chiếm diện tích lớn. Sau đó đợi khoảng 15 phút mẫu lạnh, khối paraffin đ ã cứng, tách khối paraffin ra khỏi khuôn.
-Cắt mẫu.
Cắt khối paraffin có chứa mẫu bằng máy cắt microtome, bề d ày mỗi lát cắt từ 4 - 6µm.
Nhỏ dung dịch cồn 70oC lên trên mặt mẫu sao cho thấm hết toàn bộ lát cắt. Dùng lame vớt lát cắt rồi chuyển lát cắt vào nồi ấm 40oC để làm căng bề mặt của mẫu.
Cồn 70%
30 phút Cồn 95% (1)30 phút Cồn 95% (2)30 phút Cồn 95% (3)30 phút
Chlorform (1)
1,5 giờ Cồn tuyệt đối(3) 30 phút
Chlorform (2) 1,5 giờ Cồn tuyệt đối (1) 30phút Cồn tuyệt đối (2) 30 phút Paraffin (2) 3 giờ Paraffin (1) 3 giờ Hình 3.1. Sơ đồ xử lý mẫu
Mô học truyền thống: Dùng lame thường vớt lát cắt. Đặt lame chứa mẫu vào tủ ấm ở nhiệt độ 40 - 60oC trong vòng 4 – 6giờ thì tiến hành nhuộm mẫu.
Phương pháp lai in situ: Dùng lame dương v ớt lát cắt.
Quy trình nhuộm mô học truyền thống
Nhuộm mẫu bằng máy nhuộm tự động Routine Stainer (Merck, Đức) theo phương pháp của Sheehan và Hrapchak, 1980. Dùng thuốc nhuộm là Hematoxylin và Eosin. Mẫu được nhuộm theoSơ đồ 3.2.
Hình 3.2. Sơ đồ nhuộm mẫu tự động
- Đọc mẫu.
Sau đó nhỏ một giọt Baume canada lên rồi đặt lamelle lên tránh hiện tượng có bọt khí bên trong.
Quan sát dưới kính hiển vi quang học với các độ phóng đại 4X, 10X, 40 X.
- Kết quả: Quan sát thấy sự hoại tử và những thương tổn trong cơ, hình thành
những ổ viêm ở trong cơ. Sự xuất hiện của thể vùi trong tế bào gan tụy và trên các lá mang. Xy len (1) 5 phút Cồn 70% 2 phút Esoin
2-3 phút Nước cất2-3 phút Hematoxylie2-3phút Nước cất 5-10 phút Cồn 70% 5 phút Cồn 80% 5 phút Cồn 95% 5 phút Cồn99.5% 5 phút Xy len (2) 5 phút Xylen (3) 5 phút Xylen (2) 5 phút Xylen (1) 5 phút Cồn99.5% 2phút Cồn 95% 2 phút Cồn 80% 2 phút
Quy trình lai In Situ Hybridization (Hsieh, 2006)
Bước 1:
Cố định mẫu bằng cách đặt lam chứa mẫu v ào tủ ấm ở nhiệt độ 60oC cho đến khi mẫu khô hết nước và bám chặt trên lame khoảng 45 phút.
Bước 2:
Khử paraffin: Nhúng lame lần lược qua các giai đoạn của dung dịch sau:
Xylen 2 lần 5 phút/lần
Ethanol 99,5% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần Ethanol 80% 1 lần 1 phút/lần Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần Rửa qua nước cất (6 rinses)
Rửa qua PBS 1X 1 lần 5 phút/lần
Bước 3:
Xử lý với Proteinase k: Dùng micropipette hút 1ml dung d ịch proteinase K (100µg/ml trong đệm PBS 1X có HCL 0,2N) lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 20 phút ở 37oC trong tủ ẩm.
Bước 4:
Xử lý vởi formaldehyde: Rửa mẫu với 0,4% formaldehyde (trong đệm PBS) trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa qua 2 lần với dung dịch SSC 2X ở nhiệt độ ph òng.
Bước 5:
Tiền lai: Ủ mẫu với dung dịch tiền lai (không có mẫu d ò), dùng micropipette hút 75µl dung dịch lai lên mỗi mặt mẫu.
Ủ mẫu 60 phút ở 37oC trong tủ ẩm.
Bước 6:
Lai: Ủ mẫu với dung dịch lai (có mẫu dò). Dùng micropipette hút 0, 75µl dung dịch lai lên mặt mẫu. Sau đó làm biến tính DNA bằng phương pháp sốc nhiệt (làm nóng 10 phút ở 90oC, làm lạnh 3 phút).
Ủ mẫu qua đêm ở 37oC trong tủ ẩm.
Bước 7:
Rửa: Rửa mẫu lần lượt qua các dung dịch sau: Rửa 2 lần qua dung dịch SSC 2X, 5phút/lần ở 20oC. Rửa qua dung dịch SSC 1X trong 10 phút ở 42oC.
Rửa qua dung dịch đệm acid maleic trong 15 phút ở 20oC.
