PHÂN TÍCH DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO LAN GIẢ HẠC (Dendrobium anosmum) Huỳnh Hữu Đức*, Nguyễn Hoàng Cẩm Tú, Nguyễn Trường Giang, Nguyễn Thị Từ Vy, Nguyễn Thị Xuân Hiền Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh TĨM TẮT Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)) lồi phong lan q, có giá trị kinh tế cao, đặc biệt tùy theo vùng khí hậu Việt Nam mà có nhiều giống lan Giả hạc với đa dạng màu sắc hình dạng hoa khác Tuy nhiên, nhiều giống quý loài lan bị khai thác cách mức tự nhiên có nguy làm cạn kiệt nguồn gen Nhằm mục tiêu bảo tồn khai thác cách có hiệu giống lan Giả hạc đồng thời bảo tồn giống lan Giả hạc mang đặc tính di truyền quý, đặc trưng yêu cầu cấp thiết cần phải thực Trong nghiên cứu này, tiến hành đánh giá mặt di truyền dựa trình tự DNA vùng matK số mẫu giốn lan Giả hạc thu thập từ vùng khí hậu khác Kết phân tích cho thấy mẫu giống lan Giả hạc 23 có đặc tính di truyền đặc trưng, có khác biệt định so với mẫu giống lan Giả hạc lại Trên sở nguồn mẫu lan Giả hạc này, nhằm trì, phát triển khai thác cách hiệu nguồn gen, phương pháp nuôi cấy tạo PLBs từ chồi nhân chồi in vitro áp dụng nhằm nhân nhanh số mẫu từ nguồn mẫu ban đầu Kết cho thấy mơi trường ni cấy MS có bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA thích hợp cho khả tạo PLBs môi trường MS có bổ sung mg/l BA 0,2 mg/l NAA thích hợp cho khả nhân chồi từ chồi lan Giả hạc in vitro Các kết cho thấy việc áp dụng thị phân tử DNA barcode kết hợp với công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp việc phân tích, đánh giá nguồn gen đồng thời khai thác cách hiệu nguồn gen nhằm gia tăng giá trị kinh tế Từ khóa: lan Giả hạc, DNA, matK, nhân giống in vitro, PLBs MỞ ĐẦU Họ Lan (danh pháp khoa học: Orchidaceae) thuộc Măng tây (Asparagales), lớp thực vật mầm (Liliopsida) họ lớn thực vật, phân bổ nhiều nơi giới tập trung chủ yếu vùng nhiệt đới [1] Hiện nay, Việt Nam theo nghiên cứu Averyanov biết 1005 loài thuộc 155 chi [2], gồm đa dạng loài lan thuộc chi khác Dendrobium, Aerides, Cymbidium, Paphiopedilum, Rhychotilis, v v., có khoảng 275 lồi đặc hữu có giá trị kinh tế cao Trong hệ thống phân loại thực vật, chi lan Hoàng Thảo (Dendrobium) chi lớn họ hoa lan, phân bố rộng rãi khắp nơi giới, phong phú đa dạng với 1600 loài, chủ yếu vùng châu Úc, châu Á tập trung nhiều Đông Nam Á Các loài lan thuộc chi lan Hoàng Thảo loài hoa quanh năm, thích hợp cho vùng khí hậu nhiệt đới, có giá trị kinh tế cao thị trường ưa chuộng Lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) loài lan đặc hữu Việt Nam, mang nhiều đặc tính giá trị hình thái hoa khuôn hoa cân đối, to, đẹp có hương thơm nên ưu chuộng Giả hạc thường mệnh danh nữ vương lan rừng phong lan quý rừng nhiệt đới nguồn gen quý có tiềm để sử dụng việc lai tạo giống lan [3] DNA barcode phương pháp phổ biến để xác định loài sử dụng mẫu có vùng DNA đáng tin cậy ứng dụng rộng rãi giới nhằm phục vụ công tác phân loại, đánh giá đa dạng sinh học bảo tồn nguồn gen Ở Hàn Quốc, nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng hệ thống mã vạch số giống lan 94 loài 42 chi đại diện cho tất lồi họ Lan nhằm phát triển ngành cơng nghiệp hoa lan Trong đó, thị DNA barcode sử dụng để phân tích đánh giá đa dạng di truyền nhiều lồi có giá trị cao dùng