2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.4.2.2.Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP
Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm các bước sau:
- Bước 1: Tách chiết DNA và tinh sạch DNA.
- Bước 2: Cắt mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn RE.
- Bước 3: Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot.
Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng RFLP cần phải thực hiện một phản ứng trung gian là Southern blot (Hình 2.2). Do đó kỹ thuật này rất tốn kém và phức tạp.
Hình 2.2: Mô tả phản ứng RFLP
(Nguồn: http://www.agronomy.ucdavis.edu)
2.4.3. Sơ lƣợc về kỹ thuật RFLP – PCR
Do sự phức tạp, tốn kém và khó khăn khi phải thực hiện Southern blot nên khi nghiên cứu bộ gene người ta thường thực hiện phản ứng RFLP dựa trên PCR. Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một đoạn DNA bằng PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme thích hợp. Dựa vào kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt để đánh giá sự đa hình của DNA. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này không phải thiết kế probe. Đồng thời phương pháp này tạo ra ít band hơn phương pháp RFLP nguyên thủy, tạo điều kiện dễ dàng hơn trong phân tích kết quả.
Quy trình thực hiện:
- Tách chiết DNA.
- Thực hiện PCR khuếch đại trình tự đích bằng một cặp primer thích hợp. - Xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.
- Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả.
Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả.
2.5. Giới thiệu về vùng ITS
Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3). Các trình tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra ribosome có chức năng tổng hợp protein. Trong các vùng này thì vùng rDNA là vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS.
Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm
(Nguồn: http://plantbio.berkeley.edu/~bruns/) Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000):
- Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch đại bằng phản ứng PCR.
- Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA.
- PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng. Các nhà nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài, từ đó giúp xác định loài nhanh chóng.
Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996). Năm
1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum.
Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP, DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997). Đối với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có quan hệ di truyền gần gũi nhau. Ngoài việc sử dụng vùng ITS để phân tích cây phát sinh loài, nó còn được sử dụng với mục đích phát hiện và định danh vi sinh vật (Vandepeer và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng vùng ITS để xác định sự biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). Nazar và cộng sự (1991) đã sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát hiện và định danh nấm
Verticillium albo-atrum và V. dabliae. Trong một nghiên cứu tương tự trên dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov và cộng sự (1993) đã định danh được chúng thuộc loài Verticillium. Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao. Với việc phát triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác. Năm 1996, Boysen và cộng sự đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân tích đặc tính bệnh và xác định được 3 nhóm phụ.
Với các ưu điểm như vậy, vùng ITS càng ngày càng được nghiên cứu rộng rãi và phổ biến hơn. Nó là vùng đạt được kết quả nhiều nhất trong nghiên cứu sinh học phân tử của nấm.
2.6. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei trong nƣớc và ngoài nƣớc
Đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola. Tuy nhiên, do là loại nấm mới bùng phát nên đa số các nghiên cứu đều là nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh, khả năng sinh độc tố cassiicoline và sự phân bố của chúng trên nhiều lãnh thổ khác nhau. Những nghiên cứu này đã làm thay đổi cách đánh giá về khả năng gây bệnh của loài nấm này. Kết quả của những nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rất
rộng, đồng thời khả năng sinh độc tố cũng thay đổi rất lớn tùy thuộc vào các dòng vô tính cao su được ghi nhận (Jayashinge và cộng sự, 1998).
Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C. cassiicola là chưa nhiều. Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su. Vũ Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III, Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C. cassiicola
(RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này. Đa số các nghiên cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây bệnh… của chúng. Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng. Ngoài khả năng sinh độc tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose (C.K. Jayashinge, 2000).
Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C. cassiicola khác nhau và đã phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền.
Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm. Năm 2003, Safiah Atan và Noor Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. Kết quả là đã xếp chúng vào 2 chủng khi nghiên cứu bằng RAPD. Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu.
Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP trên vùng ITS của 32 dòng nấm. Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm này thành 7 nhóm di truyền.
PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu 3.1.1. Thời gian nghiên cứu
Tiến hành từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam – Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương.
- Nhân sinh khối nấm C. cassiicola tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
- Tiến hành ly trích DNA, chạy PCR, RFLP tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá Corynespora.
3.2. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola.
2. Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS.
3. Phân tích đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola bằng kỹ thuật RFLP – PCR..
3.3. Vật liệu và phƣơng pháp
3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, giấy thấm, bông gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, máy lắc, bút lông…
Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar. Thuốc nhuộm Methylene Blue.
Nước cất.
Cách pha môi trƣờng PGA:
Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút.
Lọc lấy nước trong.
Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc.
Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu.
Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút.
3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm
Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynesporatheo các bước sau:
- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần. - Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70o rồi cấy vào môi đĩa môi trường PGA.
- Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới. - Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola.
Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử.
3.3.1.4. Phƣơng pháp tách đơn bào tử
Sau khi phân lập được dòng nấm C. cassiicola thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau:
- Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm. - Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng.
- Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar. - Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ.
- Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA.
- Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc.
3.3.1.5. Phƣơng pháp nhân sinh khối
- Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA (Mục 3.3.1.1) nhưng không bỏ agar.
- Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường PGA lỏng. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở 26 – 30oC).
- ... Sa u 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên giấy lọc tiệt trùng. Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở -20oC.
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA của nấm 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm - Nitơ lỏng. - Phenol. - Chloroform. - Isoamyl alcohol. - Isopropanol. - Ethanol 100%, 70% - TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
- Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% - mecaptoethanol.
- Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex…
3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990).
Quy trình cụ thể
- Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. - Chuyển bột nghiền vào eppendorf.
- Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer.
- Ủ ở 65oC trong 1giờ.
- Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt.
- Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28o
C. - Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 28o
C. - Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70o
rửa sạch nhiều lần. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4oC hay -20oC.
3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di
Sau khi thu DNA của sợi nấm, tiến hành chạy điện di kiểm tra DNA tổng số với mục đích định tính DNA nấm. Chạy kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích
Sản phẩm DNA tổng số được ly trích có nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy… sẽ được tinh sạch trước khi đem chạy PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện theo quy trình sau:
- Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 2 l enzyme RNase. Đem ủ ở 37o
C trong 30 phút.
- Bước 3: Sau khi ủ, hút 2 l hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol
(25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ.
- Bước 4: Đem ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 5 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác.
- Bước 5: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 400 l ethanol 100% và ủ ở -70o
C, trong 20 phút.
- Bước 6: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 1 phút.
- Bước 7: Loại bỏ dịch nổi. Tiến hành làm khô mẫu và cho TE 1X vào.
3.3.3. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2 primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Dụng cụ thí nghiệm:
Eppendorf các loại.
Micropippette và đầu típ các loại. Lò vi sóng.
Cân kỹ thuật 4 số.
Máy luân nhiệt (thực hiện phản ứng PCR).
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR
Bảng 3.1: Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối
dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM
10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X
MgCl2 1 25 mM 1 mM
ITS A 1 25 pM/ l 25pM
ITS B 1 25 pM/ l 25pM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khuôn mẫu 1
Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: thực hiện trong 41 chu kỳ.
- Chu kỳ 1:
Biến tính: 94 C 3phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 39 chu kỳ tiếp theo:
Biến tính: 94 C 1 phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 1 chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 9 phút.
3.3.3.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
Hóa chất cho kỹ thuật điện di
DNA ladder loại 1000bp (Biorad). Ethidium bromide 1%.
Dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris HCl, 10 mM glacial acetate, EDTE 1 mM).
- Loading buffer 6X, gel agarose.
Dụng cụ và thiết bị điện di
Micropippette và các đầu típ.
Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad). UV transilluminator (Biorad).
Cách thực hiện đổ gel và chạy điện di.
- Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X.
- Đun sôi khoảng 1 – 2 phút.
- Để nguội đến 40 – 50oC.
- Đổ gel vào bể điện di và đặt lược tạo giếng diện di.