3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle, kính hiển vi quang học, giấy thấm, bông gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ, tủ sấy, máy lắc, bút lông…
Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar. Thuốc nhuộm Methylene Blue.
Nước cất.
Cách pha môi trƣờng PGA:
Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2 lần đun sôi trong 30 phút.
Lọc lấy nước trong.
Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc.
Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose. Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu.
Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử trùng ở 121 C/ 15 phút.
3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…)
3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm
Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của bệnh rụng lá Corynesporatheo các bước sau:
- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần. - Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70o rồi cấy vào môi đĩa môi trường PGA.
- Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới. - Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng. Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola.
Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử.
3.3.1.4. Phƣơng pháp tách đơn bào tử
Sau khi phân lập được dòng nấm C. cassiicola thuần chủng, ta tiến hành tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau:
- Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm. - Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng.
- Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar. - Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ.
- Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng rẽ và mọc tách riêng rẽ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào đĩa petri chứa môi trường PSA.
- Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc.
3.3.1.5. Phƣơng pháp nhân sinh khối
- Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA (Mục 3.3.1.1) nhưng không bỏ agar.
- Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường PGA lỏng. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở 26 – 30oC).
- ... Sa u 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên giấy lọc tiệt trùng. Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở -20oC.
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA của nấm 3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm - Nitơ lỏng. - Phenol. - Chloroform. - Isoamyl alcohol. - Isopropanol. - Ethanol 100%, 70% - TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
- Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% - mecaptoethanol.
- Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf, micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex…
3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990).
Quy trình cụ thể
- Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng. - Chuyển bột nghiền vào eppendorf.
- Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis buffer.
- Ủ ở 65oC trong 1giờ.
- Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt.
- Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28o
C. - Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ. - Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 28o
C. - Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70o
rửa sạch nhiều lần.
- Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4oC hay -20oC.
3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di
Sau khi thu DNA của sợi nấm, tiến hành chạy điện di kiểm tra DNA tổng số với mục đích định tính DNA nấm. Chạy kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích
Sản phẩm DNA tổng số được ly trích có nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy… sẽ được tinh sạch trước khi đem chạy PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện theo quy trình sau:
- Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 2 l enzyme RNase. Đem ủ ở 37o
C trong 30 phút.
- Bước 3: Sau khi ủ, hút 2 l hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol
(25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ.
- Bước 4: Đem ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 5 phút. Tiến hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác.
- Bước 5: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 400 l ethanol 100% và ủ ở -70o
C, trong 20 phút.
- Bước 6: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 1 phút.
- Bước 7: Loại bỏ dịch nổi. Tiến hành làm khô mẫu và cho TE 1X vào.
3.3.3. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei bằng kỹ thuật PCR
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2 primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC Dụng cụ thí nghiệm:
Eppendorf các loại. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Micropippette và đầu típ các loại. Lò vi sóng.
Cân kỹ thuật 4 số.
Máy luân nhiệt (thực hiện phản ứng PCR).
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR
Bảng 3.1: Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối
dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM
10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X
MgCl2 1 25 mM 1 mM
ITS A 1 25 pM/ l 25pM
ITS B 1 25 pM/ l 25pM
Khuôn mẫu 1
Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l
Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: thực hiện trong 41 chu kỳ.
- Chu kỳ 1:
Biến tính: 94 C 3phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 39 chu kỳ tiếp theo:
Biến tính: 94 C 1 phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 1 chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 9 phút.
3.3.3.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
Hóa chất cho kỹ thuật điện di
DNA ladder loại 1000bp (Biorad). Ethidium bromide 1%.
Dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris HCl, 10 mM glacial acetate, EDTE 1 mM).
- Loading buffer 6X, gel agarose.
Dụng cụ và thiết bị điện di
Micropippette và các đầu típ.
Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad). UV transilluminator (Biorad).
Cách thực hiện đổ gel và chạy điện di.
- Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X.
- Đun sôi khoảng 1 – 2 phút. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Để nguội đến 40 – 50oC.
- Đổ gel vào bể điện di và đặt lược tạo giếng diện di.
- Chờ gel đông lại. Cho vào bể điện di và đổ dung dịch TAE vào.