Bước 8:
Bocking: Dùng micropipette hút 0,5ml dung dịch đệm II lên mặt lame. Ủ trong 15 phút ở 37oC trong tủ ẩm.
Bước 9:
Ủ với kháng thể của DIG (kháng thể có gắn với enzyme alkaline phos phatase) pha với đệm II tỷ lệ 1:500. Hút 200 – 500µl lên mỗi lame.
Ủ trong 30 – 45 phút ở 37oC trong tủ ẩm.
Bước 10:
Rửa kháng thể: Rửa 3 lần với đệm acid maleic ở nhiệt độ ph òng, 5 phút/lần.
Bước 11:
Làm hiển thị bằng dung dịch phát triển m àu: Hỗn hợp gồm Buffer III w/PVA và Levamisole với NBT và BCIP.
Hút 0,5ml dung dịch phát triển màu lên mỗi lame.
Ủ 2 – 3giờ trong tối (Lighter) hoặc ủ qua đ êm (Hsieh) ở nhiệt độ phòng, mẫu đặt trong tủ ẩm.
Rửa mẫu qua nước cất trong 1 phút.
Bước 12:
Nhuộm đối kháng: Nhuộm tạo nền t ương phản bằng cách hút 0,5ml methyl green 0,5% lên mỗi lam và giữ trong 1 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa cấn thận qua nước cất nhiều lần
Bước 13:
Để mẫu quan sát đẹp và rõ ràng, khử nước bằng cách rửa các tiêu bản lần lượt qua các dung dịch sau:
Ethanol 70% 3 lần 1 phút/lần. Ethanol 80% 3 lần 1 phút/lần. Ethanol 95% 3 lần 1 phút/lần. Ethanol 99,5% 3 lần 1 phút/lần Xylen 4 lần 1 phút/lần Bước 14:
Dán lamelle: Tránh cho mẫu bị khô trong khi dán lamelle ta để mẫu trong lần rửa cuối rồi lấy lần lượt lam ra dán. Nhỏ một giọt keo Baume Canada ngay tr ên tiêu bản mẫu, đặt lamelle lên lam kính cẩn thận không để có bọt khí bên trong.
Đọc kết quả: Cách đọc tiêu bản xác định thể ẩn và ghi nhận kết quả như sau:
Xem kết quả ở dưới kính hiển vi quang học ở các vật kính 4X, 10x, 40x, 100x. Tế bào nhiễm MrNV có thể vùi bắt màu đen. Vùng cơ bị nhiễm MrNV thì thấy vùng bắt màu đen. Còn vùng không bị nhiễm thì bắt màu xanh của thuốc nhuộm đối kháng.
Sau khi đọc kết quả các lame chứa lame chứa mẫu v à các thông số đều được lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh số mẫu cẩn thận để tránh nhầm lẫn.
3.2.3.6. Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên.
So sánh phương pháp ISH về độ nhạy, tính đặc hiệu với phương mô học truyền thống và kỹ thuật RT-PCR qua bố trí thử nghiệm khả năng phát hiện mầm bệnh MrNV trên cùng 10 mẫu tôm poslavae có biểu hiện dấu hiệu lâm sàng đặc trưng của bệnh đục thân. Mỗi mẫu được chia làm hai phần, một phần cố định trong cồn dùng cho kỹ thuật RT-PCR, một phần cố định trong dung dịch Davidson cho phương pháp mô học truyền thống và phương pháp ISH (sau khi cố định trong paraffin, mỗi mẫu được cắt và thực hiện trên 2 lame, một cho phương pháp mô học truyền thống và một cho phương pháp ISH).
Kết quả được ghi nhận dựa trên cường độ nhiễm, khả năng phát hiện của mẫu sau khi xét nghiệm.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả ứng dụng kỹ thuật ISH phát hiện tác nhân gây bệnh đục thân
Tiến hành khảo sát cấu trúc tế bào tôm càng xanh bị bệnh đục thân và tôm không có dấu hiệu bị bệnh để phát hiện ra virus gây bệnh đục thân v à biểu hiện mô học. Khảo sát 12 mẫu tôm thương phẩm và tôm postlarvae (giai đoạn 18 ngày tuổi đến 40 ngày tuổi) thu tại An Giang và Đồng Tháp và 8 mẫu tôm postlarvae cảm nhiễm có biểu hiện của bệnh đục thân (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Bảng dấu hiệu lâm sàng của các mẫu Loại tôm STT Kí hiệu
mẫu Nơi thu Dấu hiệu lâm sàng
1. A2 An Giang
2. A4 An Giang
Cơ thể yếu, lờ đờ, biếng ăn, nổi lên nhiều vào buổi sáng, cơ thể
có màu trắng đục 3. 421 An Giang 4. 422 An Giang 5. 423 An Giang 6. 424 An Giang 7. 425 An Giang Tôm lớn 8. 426 An Giang
Cơ thể yếu, bơi gần bờ, biếng ăn,
dấu hiệu trắng đục toàn bộ ở phân đuôi, cơ bụng và lan đến
phần đầu.