làm cảnh hay dược liệu [4] Nhiều thị phân tử DNA barcode khác rbcL, psaB, atpB matK sử dụng nghiên cứu, phân tích mối quan hệ di truyền, xây dựng phát sinh loài nhiều loài khác họ Lan [5] Các trình tự vùng rbcL, matK sử dụng để xác định loài Dendrobium, đồng thời đánh giá mối quan hệ di truyền nhóm Dendrobium dựa phát sinh chủng lồi Dendrobium fimbriatum, D moniliforme, D nobile, D pulchellum, D tosaense để ứng dụng y học [6] Ngoài ra, số vùng DNA barcode khác ứng dụng để xác định loài, đánh giá mối quan hệ họ hàng loài lan chi Dendrobium matK, rbcL, rpoB, rpoC1, trnH - psbA gen lục lạp vùng ITS nhân [7] Trong đó, so sánh với thị DNA barcode khác, matK đánh giá thị cho thấy mức độ đa dạng di truyền loài khác loài đánh giá loài thuộc họ Lan Mặt khác, thực tế, phát triển số lượng lan đường sinh sản, sinh dưỡng chậm, khơng nhiều lồi lan dần tốc độ khai thác cao, vậy, phương pháp nhân giống in vitro công cụ hiệu quả, cho phép nhân nhanh, tạo số lượng lớn giống đồng mặt di truyền Nghiên cứu thực với mục tiêu đánh giá phân tích nguồn gen lan Giả hạc dựa thị DNA barcode, sau tiến hành chọn lọc mẫu giống đặc trưng đồng thời thiết lập điều kiện nhân giống vơ tính (in vitro) thích hợp tạo protocorm-like bodies (PLBs) nhân chồi lan Giả hạc in vitro làm sở cho việc cung cấp giống có nguồn gốc chất lượng cho thị trường cảnh NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Trình tự DNA vùng matK 35 mẫu giống lan Giả hạc (Dendrobium anosmum), 05 mẫu giống lan Long tu (Dendrobium primulinum), 05 mẫu giống lan Trầm rừng (Dendrobium parishii) sử dụng phân tích di truyền chọn lọc mẫu giống lan Giả hạc dùng cho nhân giống in vitro Chồi lan Giả hạc 23 (Dendrobium anosmum) in vitro có kích thước đồng nhất, mang 1-2 mở Phương pháp Phân tích di truyền mẫu giống lan Giả hạc Trình tự DNA vùng matK thu từ mẫu lan Giả hạc (Giả hạc 1-Giả hạc 35), Long tu (Long tu 1-5), Trầm rừng (Trầm rừng 1-5) thu thập từ nghiên cứu trước nhóm nghiên cứu DNA tổng số ly trích dựa quy trình CTAB [8] cải tiến cho phù hợp với mẫu ngihen cứu Trình tự DNA thu từ thực phản ứng PCR khuếch đại vùng gen matK với cặp primer tương ứng mồi matK472-F: 5’-CCC RTY CAT CTG GAA ATC TTG GTT C-3’ matK1248-R: 5’-GCT RTR ATA ATG AGA AAG ATT TCT GC-3’[6, 9] Thành phần cho phản ứng PCR 20 µl chứa 10 µl Dream Taq Green PCR Master Mix; 0,4 µl primer xuôi; 0,4 µl primer ngược; 8,2 µl nước cất lần khử trùng; µl mẫu Chu kỳ PCR tiền biến tính 95°C phút; 30 chu kỳ (biến tính 95°C 30 giây; bắt cặp 54°C 30 giây; kéo dài 72°C 40 giây); chu kỳ hoàn thành 72°C 10 phút Kết PCR phân tích đánh giá gel agarose 1,2%; hiệu điện 100 V; thời gian 30–40 phút; nhuộm với ethidium bromide chụp hình máy chụp gel (GelDocIt®2315 imager UVP-Mỹ) Các mẫu DNA cho kết PCR thành công với cặp mồi tương ứng sử dụng cho mục đích giải trình tự bước Sản phẩm PCR vùng gen matK giải trình tự cơng ty Macrogen (Hàn Quốc) Các trình tự hiệu chỉnh phần mềm ATGC (cắt bỏ hai đầu trình tự DNA bị nhiễu, khoảng từ 20-30 nucleotide hai đầu gắn primer) Sau hiệu chỉnh sai lệch, trình tự liên ứng (consensus sequence) rút từ hai kết giải trình tự kiểm tra sai lệch Trình tự liên ứng trình tự xác đoạn DNA thu từ kết giải trình tự sử dụng đánh giá Mức độ tương đồng độ bao phủ trình tự DNA với trình tự có sẵn sở liệu