- Lấy 4 l sản phẩm PCR trộn với 2 l loading dye cho vào giếng và tiến hành chạy điện di.
- Phân tích sản phẩm PCR bằng máy chụp gel.
3.3.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
3.3.4.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I, Nde II, Sau 3A I, EcoR I, Cfo I, Rsa I.
- Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola.
- Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad). - Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml.
3.3.4.2. Thực hiện phân tích RFLP
Bảng 3.2: Thành phần một phản ứng enzyme cắt
Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme Buffer enzyme Sản phẩm PCR Nước 0,1 2,5 3 vừa đủ phản ứng 25 l 10 U/ l 10 X 1U 1X
Các bước để thực hiện một phản ứng enzyme cắt:
- Hút 3 l dung dịch sản phẩm PCR cho vào một eppendorf.
- Sau đó cho 0,1 l dung dịch enzyme cắt vào.
- Làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 65oC trong thời gian 15 phút.
Sau đó, sản phẩm cắt sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% - 1,5%, phân tích sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số dòng vô tính cao su dòng vô tính cao su
4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora
Tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora là nấm Corynespora cassiicola. Đây là loại nấm có phổ ký chủ rộng, có khả năng thích nghi rất lớn với mọi thời tiết. Do vậy, bệnh này xuất hiện quanh năm trong mọi thời tiết và ở mọi khí hậu từ cận xích đạo, xích đạo và cả ôn đới. Đặc biệt trong mùa mưa, nước mưa sẽ làm bào tử của chúng phát tán ra môi trường. Do có khả năng thích nghi như vậy, nấm
Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Chúng gây bệnh trên
rất nhiều dòng vô tính cây cao su. Nấm này gây hại trên cây cao su ở tất cả các giai đoạn từ cây trong vườn ươm, vườn kiến thiết hay vườn cây khai thác.
Ở Việt Nam, bệnh này mới được phát hiện trên cây cao su vào năm 1999. Và bước đầu đã được ngăn chặn bằng cách chặt bỏ các dòng vô tính bị nhiễm. Đồng thời khuyến cáo không trồng các dòng vô tính cao su có tính mẫn cảm cao. Theo đánh giá của các nhà nghiên cứu thì ở Việt Nam bệnh này đang trong giai đoạn ủ bệnh và tích lũy bệnh, do đó trong tương lai có thể bùng phát thành dịch bệnh nếu không có những biện pháp quản lý và kiểm soát bệnh (Phan Thành Dũng – Báo cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, hiện trạng và thách thức mới, 2006).
Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới xuất hiện, quy mô gây hại tiềm ẩn rất lớn. Chúng ta phải thường xuyên kiểm tra ở tất cả các vườn cao su từ vườn ươm
đến vườn cây khai thác. Hiện nay, theo số liệu thống kê do Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật – Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam thì hầu hết các vườn tuyển non và vườn sơ tuyển tại Lai Khê đều bị nấm này tấn công trên quy mô lớn (Bảng 4.1).
Bảng 4.1: Tình hình nhiễm bệnh tại một số vƣờn trên địa bàn Lai Khê – BD (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Tên vƣờn Ngày quan trắc Số dòng vô tính quan trắc Số dòng có triệu trứng bệnh Phần trăm dòng vô tính bị bệnh (%) Vƣờn tuyển non năm 2001
Vƣờn tuyển non năm 2002 Vƣờn sơ tuyển năm 2003 Vƣờn sơ tuyển năm 2004
29/05/2006 29/05/2006 17/04/2006 18/04/2006 1131 1808 72 74 1005 1720 44 47 88,9 95,1 61,1 63,5
Theo Bảng 4.1, tỷ lệ dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh là rất lớn. Tại các vườn tuyển non, tỷ lệ nhiễm bệnh cao có thể lý giải là do số lượng dòng vô tính rất lớn và khỏang cách giữa các cây là rất gần nhau. Do đó bệnh dễ dàng lây lan giữa các dòng với nhau. Còn các vườn sơ tuyển, đây là vườn lưu trữ các giống có tiềm năng đã qua chọn lọc nên tỷ lệ nhiễm bệnh có thấp hơn vườn tuyển non. Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh này là rất cao, cần có các biện pháp hợp lý để hạn chế sự phát triển của bệnh này.
