NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ DNA BARCODE TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ LOÀI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus spp.)

Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x DOI:10.22144/ctu.jsi.2019.x NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG MỘT SỐ DNA BARCODE TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN MỘT SỐ LỒI LAN KIM TUYẾN (Anoectochilus SPP.) Huỳnh Hữu Đức1*, Nguyễn Trường Giang1, Dương Hoa Xơ1, Hà Thị Loan1, Phan Đình Yến1, Trần Trọng Tuấn2 và Đỗ Đăng Giáp2 Trung tâm Công nghệ Sinh học Tp Hồ Chí Minh Viện sinh học nhiệt đới *Người chịu trách nhiệm viết: Huỳnh Hữu Đức (email: huuduchuynh82@gmail.com) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận bài: 13/11/2018 Ngày nhận sửa: 16/01/2019 Ngày duyệt đăng: 12/04/2019 Title: Using some dna barcode for the genetic analysis and identifying some species of Anoectochilus spp Từ khóa: DNA barcode, Lan Kim tuyến, ITS, matK, rbcL Keywords: Anoectochilus, DNA barcode, ITS, matK, rbcL Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x ABSTRACT In this study, Anoectochilus and Lusidia species were colletion for identified and genetic analysis with purpose to conserve and exploit properly these genetic resources DNA barcode method has been applied successfully for species identification, obtain more advantages in comparison to morphological and biochemical methods Six species of Anoectochilus and Lusidia genera were used for genetic analysis and identification through using chloroplast and nuclease DNA regions such as: rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS The results showed that the amplifications of the DNA regions were different between barcodes and ranged from 50%-100% The amplifications of region ITS1 and ITS2 100%, region ITS 83.3%, region rbcL 50%, region matK range from 66.7 – 83.3%, region rpoB and rpoC is 83.3% Based on ITS1 and ITS2 DNA sequence, genetics analysis phylogenetic tree constructing results showed the relationship and the discrimination between and among Anoectochilus and Lusidia species The results showing successful uses of these DNA barcdes in identifying and discriminating Anoectochilus species and their relatives can be performed successfully, then open opportunities for conservation and sustainable uses genetic resources TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, số loài lan thuộc chi Anoectochilus Lusidia thu thập chọn lọc để định danh phân tích di truyền nhằm mục tiêu bảo tồn, khai thác cách hợp lý nguồn gen Hiện nay, kỹ thuật DNA barcode ứng dụng thành cơng việc định danh xác định lồi, có ưu sử dụng phương pháp hình thái sinh hóa Trong nghiên cứu này, 06 mẫu giống lan thuộc chi Anoectochilus Lusidia sử dụng để phân tích di truyền xác định loài dựa vùng gen lục lạp nhân như: rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2, ITS1, ITS2, ITS Kết phân tích DNA mẫu giống cho tỷ lệ khuếch đại thành công từ 50-100% cho DNA barcode khác Vùng ITS1 ITS2 cho tỷ lệ khuếch đại đạt 100%, vùng