NCBI đánh giá công cụ BLAST Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA 6.0 (The Molecular Evolution Genetics Analysis) với thuật toán Contrust/Test Maximun Likelihood Tree from DNA sequences với hệ số boottrap 1000 (Các trình tự DNA sau hiệu chỉnh định dạng FASTA chuyển vào phần mềm MEGA; alignment trình tự DNA; chọn analysis để xác định vị trí biến đổi, vị trí bảo tồn; chọn phylogeny chọn thuật toán Contrust/Test Maximun Likelihood Tree để xây dựng phát sinh loài) Tạo PLB từ chồi in vitro lan Giả hạc Chồi lan Giả hạc in vitro sử dụng cho trình tạo PLB Mẫu cấy cấy mơi MS ½ (mơi trường khống Murashige Skoog, 1962 [10] giảm 1/2 đa lượng) bổ sung 30 g/l sucrose; 0,5 g/l pepton; 0,1 g/l inositol; 0,02 g/l glycin; g/l agar; nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) kết hợp với NAA (0,5; 1,0 mg/l); môi trường điều chỉnh pH = 5,7 Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với nghiệm thức với lần lặp lại, lần lặp lại bình, bình mẫu cấy Đánh giá khả tăng trưởng sau 12 tuần nuôi cấy với tiêu tỉ lệ mẫu cấy tạo PLBs, số PLBs (PLBs/mẫu), số chồi (chồi/mẫu), số rễ (rễ/mẫu) Nhân chồi từ chồi in vitro lan Giả hạc Chồi lan Giả hạc có kích thước đồng sử dụng cho trình tạo PLB Mẫu cấy cấy môi trường MS 1/2 bổ sung 30 g/l sucrose; 0,5 g/l pepton; 0,1 g/l inositol; 0,02 g/l glycin; g/l agar; nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BA (0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg/l) kết hợp với NAA (0,5; 1,0 mg/l); môi trường điều chỉnh pH = 5,7 Thí nghiệm bố trí ngẫu nhiên với nghiệm thức lần lặp lại, lần lặp lại bình, bình mẫu cấy Đánh giá khả tăng trưởng sau 12 tuần nuôi cấy với tiêu số chồi (chồi/mẫu), trọng lượng tươi (mg), trọng lượng khơ (mg) Điều kiện thí nghiệm Thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày với cường độ ánh sáng 20 ± µmol/m2s, độ ẩm phịng ni 70-80%, nhiệt độ phịng ni 25 ± °C với loại đèn LED khác tỷ lệ ánh sáng LED đỏ/xanh dương khác Phương pháp xử lý số liệu Số liệu phân tích xử lý phần mềm Microsoft Excel SPSS Sự khác biệt nghiệm thức đánh giá trắc nghiệm phân hạng LSD Ducan với mức độ tin cậy P≤0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Phân tích di truyền mẫu giống lan Giả hạc chọn lọc mẫu giống lan Giả hạc nhân giống in vitro Khuếch đại vùng gen matK 45 mẫu lan nghiên cứu với cặp mồi matK472-F matK1248-R cho tỷ lệ khuếch đại đạt 100% Sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 900 bp phân tích gel agarose 1,2% Sản phẩn PCR giải trình tự để phân tích mối quan hệ di truyền mẫu lan Kết phân tích hiệu chỉnh trình tự vùng matK 45 mẫu lan nghiên cứu cho thấy vùng DNA kích thước 871bp với 49 vị trí sai khác, có 17 vị trí sai khác mẫu trở lên Ở vị trí sai khác có đến 10 mẫu có thay đổi nucleotide so với mẫu lại Trên sở trình tự DNA vùng matK 35 mẫu lan Giả hạc mẫu lan Long tu, mẫu lan Trầm rừng Cây phát sinh loài nhằm đánh giá mối quan hệ di truyền phát tính đặc trưng mẫu giống xây dựng (Hình 1): Hình Kết điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại vùng gen matK 45 mẫu lan với cặp mồi matK-KIM3-F matK-KIM1-R gel agarose 1,2% (ladder: thang kích thước DNA 100-1000 bp; 1-35: Giả hạc; 36-40: Long tu; 41-45: Trầm rừng) Cây phát sinh loài 35 mẫu giống lan Giả hạc dựa trình tự vùng gen matK cho thấy