ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG GỪNG (Zingiber spp.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA BARCODE

HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 ĐÁNH GIÁ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ GIỐNG GỪNG (Zingiber spp.) Ở VIỆT NAM DỰA TRÊN CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA BARCODE Nguyễn Trường Giang, Mai Thị Kim Ngọc, Phan Quang Hương, Huỳnh Hữu Đức* Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh TĨM TẮT Hiện nay, nghiên cứu phân loại loài gừng Việt Nam chủ yếu dựa vào thị hình thái Các phương pháp dựa hình thái cần phải có đầy đủ thơng tin liệu cấu tạo cấu trúc hoa mà nhiều trường hợp khó khăn hạn chế Phương pháp khó áp dụng lồi chi Gừng chúng có nhiều đặc điểm hình thái giống khó hoa nên khó khăn cho việc phân loại Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá mẫu gừng kết hợp với mẫu nghệ làm nhóm ngồi để đánh giá mối quan hệ di truyền thị phân tử DNA barcode dựa vùng matK, rbcL cDNA ITS nhân Kết cho thấy tỷ lệ khuếch đại vùng matK, rbcL, ITS với cặp mồi tương ứng matK390-F matK1326-R, rbcLa-F rbcLa-R, ITS1F ITS 1R, ITS-1F ITS-1R lần lược 100%, 87,5%, 87,5%, 87,6% Mức độ tường đồng di truyền loài chi gừng với trình tự tham khảo từ 97 - 100% mức độ bao phủ từ 99 – 100% Dựa phát sinh loài cho thấy gừng nghệ thuộc hai nhóm khác nhau, gừng chia làm lồi Zingiber zerumbet Zingiber officinale Trên sở chúng tơi đánh giá mối quan hệ mẫu gừng mẫu nghệ Các kết ứng dụng việc đánh giá mối quan hệ di truyền, nhận diện lồi thuộc họ Zingiberaceae, từ mở khả việc xác định sản phẩm dược liệu có nguồn gốc từ gừng Từ khóa: DNA barcode, Zingiber, thị phân tử MỞ ĐẦU Gừng loại thảo dược biết từ lâu với nhiều công dụng làm thuốc chữa trị bệnh làm gia vị ăn Thân ngầm (thân rễ) sử dụng dạng tươi, dạng bột, sấy khô, dạng dầu hay nước ép Gừng chi họ Zingiberaceae, họ với bạch đậu khấu, nghệ riềng Gừng sử dụng rộng rãi toàn giới để điều trị chứng bệnh chán ăn, buồn nôn nôn sau phẫu thuật, nhiễm trùng đường hô hấp trên, viêm phế quản, ho, viêm khớp đau Ở số nơi giới, nước gừng bôi cho lên da để điều trị bỏng Gừng sử dụng hương liệu công nghiệp thực phẩm đồ uống, làm gia vị hương liệu nấu ăn, hương thơm xà phòng mỹ phẩm Gừng sử dụng từ lâu khu vực Nam Á, dạng tươi khô (Ali et al., 2008; Shakya, 2015) Họ Gừng Việt Nam đa dạng, biết khoảng 140 loài thuộc 20 chi gần 100 loài, tương đương với đa dạng họ Gừng Thái Lan, cao so với họ Gừng Lào Campuchia Trong nhiều có giá trị riềng (Alpinia officinarum), Nghệ (Curcuma domestica Val hay Curcuma longa L.), gừng (Zingiber officinale Rosc), gừng gió (Zingiber zerumbet) (Phạm Hồng Hộ, 1993) Đến nay, nghiên cứu phân loại loài gừng Việt Nam chủ yếu dựa vào thị hình thái Phương pháp nhiều trường hợp gặp nhiều khó khăn hạn chế, đặc biệt lồi chi Gừng có nhiều đặc điểm hình thái giống nên khó khăn cho việc phân loại Trên giới, ngồi việc sử dụng thị hình thái, nhà nghiên cứu sử dụng thị phân tử RFLP, RAPD, ALFP, SSR, ISSR, SCAR để phân loại, giám định số loài gừng Như vậy, việc kết hợp thị hình thái thị phân tử DNA làm tăng độ xác nhanh chóng xác định khác biệt sinh vật DNA barcode phương pháp để xác định nhanh chóng lồi dựa trình tự DNA tách chiết từ mẫu mô nhỏ sinh vật