ITS 83,3%, vùng rbcL 50%, vùng matK từ 66,7 – 83,3%, vùng rpoB rpoC đạt 83,3% Kết phân tích mối quan hệ di truyền giữa giống dựa trình tự DNA số vùng DNA barcode ITS1 ITS2 cho thấy phân biệt giữa lồi gần Cây phân nhóm dựa vùng ITS2 chia Anoectochilus Lusidia làm nhóm chính, nhóm Anoectochilus chia làm hai nhóm phụ thuộc hai lồi Anoectochilus formosanus Anoectochilus roxburghii Các kết ứng dụng việc nhận diện phân biệt loài lan Kim tuyến họ hàng chúng, từ mở khả bảo tồn khai thác bền vững ng̀n gen lồi Trích dẫn: Huỳnh Hữu Đức, Nguyễn Trường Giang, Dương Hoa Xô, Hà Thị Loan, Phan Đình Yến, Trần Trọng Tuấn và Đỗ Đăng Giáp, 2019 Nghiên cứu sử dụng số dna barcode phân tích di truyền và nhận diện số loài lan kim tuyến (Anoectochilus spp.) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 55(Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học)(1): x-x Anoectochilus roxburhii Có khoảng 30 - 40 lồi phân bố chủ yếu từ vùng Himalaya đến Đông Nam Á, miền Nam Trung Hoa, Australia, Malaysia, Ấn Độ, Nhật, Papua New Guinea số quần đảo thuộc quần đảo Thái Bình Dương (Teuscher, 1978) GIỚI THIỆU Chi Lan Kim tuyến (Anoectochilus) thuộc họ lan (Orchidaceae) có nhiều lồi có giá trị kinh tế giá trị dược liệu cao như: Anoectochilus formosanus, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Ở Việt Nam, lan Kim tuyến (Anoectochilus) thống kê 12 loài, có loài lan Kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume, tên khác Anoectochilus roxburghii Wall ex Lindl phân bố rộng hầu hết tỉnh nước và biết đến nhiều không những giá trị làm cảnh, mà giá trị làm thuốc của (Phạm Hoàng Hộ, 2010) Chúng có nhiều hoạt chất có giá trị thân và chứa kinsenoside có khả bảo vệ gan, chứa nhiều hợp chất glycoside flavonoids khác có khả chữa bệnh tiểu đường, cao huyết áp, viêm thận và ung thư (Du et al., 2003; Fang et al., 2008) Do có giá trị dược liệu giá trị kinh tế cao nên bị khai thác mức, không kết hợp bảo vệ, lồi lan Kim tuyến bị đe dọa nghiêm trọng, bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên, khơng có biện pháp bảo tồn hữu hiệu Năm 2007, Nghị định số 32/2006/CP và Sách đỏ Việt Nam, lan Kim tuyến xếp vào nhóm IA, nhóm thực vật rừng nguy cấp EN nhóm thực vật nghiêm cấm khai thác mục đích thương mại nhóm thực vật rừng nguy cấp EN A1 a, c, d, Sách đỏ Việt Nam đó, DNA barcode là phương pháp phổ biến để xác định lồi sử dụng những vùng DNA đáng tin cậy và ứng dụng rộng rãi giới nhằm phục vụ công tác phân loại, đánh giá đa dạng sinh học bảo tồn nguồn gen (Group et al., 2009) Ở Hàn Quốc, nghiên cứu chuyên sâu ứng dụng hệ thống mã vạch số giống lan của 94 loài 42 chi đại diện cho tất lồi của họ lan nhằm phát triển ngành công nghiệp hoa lan Trong đó, nhiều lồi số có giá trị cao dùng làm cảnh hay dược liệu sử dụng thị phân tử DNA barcode để định danh (Lee, 2011; Kim et al., 2014) Các mối quan hệ phát sinh lồi của lồi họ lan phân tích dựa marker phân tử DNA barcode khác như: rbcL (Cameron et al., 1999), psaB, atpB (Cameron, 2006) matK (Freudenstein and Chase, 2015) Hiện nay, số nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật DNA barcode để phân tích mối quan hệ di truyền và xác định loài của số loài thuộc chi Anoectochilus, Lusidia (Chen and Shiau, 2015; Xu et al., 2015; Đỗ Thị Gấm ctv., 2015; Asahina et al., 2010) Đồng thời, việc sử dụng nguồn nguyên liệu Trong nghiên cứu này, bước đầu sử dụng vùng lan Kim tuyến chưa xác định rõ nguồn gốc DNA barcode rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, (hình thái tương tự nhau) làm giảm giá trị rpoC2, ITS1, ITS2, ITS để đánh giá mối quan hệ di dược liệu Do đó, việc sưu tập, đánh giá, định danh truyền giữa số loài lan Kim tuyến định bảo tồn giống lan Kim tuyến nói riêng lan danh từ làm sở cho việc phân tích di truyền dược liệu yêu cầu thiết yếu Theo truyền thống, nhận diện lồi việc định danh thường dựa đặc tính hình VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP thái, đặc biệt hoa Tuy nhiên, loài lan đa NGHIÊN CỨU dạng và phong phú đồng thời loài gần 2.1 Vật liệu nghiên cứu thường có hình thái tương tự nên khó phân biệt thiếu hoa Hiện nay, phương pháp sử dụng 06 mẫu thuộc chi Anoectochilus Lusidia thị phân tử việc định danh nghiên cứu thu thập từ nguồn khác (Bảng 1) di truyền ngày càng sử dụng phổ biến Trong Bảng 1: Danh sách loài thuộc chi Anoectochilus Lusidia thu thập Ký hiệu AF1 AF2 A3 A4 LD1 LD2 Nơi thu thập Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh Đà Nẵng Quảng Nam Trung tâm CNSH Tp Hồ Chí Minh Tên khoa học Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus sp Anoectochilus sp Lusidia discolor Lusidia discolor Chú thích: CNSH: Cơng nghệ sinh học Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Hình 1: Một sớ lồi thuộc chi Anoectochilus, Lusidia được sử dụng nghiên cứu μl ethanol 70% lạnh và đảo ống, ly tâm 13.000 rpm phút (lặp lại lần), loại bỏ dịch nổi, thu tủa Để khơ kết tủa nhiệt độ phịng Hịa DNA 200 µl nước khử trùng hai lần 2.3 PCR 2.2 Ly trích DNA tổng sớ Mẫu của mẫu lan Kim tuyến thu thập vùng địa lý khác (đã xác định chưa xác định lồi) mẫu có đặc điểm hình thái tương tự để tiến hành phân tích Các phản ứng PCR thực nhằm khuếch DNA tổng số của mẫu giống ly trích đại vùng ITS, ITS1, ITS2, rbcL, matK, rpoB1, dựa quy trình CTAB (Doyle, 1987) rpoB2, rpoC1, rpoC2 với cặp primer tương ứng thay đổi số điều kiện Nghiền 100 mg mẫu (Bảng 2) Thành phần cho phản ứng PCR 500 μl CTAB 2% + PVP 2% nhiệt độ phòng 20 µl: 0,2 mM dNTP mix, enzyme DreamTaq Hỗn hợp mẫu/CTAB ủ 65oC 60 phút,ly polymerase 1U, dream taq buffer 10X, 0,4 µM tâm hỗn hợp mẫu/CTAB 14.000 rpm 10 primer xi, 0,4 µM primer ngược, nước cất lần phút Chuyển dịch sang ống mới, bổ sung 4µl khử trùng, µl mẫu với nồng độ DNA từ 100 – 500 o RNAase, ủ 37 C thời gian phút, bổ sung ng/µl Chu kỳ PCR tiền biến tính 95oC phút; 500 μl hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol (24:1), 30 chu kỳ (biến tính 95oC 30 giây; bắt cặp lắc đều, ly tâm tốc độ 14.000 rpm 10 phút (Ta: Bảng 2) 30 giây; 72oC 40 giây); chu Thu dịch (chứa DNA) sang ống (khoảng kỳ hoàn thành 72oC 10 phút Kết PCR 450-500µl), bổ sung ethanol tuyệt đối (tỷ lệ 1:1 so phân tích đánh giá gel agarose 