có đa dạng di truyền giống thu thập Một số mẫu giống D01, D02, D04, D09, D11, D13, D14, D15, D16, D19, D21, D24, D34, D35 có tương đồng cao, mẫu Giả hạc cịn lại có phân bố rải rác có khác tương đối Đáng ý số mẫu giống D5, D7, D10, D12, D13, D6, D23 tương đồng lại tách biệt thành nhóm khác Trong đó, D23 (thu thập vùng Lâm đồng) mang số đặc trưng khác biệt Ngồi ra, mẫu Giả hạc 23 cịn mang số đặc tính hình thái màu sắc hoa đặc trưng (hoa có cánh cân đối, cánh hoa dày, có màu tím; mơi hoa có lơng, hình trịn có màu tím đậm nhạt dần rìa môi hoa, chia thùy tràng hoa) Kết xác định vị trí sai khác phân nhóm cho thấy vùng gen matK cho thấy đa dạng mẫu lan Giả hạc loài Vùng matK mang tính phổ qt lại có tiến hóa nhanh ứng dụng để phân loại đánh giá mối quan hệ di truyền mức độ loài [11] Kết tương tự Asahina cho thấy giá trị vùng matK để đánh giá mối quan hệ di truyền mẫu thu thập loài hay loài gần thuộc chi Dendrobium [6] D34-Gia hac 34 D40-Tram rung D24-Gia hac 24 D21-Gia hac 21 D16-Gia hac 16 D15-Gia hac 15 D14-Gia hac 14 D13-Gia hac 13 D11-Gia hac 11 D09-Gia hac D04-Gia hac D02-Gia hac D45-Gia hac 35 D18-Gia hac 18 D32-Gia hac 32 D01-Gia hac D25-Gia hac 25 38 D08-Gia hac D43-Tram rung D41-Tram rừng D31-Gia hac 31 D39-Long tu 51 D19-Gia hac 19 D42-Tram rung D20-Gia hac 20 92 59 D22-Gia hac 22 D28-Gia hac 28 D29-Gia hac 29 35 D30-Gia hac 30 D44-Tram rung D26-Gia hac 26 52 D27-Gia hac 27 D03-Gia hac D17-Gia hac 17 43 D35-Long tu D36-Long tu 35 D06-Gia hac D23-Gia hac 23 D05-Gia hac D07-Gia hac D10-Gia hac 10 D12-Gia hac 12 D33-Gia hac 33 Giả hạc 23 D37-Long tu D38-Long tu 0.002 Hình Cây phát sinh lồi dựa trình tự DNA vùng matK 35 mẫu giống lan Giả hạc, 05 mẫu giống lan Long tu, 05 mẫu giống lan Trầm rừng Kết phân tích cho thấy sử dụng vùng gen matK để phân tích mối liên hệ lồi lan Giả hạc, Long tu Trầm rừng mẫu nghiên cứu cho thấy phân nhóm chung mẫu Giả hạc 24, 34 với Trầm rừng 1; giả hạc 28 với Trầm rừng 5; giả hạc với Trầm rừng Kết cho thấy chúng có mối quan hệ di truyền gần có mối liên quan nguồn gốc bố mẹ Trên thực tế lai tạo giống lan, lai tạo phát triển tốt bố mẹ thuộc hai loài khác lan Giả hạc lan Trầm rừng Kết phân tích phát sinh lồi hay phân tích tính đa dạng di truyền sở quan trọng việc chọn mẫu lan Giả hạc 23 bên cạnh tiêu khác hình thái màu sắc hoa việc nhân giống in vitro bước Ngoài ra, số mẫu Giả hạc, kết không cho thấy phân nhánh sử dùng vùng gen matK để phân tích Kết chứng tỏ mẫu lan Giả hạc mang đặc tính di truyền tương tự có mối quan hệ di truyền gần so với mẫu lan Giả hạc phân nhóm di truyền khác Dựa phân nhóm di truyền cho thấy mẫu giống lan Giả hạc, Long tu, Trầm rừng có mối quan hệ di truyền gần có phân nhóm chung số trường hợp Như vậy, sở kết phân tích mối quan hệ di truyền lồi lan Giả hạc kết hợp với số lồi có quan hệ họ hàng gần Long tu Trầm rừng, mẫu lan Giả hạc 23 cho thấy số khác biệt di truyền đặc trưng định chọn lọc cho mục tiêu nhân giống Ảnh hưởng điều kiện mơi trường thích hợp cho q trình tạo PLB từ chồi lan Giả hạc PLBs đóng vai trị quan trọng trình nhân giống in vitro lồi lan nói chung Các nhà nghiên cứu chứng minh cân tỷ lệ auxin cytokinin có ý nghĩa định trình ni cấy in vitro Sau 12 tuần ni cấy đánh giá khả tạo PLB từ chồi lan Giả hạc cho kết khảo sát thể bảng hình Bảng 