Như công cụ nghiên cứu cho nhà phân loại, DNA barcode hỗ trợ việc xác định loài việc mở rộng khả xác định lồi qua giai đoạn lịch sử sống sinh vật DNA barcode sử dụng để giải câu hỏi sinh thái tiến hóa từ động vật nấm nguyên sinh vật, tảo thực vật Các kết nghiên cứu gần đây, cho thấy thị phân tử DNA barcode thực vật lựa chọn vùng rbcL matK cộng với hai khu vực bổ sung trnH - psbA vùng ITS cho thấy mức độ phù hợp cho phân biệt loài thực vật (Paula, 2013; Jalil et al., 2015; Kress et al., 2015) Các nhà khoa học xác định nhiều đoạn DNA đặc hiệu sử dụng làm DNA barcode Mỗi đoạn DNA barcode có đặc trưng riêng có khả phân biệt sinh vật mức độ loài loài Việc lựa chọn đoạn DNA đặc trưng để làm thị phân tử DNA barcode phụ thuộc vào nhóm sinh vật cụ thể mục đích nghiên cứu (Kress, Erickson, 2008) Hiện nay, số sản phẩm dược liệu làm từ nguồn dược liệu trồng thương mại, sản phẩm trộn từ nhiều nguồn dược liệu khác Điều ảnh hưởng đến việc kiểm tra chất lượng sản phẩm HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 có nguồn gốc từ dược liệu Trên số đối tượng sâm Hàn Quốc Sâm Mỹ có đặc điểm hình thái tương tự hiệu dược liệu khác Việc xác định hai loài sản phẩm dược liệu khó khăn chúng dạng chế biến Hồng Sâm, bột nhân sâm, lát cắt nhỏ, viên nén, dạng lỏng Do việc xác định, truy xuất nguồn vật liệu thương phẩm cần thiết Có thể sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp, sắc ký khí, quang phổ, để xác định Tuy nhiên, gặp số hạn chế chuyển hóa hợp chất thứ cấp sâm bị ảnh hưởng yếu tố khác điều kiện sinh trưởng, trình sản xuất, đồng thời chi phí phân tích cao Phương pháp dựa thị phân tử có nhiều ưu việc xác định, cần lượng mẫu nhỏ hiệu thời gian, chi phí Phương pháp áp dụng cho loại mơ thực sản phẩm qua chế biến với kết ổn định, nhanh chóng, tin cậy (Ali et al., 2008; Jalil et al., 2015; Shakya, 2015) Hai loài Zingiber officinale Zingiber zerumbet có đặc điểm hình thái dễ dàng phân biệt với có khác chất có hoạt tính sinh học có chúng, nhiên sản phẩm dược liệu có nguồn gốc từ hai lồi khó phân biệt khơng dựa phân tích di truyền Bên cạnh đó, việc nâng cao chất lượng giống gừng hạn chế việc đánh giá chọn lọc dựa đặc điểm di truyền có biến đổi di truyền tự nhiên Do việc phân tích đa dạng xác định di truyền quan trọng trình phát triển giống gừng Việc ứng dụng thị phân tử để đánh giá xây dựng sở liệu di truyền ban đầu cần thiết từ ứng dụng cho việc xác định đánh giá, xác định sản phầm dược liệu có nguồn gốc từ gừng số loài khác Trong nghiên cứu này, phát triển ứng dụng thị phân tử để phân biệt sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ gừng, bước đầu tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền số loài chi Zingiber gừng (Zingiber officinale), gừng gió (Zingiber zerumbet), xây dựng sở liệu di truyền từ ứng dụng việc xác định sản phẩm dược liệu có nguồn gốc từ gừng đánh giá chất có hoạt tính sinh học có hai lồi Zingiber officinale Zingiber zerumbet Đồng thời, kết hợp với số lồi chi Curcuma để làm nhóm ngồi xem mối quan hệ di truyền số loài hai chi Việc ứng dụng thị phân tử công tác xác định nguồn gốc sản phẩm dược liệu góp phần nâng cao hiệu sử dụng NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu 06 mẫu giống Gừng (Zingiber sp.), 02 mẫu giống nghệ (Curcuma