9. A5-1 An Giang
10. A5-2 An Giang
Cơ thể yếu, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, cơ
bụng và lan đếnphần đầu
11. A8 Đồng Tháp
12. A9 Đồng Tháp Cơ thể khỏe mạnh, không códấu hiệu bị bệnh đục thân.
13. C 4 Đồng Tháp 14. C 5 Đồng Tháp 15. C 6 Đồng Tháp 16. C 7 Đồng Tháp 17. C 8 Đồng Tháp 18. C 9 Đồng Tháp 19. C 10 Đồng Tháp Tôm post 20. C 11 Đồng Tháp
Cơ thể yếu, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, cơ
bụng và lan đến phần đầu.
Quan sát các mẫu thu được, ghi nhận tôm càng xanh hay ấu trùng và tôm postlarvae bị bệnh đục thân thường xuất hiện các dấu hiệu như cơ thể mờ đục, xuất hiện những mảng trắng đục ở phần cơ đuôi sau đó lan dần đến phần cơ bụng và
phần đầu. Những mảng trắng này sẽ lan rộng ra toàn bộ phía đuôi và phần đầu. Khi tôm bị nhiễm nặng thì toàn bộ cơ thể bị trắng đục. Ban đầu tôm chết rải rác nh ưng tỷ lệ chết tích lũy cũng rất cao (Hình 4.1).
Kết quả phân tích mô học trên cơ của tôm càng xanh
Kết quả phân tích mô học mẫu tôm c àng xanh thu tại An Giang và Đồng Tháp được ghi nhận trong bảng 4.2.
Kết quả phân tích mô học của cơ tôm trưởng thành và ấu trùng tôm cho thấy có sự hoại tử cơ, những thương tổn trong các khối cơ như ở khối cơ dọc sự hoại tử cơ và tiêu hủy cơ tạo ra những khoảng trống trong c ơ (Hình 4.2 B).Trong 20 mẫu phân tích thì có 9/20 mẫu (45%) có biểu hiện hoại tử, xuất hiện những ổ vi êm trong cơ và biểu hiện bất thường của các khối cơ. Trong khi đó ở tôm càng xanh không co dấu hiệu bị bệnh đục thân thì các khối cơ phân bố đều đặn, giữa các khối cơ dọc, cơ ngang và sự phân bố đều đặn giữa các sợi cơ vân (Hình 4.2 A). Điều này cũng được Arcier và cộng sự (1999), Vijayan và cộng sự (2005) mô tả khi nghiên cứu mô cơ bị bệnh đục thân trên tôm càng xanh.
Hình 4.1. Hình Post- larvae của tôm càng xanh với dấu hiệu: xuất hiện những mảng trắng đục ở phần đuôi, phần bụng và phần đầu
Bảng 4.2: Kết quả phân tích mô học truyền thống (H&E) các mô ở tôm càng xanh
Kết quả phân tích mô học STT Thể vùi trong gan
tụy Thể vùi trên mang Hoại tử cơ
1. _ _ _ 2. _ _ + 3. _ _ + 4. _ _ + 5. _ _ + 6. _ _ + 7. _ _ + 8. _ _ + 9. + + + 10. + + + 11. _ _ _ 12. _ _ _ 13. _ _ _ 14. _ _ + 15. + _ _ 16. _ _ + 17. + _ _ 18. + _ _ 19. + + _ 20. + _ _ Tổng cộng ∑mẫu(+)/∑mẫu kiểm tra 7/20 Tỷ lệ 35% 3/20 Tỷ lệ 15% 9/20 Tỷ lệ 45%
A B Hình 4.2: Tổ chức mô cơ ở tôm càng xanh
A. Cấu trúc bình thường của mô cơ, (H&E)(100X) B. Sự hoại tử mô cơ (H&E) (100X)
MI- cơ cắt ngang, MII- cơ cắt dọc, MN – sự hoại tử cơ
Kết quả phân tích mô học trên gan tụy
Quan sát tế bào gan tụy, ghi nhận có sự xuất hiện của các thể vùi với nhiều hình dạng khác nhau trong tế bào chất ở trong tổ chức gan tụy của ấu tr ùng tôm bị bệnh (Hình 4.3). Với các tế bào bị nhiễm thể vùi trong nhân tế bào khối gan tụy trương lên chiếm hết cả tế bào không nhìn thấy nhân con bắt màu hồng của thuốc nhuộm (INOs). Đối với tế bào gan tụy bình thường, các tế bào sắp xếp kề nhau giữa chúng có một lớp tế bào liên kết, khoảng trống bên trong khối gan tụy bình thường. Với tế bào bình thường thì tế bào bắt màu nâu và nhìn thấy rõ nhân bên trong tế bào (E). Hsieh và cộng sự (2006) khi nghiên cứu về tác nhân gây bệnh đục thân trên ấu trùng tôm càng xanh ở Thái Lan cùng nhận xét khi tế bào tôm bị bệnh cũng xuất hiện thể vùi trong khối gan tụy. Kết quả kiểm tra 20 mẫu thì 7/20 mẫu (35%) có sự