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tạo PLB từ chồi lan Giả hạc Nghiệm thức ĐC Mẫu tạo PLBs (%) 22,67 37,33 16,00 18,67 18,67 10,67 8,00 22,67 4,00 Số PLBs (PLBs/mẫu) 0,24b 0,41a 0,17bc 0,23bc 0,23bc 0,12bc 0,08bc 0,24b 0,07c Số chồi (chồi/mẫu) 1,13abc 1,01bc 1,09bc 1,48a 1,05bc 1,08bc 1,19abc 1,33ab 0,88c Số rễ (rễ/mẫu) 0,81d 1,33bcd 0,85d 1,64abc 1,11cd 1,36bcd 2,08a 1,96ab 1,11cd Hình thái mẫu PLB xanh, trịn, hình thành chồi PLBs xanh, dày, trịn, hình thành chồi cao PLB xanh, ít, hình thành chồi PLB xanh, hình thành chồi PLB xanh, hình thành chồi PLB ít, xanh, hình thành chồi PLB ít, hình thành chồi PLB xanh, hình thành chồi, chồi phát triển tốt PLB ít, hình thành chồi, mẫu hóa nâu Ghi chú: Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê theo trắc nghiệm phân hạn Duncan’s test với độ tin cậy P≤0,05 Hình 3: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả tạo PLB từ chồi lan Giả hạc in vitro sau 12 tuần nuôi cấy ĐC: mg/l BA + mg/l NAA, NT1: 0,5 mg/l BA + 0,5/l NAA, NT2: 0,5 mg/l BA + mg/l NAA, NT3: mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT4: mg/l BA + mg/l NAA, NT5: 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT6: 1,5 mg/l BA + mg/l NAA, NT7: mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT8: mg/l BA + mg/l NAA Từ kết nghiên cứu cho thấy mơi trường bổ sung chất điều hịa sinh trưởng cho khả tạo PLB tốt nghiệm thứ bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA đạt 0,41 PLB/mẫu đạt 37,33% mẫu tạo PLBs cao so với nghiệm thức lại so với đối chứng Mức độ tạo PLBs giảm dần bổ sung nồng độ NAA mức mg/l, cụ thể nghiệm thức 2, cho khả tạo PLB thấp đạt 0,17; 0,08 0,07 PLBs/mẫu Nghiệm thức bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA cho khả tạo PLB từ chồi tương đương với môi trường không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng Bên cạnh đó, số chồi nghiệm thức (1 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA) nghiệm thứ (2 mg/l BA; 0,5 mg/l NAA) tăng lên tốt với mức sinh trưởng đạt 1,48 1,33 chồi/mẫu so với nghiệm thức lại Nghiệm thức (1,5 mg/l BA; mg/l NAA) cho khả sinh chồi đạt 1,19 chồi/ mẫu gần tương đương với môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đạt 1,13 chồi/mẫu Số rễ cho kết tốt đạt 2,08 1,96 rễ/mẫu nghiệm thức (1,5 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) (2 mg/l BA; mg/l NAA) so với nghiệm thức lại thấp đạt 0,81 rễ/ mẫu môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng Kết cho thấy môi trường MS 1/2 bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA tạo PLBs tốt từ chồi lan Giả hạc, nhiên, để đồng thời phát triển nhiều tiêu đơn giản hóa phương pháp nghiệm thức bổ sung mg/l BA 0,5 mg/l NAA lại cho đồng thời nhiều tiêu đạt kết tốt Hiện nay, chưa có nghiên cứu tạo PLBs từ chồi lan Giả hạc, nghiên cứu tạo PLBs từ loài lan khác thuộc chi Dendrobium cho thấy việc bổ sung chất điều hịa sinh trưởng có tác động đến tạo PLBs nghiên cứu Shihai Xing cộng cho thấy môi trường tối ưu để nhân PLBs môi trường MS 1/2 bổ sung 0,5 mg NAA lan Thạch hộc [12] Nghiên cứu Lin Jiang cộng việc sử dụng mơi trường MS 1/2 bổ sung 0,1 mg NAA thích hợp cho tạo nhân PLB lan Hoàng thảo kèn [13] Như vậy, mơi trường thích hợp cho khả tạo PLBs từ chồi lan Giả hạc nghiên cứu môi trường MS 1/2 bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA Ảnh hưởng điều kiện mơi trường thích hợp cho q trình nhân chồi từ chồi lan Giả hạc in vitro Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (phytohormone) thành phần quan trọng môi trường nuôi cấy Những chất giúp nhà nghiên cứu chủ động điều khiển trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Có nhóm chất điều hịa sinh trưởng thường sử dụng nhân giống in vitro nhóm auxin cytokinin Trong nghiên cứu này, auxin sử dụng NAA cytokinin sử dụng BA với nồng độ khác để khảo sát khả tạo chồi Kết đánh giá khả nhân chồi từ chồi lan Giả hạc sau 12 tuần nuôi cấy thể bảng hình Từ kết nghiên cứu cho thấy mơi trường bổ sung chất điều hịa sinh trưởng cho khả nhân chồi tốt nghiệm thức (1 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) đạt 2,16 chồi/mẫu cao so với nghiệm thức lại so với đối chứng Các nghiệm thức (0,5 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA), (1,5 mg/l BA; mg/l NAA), (0,5 mg/l BA; mg/l NAA) cho khả tạo chồi vượt cao so với đối chứng đạt 1,63; 1,55 1,49 chồi/mẫu Các nghiệm thức lại cho kết gần tương đương thấp so với đối chứng, nhiên, nghiệm thức (1 mg/l BA; mg/l NAA) đạt 0,99 chồi/ mẫu thấp nghiệm thức cho thấy nồng độ không phù hợp cho khả tạo chồi lan Giả hạc Trọng lượng tươi nghiệm thức cho kết cao vượt trội đạt 0,27g, cao so với nghiệm thức lại so với đối chứng Nghiệm thức có số chồi thấp trọng lượng tươi đạt cao với mẫu đối chứng nghiệm thức (1,5 mg/l BA; 1mg/l NAA) 0,21g Cho kết thấp tiêu trọng lượng tươi nghiệm thức nghiệm thứ đạt 0,06 0,09g Trọng lượng khô nghiệm thức 2, 6, 7, (2 mg/l BA; 0,2 mg/l NAA) gần cho kết tương đương 0,009; 0,011; 0,012 0,011g thấp so với đối chứng Nghiệm thức cho kết trọng lượng khô cao đạt 0,017g so với nghiệm thức lại đối chứng Kết thấp nghiệm thức đạt 0,005g Kết cho thấy môi trường MS 1/2 bổ sung mg/l BA 0,2 mg/l NAA nghiệm thức phù hợp cho khả nhân chồi từ chồi lan Giả hạc Kết khác biệt với kết nghiên cứu Nguyễn Thị Mỹ Duyên khảo sát khả nhân chồi lan Giả hạc cho kết tốt mơi trường MS có bổ sung 3mg/l BA 0,5 mg/l NAA [14] Bên cạnh đó, số nghiên cứu loài Dendrobium cho khả nhân chồi tốt nghiên cứu Nguyễn Quỳnh Trang cộng lồi Giả hạc mơi trường Knuds có bổ sung 0,3 mg/l NAA, 0,3 mg/l Kinetin 0,3 mg/l BAP nghiên cứu Talukder cộng lồi Dendrobium mơi trường MS có bổ sung 2,5 mg BAP 0,5 mg NAA [15, 16] Như vậy, mơi trường thích hợp cho khả nhân chồi từ chồi ngon lan Giả hạc nghiên cứu mơi trường MS 1/2 có bổ sung mg/l BA 0,2 mg/l NAA Bảng 4: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả nhân chồi từ chồi lan Giả hạc Nghiệm thức ĐC Số chồi (chồi/mẫu) 1,39bc 1,49bc 1,63ab 0,99c 2,16a 1,55bc 1,33bc 1,15bc 1,52bc Trọng lượng tươi (g) 0,21ab 0,06c 0,11bc 0,21ab 0,27a 0,09bc 0,21ab 0,12bc 0,12bc Trọng lượng khô (g) 0,015ab 0,005c 0,009abc 0,017a 0,017a 0,008bc 0,011abc 0,012abc 0,011abc Hình thái mẫu Chồi tăng trưởng chiều cao, hình thành PLBs Chồi tăng trưởng chiều cao Chồi phát triển Chồi phát triển chậm Nhân nhanh chồi, chối tăng trưởng chiều cao Lá vàng Chồi tăng trưởng chậm có vàng Chồi tăng trưởng chậm, hình thành PLBs Chồi tăng trưởng chậm, hình thành PLBs Ghi chú: Các chữ khác cột biểu thị khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê theo trắc nhiệm phân hạn