sp.): thân rễ (củ) thu thập tỉnh khác Trong đó, nghệ sử dụng làm nhóm ngồi nghiên cứu Bảng Danh sách 06 giống gừng 02 giống nghệ Địa điểm thu thập TT Kí hiệu Tên khoa học 01 G01 Zingiber sp Huyện Cần Giuộc - tỉnh Long An 02 G02 Zingiber sp Trung tâm Công nghệ Sinh học TP Hồ Chí Minh - quận 12 - TP HCM 03 G03 Zingiber sp Huyện Nhơn Trạch - tỉnh Đồng Nai 04 G04 Zingiber sp TP Bảo Lộc - tỉnh Lâm Đồng 05 G05 Zingiber sp TP Đà Lạt - tỉnh Lâm Đồng 06 G06 Zingiber sp Mã Pì Lèng - huyện Đồng Văn - tỉnh Hà Giang 07 N01 Curcuma sp Mã Pì Lèng - huyện Đồng Văn - tỉnh Hà Giang 08 N02 Curcuma sp Sông Nậm - tỉnh Hà Giang Ly trích DNA tổng số Tách chiết DNA tổng số dựa quy trình CTAB (Doyle, 1987) cải tiến Chuẩn bị 0,5 g mẫu, thân rễ (củ) Nghiền mẫu nitơ, bổ sung µl RNAse, ủ nhiệt độ 65°C, thời gian 60 phút Ly tâm 14,000 vòng/10 phút, thu dịch sang tube Bổ sung 500 µl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều, ly tâm 14,000 vòng/10 phút, chuyển phần dịch sang tube 1,5 mới, loại bỏ phần kết tủa, lặp lại lần Thu dịch chứa DNA tổng số Tủa DNA điều kiện ½ thể tích NaCl 5M + 1:1 thể tích ethnol 99% để đá, ly tâm 13,000 vòng/10 phút, loại bỏ dịch thu kết tủa Rửa DNA với 500 µl ethanol 70%, đảo đều, ly tâm 13,000 vòng/5 phút, loại bỏ dịch nổi, thu kết tủa Để khô nhiệt độ phòng, hòa tan kết tủa DNA 100 µl TE Bảo quản -20°C Kiểm tra chất lượng DNA chạy điện di gel agarose 0,8% kiểm tra nồng độ bước sóng 260 nm, độ tinh bước sóng 280 nm máy nanodrop (hút µl DNA tổng số cho vào đầu dị máy, tiến hành đo theo thông số cài đặt máy) PCR điện di Chọn lọc số thị phân tử DNA barcode: matK, rbcL ITS để đánh giá mối quan hệ di truyền số loài gừng thuộc chi gừng Việt Nam Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng rbcL, matK, ITS với cặp mồi tương ứng (bảng 1) Thành phần phản ứng cho 20 µl chứa 0,2 mM dNTP mix, enzyme dreamTaq polymerase U, dream taq buffer 10 X, 0,4 µM HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 mồi xi, 0,4 µM mồi ngược, nước cất lần khử trùng, µl mẫu Chu kỳ PCR: chu kỳ tiền biến tính 95° C phút; 30 chu kỳ: 95°C phút; 95°C 15 giây; Ta 30 giây; 72°C 40 giây; chu kỳ hoàn thành 72°C 10 phút Sản phẩm PCR phát điện di gel agarose 1,2%, nhuộm với ethidium bromide chụp hình máy geldoc Bảng Danh sách cặp mồi sử dụng nghiên cứu STT Trình tự mồi (5’ – 3’) Tên mồi ITS-1F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS-1R TCCTCCGCTTATTGATATGC ITS-1F TCCGTAGGTGAACCTGCGG ITS-4R TCCTCCGCTTATTGATATGC matK390-F CGATCTATTCATTCAATATTTC matK1326-R TCTAGCACACGAAAGTCGAAG Nhiệt độ bắt cặp (Ta) (°C) Kích thước dự kiến (bp) 53 700 55 rbcLa-F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC rbcLa-F GTAAAATCAAGTCCACCRCG 50 900 55 600 (Asahina et al., 2010, Takamiya et al., 2011) Phân tích đánh giá mối quan hệ di truyền dựa trình tự DNA vùng gen số loài thuộc chi gừng Sản phẩm PCR vùng matK chọn tiến hành giải trình tự máy AB3500 trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Hiệu chỉnh trình tự phần mềm ATGC, SeaView Sau hiệu chỉnh trình tự kiểm tra sai lệch Các trình tự kiểm tra công cụ BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) để tìm trình tự tương đồng có sẵn sở liệu Genbank Sử dụng phần mềm MEGA (The Molecular Evolution Genetics Analysis) để xây dựng