Theo thống kê chưa đầy đủ, tại các công ty cao su trực thuộc Tổng công ty cao su Việt Nam bệnh rụng lá Corynespora cũng đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn trên cây cao su con.
Trong quá trình tiến hành làm thí nghiệm, tôi đã tiến hành thu thập mẫu nấm từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh của nhiều dòng vô tính cao su khác nhau tại Vườn tuyển non Lai Khê - Viện nghiên cứu cây cao su Việt Nam (Hình 4.1). Để đơn giản
và thuận tiện cho công việc tôi đã tiến hành mã hóa tên các dòng nấm thu được từ các dòng vô tính khác nhau thành các số thứ tự (xem Phụ lục 1.).
Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora A: Lá mới bị bệnh C: Triệu trứng trên thân cây non
B: Lá bị bệnh nặng D: Tán cây bị bệnh rụng lá Corynespora
A
B
C D
4.1.2. Kết quả phân lập
Sau khi thu được các mẫu bệnh từ các dòng vô tính khác nhau, tôi đã tiến hành phân lập nấm trên môi trường PGA.
Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo (3 ngày sau khi cấy)
Triệu chứng nấm này gây ra trên cao su biến thiên rất lớn. Từ dạng hình xương cá ở gân lá (triệu chứng đặc trưng), đến hình tròn ở trên phiến lá (triệu chứng không đặc trưng). Từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh chúng tôi đã tiến hành phân lập bằng phương pháp cấy chuyền nhiều lần. Sau đó chọn những khuẩn lạc đặc trưng như màu xám nâu, hình dạng khuẩn lạc là tập hợp của nhiều vòng tròn đồng tâm… Sau khi tiến hành phân lập chúng tôi đã thu được tổng cộng 65 dòng nấm trên 65 dòng vô tính cao su khác nhau.
Hình 4.3: Bào tử nấm C. cassiicola
A: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng tự nhiên. B: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo.
(Nguồn: Phan Thành Dũng, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN)
4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử
Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tôi đã tiến hành tách đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử của nấm Corynespora cassiicola có kích thước lớn nên có thể quan sát và tiến hành tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học.
Bảng 4.2: Các dòng nấm đƣợc tách đơn bào tử STT
đƣợc mã hóa
Kí hiệu
của dòng vô tính cao su
Tên dòng vô tính cao su 1 RRIV2 LH82/122 3 26/20 LH9/0023 6 29/93 LH99/0053 7A 4/48 LH99/0081 7B 4/48 LH99/0081 11 28/37 LH99/0093 12 19/38 LH99/0098 14 4/84 LH99/0131 19 32/86 LH99/0337 23 1/24 LH99/0374 28 2/55 LH99/0412 30 30/88 LH99/0431 35 21/55 LH99/0617 42 7/70 LH99/0679 52 19/82S LH99/0050 53 29/93S LH99/0053 54 28/81S LH99/0112 55 22/25S LH99/0216 59 7/8S LH99/0636 60 22/70S LH99/0675 62 10/11S LH99/0757 63 10/34S LH99/0778 64 16/28S LH99/0672 65 RRIV4
Nấm Corynespora cassiicola là một loại nấm rất khó phát sinh bào tử trên môi trường nhân tạo (có thể do môi trường nuôi cấy chưa thích hợp hoặc do chế độ ánh sáng không thích hợp). Do đó, để có bào tử chúng tôi đã tiến hành kích thích cho nấm này phát sinh bào tử bằng cách:
- Tạo vết thương trên bề mặt khuẩn lạc bằng kim lưỡi mác hoặc lame vô trùng.
- Sau đó tiến hành ủ khuẩn lạc trong tối 3 ngày.
- Rồi đem khuẩn lạc chiếu sáng 3 ngày liên tiếp, khuẩn lạc sẽ phát sinh bào tử. Bào tử nấm Corynespora cassiicola có màu nâu nhạt, hình bầu dục, nhiều vách ngăn, chiều dài biến thiên (có thể dài tới 700 m) (Phan Thành Dũng, 2004; Nguyễn Thị Huệ, 1997). Chúng tôi đã tiến hành tách đơn bào theo quy trình ở Mục (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});