Duncan’s test với độ tin cậy P≤0,05 Hình Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả nhân chồi từ chồi lan Giả hạc in vitro sau 12 tuần nuôi cấy ĐC: mg/l BA + mg/l NAA, NT1: 0,5 mg/l BA + 0,5/l NAA, NT2: 0,5 mg/l BA + mg/l NAA, NT3: mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT4: mg/l BA + mg/l NAA, NT5: 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT6: 1,5 mg/l BA + mg/l NAA, NT7: mg/l BA + 0,5 mg/l NAA, NT8: mg/l BA + mg/l NAA KẾT LUẬN Các mẫu lan Giả hạc thu thập có tương đồng khác biệt định mặt di truyền sở phân tích trình tự DNA vùng matK Kết cho thấy có đa dạng nguồn gen mẫu giống thu thập loài lan Giả hạc (Dendrobium anosmum) Ngồi ra, từ kết phân tích này, mẫu lan Giả hạc 23 với số đặc trưng khác biệt định so với mẫu lại chọn cho mục đích nhân giống in vitro Trong nhân giống in vitro, việc sử dụng môi trường nuôi cấy MS có bổ sung 0,5 mg/l BA 0,5 mg/l NAA thích hợp cho khả tạo PLBs mơi trường MS có bổ sung mg/l BA 0,2 mg/l NAA thích hợp cho khả nhân chồi Các kết cho thấy việc bảo tồn khai thác nguồn gen lan Giả hạc cách hợp lý hiệu Việt Nam hoàn toàn khả thi Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ phần kinh phí sở vật chất để thực nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] J T Atwood, "The size of the Orchidaceae and the systematic distribution of epiphytic orchids," Selbyana, pp 171-186, 1986 [2] L V Averyanov and A L Averyanova, "Orchid flora of Vietnam: new discovery and some of their characteristics," Advances in Natural Sciences, vol 10, no 3, pp 353– 365, 2009 [3] Trần Hợp, “Phong lan Việt Nam”, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 1990 [4] H M Kim, S H Oh, G S Bhandari, C S Kim, and C W Park, "DNA barcoding of Orchidaceae in Korea," Molecular ecology resources, vol 14, no 3, pp 499-507, 2014 [5] J V Freudenstein and M W Chase, "Phylogenetic relationships in Epidendroideae (Orchidaceae), one of the great flowering plant radiations: progressive specialization and diversification," Annals of botany, vol 115, no 4, pp 665-681, 2015 [6] H Asahina, J Shinozaki, K Masuda, Y Morimitsu, and M Satake, "Identification of medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matK and rbcL sequences," Journal of Natural Medicines, vol 64, no 2, pp 133-138, 2010 [7] H K Singh, I Parveen, S Raghuvanshi, and S B Babbar, "The loci recommended as universal barcodes for plants on the basis of floristic studies may not work with congeneric species as exemplified by DNA barcoding of Dendrobium species," BMC research notes, vol 5, no 1, p 42, 2012 [8] J J Doyle, "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue," Phytochem Bull., vol 19, pp 11-15, 1987 [9] E A Sinclair, M Pérez-Losada, and K A Crandall, "Molecular phylogenetics for conservation biology," Phylogeny and conservation Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp 19-56, 2005 [10]T Murashige and F Skoog, "A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures," Physiologia Plantarum, vol 15, pp 473–97, 1962 [11]C P W Group et al., "A DNA barcode for land plants," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 106, no 31, pp 1279412797, 2009 [12]Z Wang et al., "Putative genes in alkaloid biosynthesis identified in Dendrobium officinale by correlating the contents of major bioactive metabolites with genes expression between Protocorm-like bodies and leaves," BMC genomics, vol 22, no 1, pp 1-17, 2021 [13]L Jiang, P Ding, and Y.