phát sinh loài với hệ số boottrap 1000 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ly trích DNA tổng số DNA tổng số sau tách chiết định lượng kiểm tra độ tinh máy Nano Drop cho kết tỉ lệ OD260/OD280 08 mẫu nằm khoảng 1,7 - 2,0 cho thấy DNA tổng số thu tinh Nồng độ DNA tổng số mẫu nằm khoảng 121 - 189 ng/µl đảm bảo cho phép sử dụng cho bước PCR điện di Kết khuếch đại vùng DNA barcode vùng rbcL, matK, ITS với mồi tương ứng rbcLa-F rbcLaR, matK-390F matK-1326R, ITS-1F ITS-1R, ITS-1F ITS-4R sau: Hình Kết điện di sản phẩm PCR: A/ vùng rbcL, B/ vùng matK, C/ vùng ITS 06 mẫu gừng 02 mẫu nghệ gel agarose 1,2% Kết khuếch đại vùng matK kiểm tra gel garose 1,2%, cho thấy tỉ lệ khuếch đại đạt 100% kích thước vùng gen mục tiêu khoảng 1000 bp Vùng rbcL khuếch đại với tỉ lệ khuếch đại 87,5%, mẫu xuất vạch có kích thước khoảng 600 bp Đối với vùng ITS khuếch đại với cặp mồi ITS 1-F - 1R, tỉ lệ khuếch đại 87,5%, sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 700 bp - 800 bp, mẫu G05 xuất vạch sản phẩm Vùng ITS khuếch đại với cặp mồi ITS 1F – 4R cho thấy tỉ lệ khuếch đại 87,5% Sản phẩm xuất vạch có kích thước khoảng 700 bp - 800 bp mẫu N01 xuất vạch sản phẩm Vùng matK nằm vùng intron vùng trnK lục lạp, có vùng matK với kích thước từ 600 - 1500 bp sử dụng cho HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 mã vạch DNA có mặt hầu hết thực vật, có tính phổ qt nên sử dụng thị nghiên cứu mối quan hệ loài Vùng rbcL vùng gen nằm lục lạp nhân cách dễ dàng nhiều lồi thực vật Ở lồi khác kích thước gene khác (Paula, 2013) Vùng DNA ribosomal nhân (ITS1, 5.8S, ITS2) coi mã vạch DNA dễ dàng khuếch đại, có tính chun biệt đủ để phân biệt loài Kết cho thấy, tỷ lệ khuếch đại vùng gen với cặp cặp mồi khác gen sử dụng cặp cặp mồi khác có tỷ lệ khuếch đại khác Đối với cặp cặp mồi ITS1-F ITS1-R không khuếch đại mẫu N02, cặp mồi ITS1-F ITS4-R không khuếch đại mẫu G05 Trong số vùng gen lục lạp, matK phát triển nhanh chóng biến đổi cao, nhóm nghiên cứu thực vật Hiệp hội mã vạch sống (Consortium for the Barcode of Life – CBOL) đề xuất locus cho DNA barcode Khuếch đại xếp vùng matK khó khăn biến đổi cao trình tự vị trí liên kết cặp mồi (Group et al., 2009) Từ kết tỷ lệ khuếch đại cho thấy vùng matK ứng cử viên tốt việc đánh giá mối quan hệ di truyền cho mẫu thuộc họ Zingiberaceae Nghiên cứu trước cho thấy khả xác định vùng gen khác số lồi họ Zingiberaceae có khác rõ rệt Vùng gen rbcL có khả phân biệt mẫu loài 0,01% khác lồi 0,9% vùng gen matK cho khả phân biệt loài 0,06% khác loài 2,4% (Vinitha et al., 2014) Trong nghiên cứu này, vùng matK sử dụng để giải trình tự phân tích biến thể phát sinh lồi Phân tích đánh giá mối quan hệ di truyền dựa trình tự DNA vùng gen số loài thuộc chi gừng Sản phẩm PCR vùng matK khuếch đại cặp mồi matK-390F matK-1326R 06 mẫu gừng 02 mẫu nghệ giải trình tự DNA máy AB3500 Trình tự DNA thu hiệu chỉnh phần mềm ATGC Seaview BLAST ngân hàng NCBI để đánh giá tương đồng mẫu nghiên cứu, xây dựng phát sinh loài phần mềm MEGA 7.0 (The Molecular Evolution Genetics Analysis) dựa thuật toán Construct/Test Maximum Likelihood tree (ML) với hệ số bootstrap 1000 Kết phân tích trình bày bảng 3, bảng 4, hình 2, hình Bảng Kết BLAST trình tự vùng matK mẫu gừng mẫu nghệ nghiên cứu với sở Genbank Độ bao phủ (%) Độ tương quan (%) G01 KU145125.1: Zingiber officinale 100% 97,93% G02 HM367680.1: Zingiber zerumbet 99% 100% G03 KU145125.1: Zingiber officinale 99% 99% G04 KU145125.1: Zingiber officinale 99% 99% G05 KU145125.1: Zingiber officinale 99% 99% G06 KU145125.1: Zingiber officinale 99% 99% N01 KX832044.1: Curcuma longa 100% 97% N02 KF601574.1: Curcuma roscoeana 99% 99% Mẫu Trình tự tham chiếu Hình Cấu trúc vùng gen matK mẫu gừng G1 phân tích NCBI cơng cụ BLAST Phân tích trình tự DNA vùng matK mẫu gừng mẫu nghệ thu thập với thơng tin có sẵn NCBI công cụ BLAST cho thấy mức độ bao phủ đạt 99-100% mức độ tương đồng cao 97-100% Điều cho thấy hệ gene lục lạp gừng có tính bảo tồn cao cá thể khu vực cách xa mặt địa lý Hơn nữa, theo chất hệ gene lục lạp hệ gene có biến động cá thể thuộc lồi gần Kích thước vùng gen matK chi gừng nằm từ – 1053 bp, so sánh trình tự gen vùng matK mẫu gừng G01 Genbank với trình tự tham chiếu có mã ANC51626.1 cho thấy vị trí trình tự nghiên cứu nằm từ vị trí 155 bp đến vị trí 977 bp Kết phân tích trình tự DNA vùng gen matK mẫu gừng mẫu nghệ phần mềm MEGA 7.0 cho thấy có 29/926 vị trí biến đổi 879/926 vị trí bảo tồn, chứng tỏ vùng matK chi gừng có tính bảo tồn cao Ở vị trí sai khác mẫu gừng cho thấy mẫu gừng G02 có 10 vị trí sai khác so với mẫu gừng cịn lại, mẫu gừng G01 có vị trí sai khác so với mẫu lại Bốn mẫu gừng G03, G04, G05, G06 sai khác hai vị trí 924 925 Đối với hai mẫu nghệ cho thấy có sai khác 18 vị trí HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 Bảng Vị trí biến đổi nu trình tự nghiên cứu TT VỊ trí 10 11 12 13 14 15 89 99 113 134 135 136 137 140 144 145 153 184 230 231 G01 T A T A C A T A C A T A G A G02 G G T A C A T A C A C A A G G03 T A T A C A T A C A C A G A 238 A T T Mẫu G04 G05 T T A A T T A A C C A A T T A A C C A A C C A A G G A A T T G06 T A T A C A T A C A C C G A N01 T G T A C A T A C A C C G A N02 T G C T T T C T T G T A G G T T T TT Vị trí 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 302 396 472 476 522 524 685 715 724 750 835 836 924 925 G01 T A G C A C A T G T C C - G02 C G A T A C A T G T G A - G03 T A G C A C A T G T G A C T G04 T A G C A C A T G T G A C T Mẫu G05 T A G C A C A T G T G A T C G06 T A G C A C A T G T G A - N01 C G G C A C G C A C G A - N02 C G G C T G G C A C G A - Hình Cây phát sinh lồi dựa trình tự DNA vùng matK mẫu gừng, mẫu nghệ trình tự tham chiếu NCBI Cây phát sinh loài xây dựng dựa vùng gen matK cho mẫu nghiên cứu với hệ số tương đồng di truyền 0,81 chia làm nhóm chính: nhóm gừng với hệ số tương đồng di truyền 0,71 nhóm nghệ với hệ số tương đồng di truyền 0,69; điều cho thấy mẫu nhóm có khác mặt di truyền Nhóm gừng chi làm nhóm nhỏ nhóm I.1, I.2 I.3, nhóm I.3 mẫu nghệ N02 với hệ số tương đồng di truyền 0,87 Khi so sánh sai khác 29 vị trí sai khác mẫu nghệ mẫu gừng cho thấy mẫu nghệ N01 có khác biệt mặt di truyền so với mẫu gừng Nhóm I.1 gồm mẫu gừng thu thập Đà Lạt, Bảo Lộc, Lâm Đồng, Long An Hà Giang nằm với Zingiber officinal với hệ số tương đồng di truyền 0,97 Nhóm I.2 gồm mẫu gừng thu thập Tp Hồ Chí Minh nằm với Zingiber zerumbet với hệ số tương đồng di truyền 0,99 Nhóm II gồm mẫu nghệ N02 thu thập Hà Giang nằm với Curcuma roscoeana với hệ số tương đồng di truyền 0,94 