-d Zheng, "Effects of additives on tissue culture and rapid propagation of Dendrobium canducum," Zhong yao cai= Zhongyaocai= Journal of Chinese medicinal materials, vol 26, no 8, pp 539-541, 2003 [14]Nguyễn Thị Mỹ Duyên, "Quy trình vi nhân giống lan Giả hạc (Dendrobium anosmum)" Tạp chí khoa học quốc tế AGU, vol 27, no 1, pp 73-82, 2021 [15]Nguyễn Quỳnh Trang, Vũ Thị Huệ, Khuất Thị Hải Ninh, "Nhân giống in vitro lan phi điệp tím (Dendrobium anosmum)," Tạp chí KH&CN Lâm nghiệp, số 3, kỳ 1, pp 15-21,2013 [16]S Talukder, K Nasiruddin, S Yasmin, L Hassan, and R Begum, "Shoot proliferation of Dendrobium orchid with BAP and NAA," Journal of Biological Sciences, vol 3, no 11, pp 1058-1062, 2003 GENETIC ANALYSIS AND IN VITRO PROPAGATION OF SELECTED Dendrobium anosmum COLLECTION Huynh Huu Duc*, Nguyen Hoang Cam Tu, Nguyen Truong Giang, Nguyen Thi Tu Vy, Nguyen Thi Xuan Hien, Biotechnology Center of Ho Chi Minh City SUMMARY Gia hac (Dendrobium anosmum) is a precious orchid with high economic value, especially distributed on diverse climate of Vietnam There are many varieties of Gia hac orchids with different colors and shapes However, many of these orchids have been over-exploited in nature and are at risk of depleting genetic resources Therefore, it is necessary to effectively conserve Gia hac orchids with precious genetic characteristics and to sustainable exploit these Gia Hac orchids In this study, we have carried out genetic evaluation Gia hac collections, origin from different climates, based on DNA sequences of matK The genetic analysis results showed that the sample of the Gia hac 23 obtained specific genetic characteristics, with certain differences compared with the remaining samples of the others In order to effectively maintain, develop and exploit this genetic resources, PLBs induction and shoot multiplication method were applied to rapidly multiply and create a large of shoots from an original single explant The results showed that the MS medium supplemented with 0.5 mg/l BA and 0.5 mg/l NAA was suitable for PLBs induction and the MS medium supplemented with mg/l BA and 0.2 mg/l BA and 0.2 mg/l NAA These results also indicated that application of DNA barcode markers and plant tissue culture technology together can evaluate and exploit Gia hac genetic resources effectively, and also increase income value Keywords: Dendrobium anosmum, DNA, matK, micropropagation, PLBs *Author for correspondence: Tel: +84-967137046; Email: huuduchuynh82@gmail.com ...Chồi lan Giả hạc 23 (Dendrobium anosmum) in vitro có kích thước đồng nhất, mang 1-2 mở Phương pháp Phân tích di truyền mẫu giống lan Giả hạc Trình tự DNA vùng matK thu từ mẫu lan Giả hạc (Giả hạc. .. để phân tích Kết chứng tỏ mẫu lan Giả hạc mang đặc tính di truyền tương tự có mối quan hệ di truyền gần so với mẫu lan Giả hạc phân nhóm di truyền khác Dựa phân nhóm di truyền cho thấy mẫu giống. .. trình phát sinh hình thái thực vật in vitro Có nhóm chất điều hịa sinh trưởng thường sử dụng nhân giống in vitro nhóm auxin cytokinin Trong nghiên cứu này, auxin sử dụng NAA cytokinin sử dụng