Zingiber zerumbet loài thuộc chi Zingiber khơng có mối quan hệ gần gũi lồi Zingiber officinale nên nằm nhóm riêng chi Zingiber Từ kết cho thấy sử dụng trình tự DNA vùng gen matK có hiệu việc đánh giá mối quan hệ di truyền xác định loài mẫu gừng nghệ Kết phân tích trình tự DNA mẫu gừng từ hoai lồi Zingiber officinal Zingiber zerumbet có khác vị trí 89, 99, 153, 230, 231, 238, 302, 396, 472, 476, 835 836 Khi phân tích mẫu lồi Zingiber officinal cho thấy mẫu có tương đồng cao, nhiên mẫu G02 có sai khác trình tự DNA vị trí 238 838 so với mẫu G03, G04, G05 Kết cho thấy mẫu G01-05 điều thuộc loài Zingiber officinal có khác biệt định giống G02 giống cịn lại Bên cạnh đó, mẫu giống gừng thu thập từ nhiều vùng địa lý khác lại có giống mức độ định mặt di truyền Các kết cho thấy việc thu thập đánh giá di truyền giống trồng/thương mại dựa thị phân tử DNA barcode giúp nhận diện mẫu mức độ lồi, đồng thời giúp nhận diện mức độ loài số trường hợp Ngoài ra, kết nghiên cứu cho thấy giống gừng trồng/thương mại thu thập có nguồn gốc khác vị trí địa lý yếu tố định đến đặc điểm di truyền giống mà di thực hay mục đích khai thác thương mại giống làm ảnh hưởng đến phân bố loài/giống tự nhiên Từ kết nghiên cứu di truyền ban đầu này, việc nghiên cứu, đánh giá thị phân tử khác SSR, SNP, hoạt chất có hoạt tính sinh học mẫu giống thu thập giúp hiểu rõ phân bố khả khai thác dược chất kết hợp bảo tồn phát triển giống gừng Việt Nam KẾT LUẬN Khuếch đại thành công vùng matK, rbcL, ITS với cặp cặp mồi tương ứng matK390-F matK1326-R, rbcLa-F rbcLa-R, ITS1F ITS 1R, ITS-1F ITS-1R với tỉ lệ khuếch đại 100%, 87,5%, 87,5%, 87,6% Đánh giá phân tích mối quan hệ di truyền loài chi gừng với số tương đồng di truyền khoảng 97 - 100% số bao phủ từ 99 – 100% Kết phân loại di truyền định danh cho thấy mẫu gừng G01, G03, G04, G05, G06 thuộc loài Zingiber officinale mẫu G02 thuộc loài Zingiber zerumbet Mẫu nghệ N01 thuộc loài Curcuma longa mẫu N02 thuộc loài Curcuma roscoeana Kết ứng dụng nhận diện dược liệu, sản phẩm dược liệu có nguồn gốc thuộc họ gừng Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ phần kinh phí sở vật chất để thực nghiên cứu HỘI NGHỊ CƠNG NGHỆ SINH HỌC TỒN QUỐC 2020 TÀI LIỆU THAM KHẢO Ali BH, Blunden G, Tanira MO, Nemmar A (2008) Some phytochemical, pharmacological and toxicological properties of ginger (Zingiber officinale Roscoe): a review of recent research Food Chem Toxicol 46: 409-420 Asahina H, Shinozaki J, Masuda K, Morimitsu Y, Satake M (2010) Identification of medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matK and rbcL sequences J Nat Med 64: 133-138 Doyle JJ (1987) A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue Phytochem Bull 19: 11-15 Group CPW, Hollingsworth PM, Forrest LL, Spouge JL, Hajibabaei M, Ratnasingham S, van der Bank M, Chase MW, Cowan RS, Erickson DL (2009) A DNA barcode for land plants Proc Acad Sci USA 106: 12794-12797 Jalil M, Annuar MSM, Tan BC, Khalid N (2015) Effects of selected physicochemical parameters on zerumbone production of Zingiber zerumbet Smith cell suspension culture Evid Based Complement Alternat Med 2015: 1-7 Kress WJ, Erickson DL (2008) DNA barcoding: A windfall for tropical biology? Biotropica 40: 405-408 Kress WJ, García-Robledo C, Uriarte M, Erickson DL (2015) DNA barcodes for ecology, evolution, and conservation Trends Ecol Evol 30: 25-35 Paula S ( 2013) A comparison of the efficiency of DNA barcode regions in a small and a large genus PhD dissertation Department of Genetics, University of Free State Phạm Hoàng Hộ (1993) Cây cỏ Việt Nam, 1rd ed NXB Trẻ Thành phố Hồ Chí Minh Shakya SR (2015) Medicinal uses of ginger (Zingiber officinale Roscoe) improves growth and enhances immunity in aquaculture Int J Chem Stud 3: 83-87 Takamiya T, Wongsawad P, Tajima N, Shioda N, Lu JF, Wen CL, Wu JB, Handa T, Iijima H, Kitanaka S (2011) Identification of Dendrobium species used for herbal medicines based on ribosomal DNA internal transcribed spacer sequence Biol Pharm Bull 34: 779-782 Vinitha MR, Kumar US, Aishwarya K, Sabu M, Thomas G (2014) Prospects for discriminating Zingiberaceae species in India using DNA barcodes J Integr Plant Biol 56: 760-773 ASSESSMENT OF GENETIC RELATIONSHIP OF GINGERS (Zingiber spp.) IN VIETNAM BASED ON DNA BARCODE MARKERS Nguyen Truong Giang, Mai Thị Kim Ngọc, Phan Quang Huong, Huynh Huu Duc* Biotechnology Center of Ho Chi Minh City SUMMARY Currently, many studies on the classification of Zingiber in Vietnam were based primarily on morphological markers These morphological methods need to have sufficient data on the flower structure which in many cases are very difficult and limited These methods also were very difficult to apply in the ginger species because they have many similar morphological characteristics and are difficult to flower, so difficult to classify In this study, we evaluated ginger samples and turmeric samples is out group to evaluate the genetic relationship by DNA barcode marker based on matK region, rbcL on cDNA and ITS in the nucleus The results showed that the ratio of amplified regions of matK, rbcL, ITS corresponding primer pairs (matK-390F and matK-1326R, rbcLa-F and rbcLa-R, ITS-1F and ITS-1R, ITS-1F and ITS-1R) is 100%, 87.5%, 87.5%, 87.6% respectively The genetic homology among Zingiber with reference sequence of 97-100% and coverage rates of 99 - 100% Based on the phylogenetic tree, the ginger and turmeric species were divided into two different groups and Zingiber is divided into two main species, including Zingiber zerumbet and Zingiber officinale The results lead to the ability to relationship analysis and identification among Zingiberaceae specied by DNA barcode marker and offer opportunities for identification medicinal produce had source from Zingiber Keywords: DNA barcode, molecular marker, Zingiber Author for correspondence: Tel: +84-967.137.046, Email: huuduchuynh82@gmail.com ... tiến hành đo theo thông số cài đặt máy) PCR điện di Chọn lọc số thị phân tử DNA barcode: matK, rbcL ITS để đánh giá mối quan hệ di truyền số loài gừng thuộc chi gừng Việt Nam Thực phản ứng PCR... ứng dụng thị phân tử để phân biệt sản phẩm thương mại có nguồn gốc từ gừng, bước đầu tiến hành đánh giá mối quan hệ di truyền số loài chi Zingiber gừng (Zingiber officinale), gừng gió (Zingiber. .. 87,5%, 87,6% Đánh giá phân tích mối quan hệ di truyền loài chi gừng với số tương đồng di truyền khoảng 97 - 100% số bao phủ từ 99 – 100% Kết phân loại di truyền định danh cho thấy mẫu gừng G01,