1,2%, hiệu với thể tích thu được) ½ thể tích NaCl 5M so với điện 100V, thời gian 30-45 phút, nhuộm với thể tích thu Hỗn hợp ủ đá ethidium bromide chụp hình máy chụp gel giờ, ly tâm 13.000 rpm 10 phút Hỗn hợp sau (GelDoc-It®2315 imager UVP-Mỹ) ly tâm loại bỏ dịch nỗi thu tủa, bổ sung 500 Bảng 2: Vùng gen DNA barcode primer được sử dụng để sàng lọc vùng gen thích hợp phân tích sớ lồi thuộc chi Anoectochilus, Lusidia Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Vùng gen ITS ITS1 ITS2 matK rbcL rpoB1 rpoB2 rpoC1 rpoC2 Primer ITS1-F ITS4-R ITS1-L1F ITS1-R ITS2-S3R ITS2-F matK-1F matK-1R matK390F matK1326R matK2.1F matK5R rbcLa - F rbcLa - R rpoB1_F rpoB1_R rpoB2_F rpoB2_R rpoC1_F rpoC1_R rpoC2_F rpoC2_R Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Trình tự primer (5’-3’) TCC GTA GGT GAA CCT GCG G TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC ATGCGATACTTGGTGTGAAT TCCTCCGCTTATTGATATGC GAC GCT TCT CCA GAC TAC AAT CGA TAC TTG GTG TGA ATT GCA G ATC CAT ATG GAA ATC TTG GTT C GTT CTA GCA CAC GAA AGT CG CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T CCT ATC CAT CTG GAA ATC TTA G GTT CTA GCA CAA GAA AGT CG ATG TCA CCA CAA ACA GAG ACT AAA GC GTA AAA TCA AGT CCA CCR CG AAG TGC ATT GTT GGA ACT GG CCG TAT GTG AAA AGA AGT ATA ATG CAA CGT CAA GCA GTT CC GAT CCC AGC ATC ACA ATT CC GTG GAT ACA CTT CTT GAT AAT GG TGA GAA AAC ATA AGT AAA CGG GC GGC AAA GAG GGA AGA TTT CG CCA TAA GCA TAT CTT GAG TTG G Ta (oC) 57 55 53 50 50 54 55 55 59 60 58 Nguồn: (Sinclair, Pérez-Losada et al., 2005, Asahina, Shinozaki et al., 2010, Singh, Parveen et al., 2012, Siripiyasing et al., 2012) 2.4 Giải trình tự phân tích mới quan hệ di truyền KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN DNA tổng số của loài phân tích tiến hành định lượng kiểm tra độ tinh Kết cho thấy mẫu có độ tinh cao với OD260/OD280 nằm khoảng 1,71 - 1,84 Nồng độ DNA tổng số mẫu nằm khoảng 151,8 – 249,8 ng/µl đảm bảo tiêu chuẩn chất lượng cho bước 3.1 PCR Trên sở phân tích khả khuếch đại thành công của cặp primer với vùng gen tương ứng cho tỷ lệ khuếch đại thành công cao cho tất mẫu chọn để giải trình tự DNA Sản phẩm PCR giải trình tự cơng ty Macrogen (10F, 254 Beotkkot-ro geumcheon-gu, Soul 08511, Rep of Korea) Các trình tự hiệu chỉnh phần mềm ATGC kiểm tra sai lệch Đánh giá mức độ tương đồng và độ bao phủ của trình tự DNA với trình tự có sẵn sở dữ liệu NCBI công cụ BLAST Cây phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA 7.0 (The Molecular Evolution Genetics Analysis) với hệ số boottrap 1000 Kết PCR dựa DNA tổng số của 06 mẫu lan nghiên cứu cho thấy băng xuất rõ Tỷ lệ khuếch đại của vùng DNA barcode khác với primer chuyên biệt cho barcode cho tỷ lệ khuếch đại khác (Bảng 3) Bảng 3: Tỷ lệ khuếch đại các vùng DNA barcode của 06 mẫu lan nghiên cứu Ký hiệu AF1 AF2 A3 A4 LD1 LD2 Ký hiệu Tên khoa học Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus sp Anoectochilus sp Lusidia discolor Lusidia discolor Tỷ lệ khuếch đại (%) Tên khoa học Nơi thu thập TT CNSH TT CNSH HCM Đà Nẵng Quảng Nam TT CNSH Nơi thu thập x x x x x x 100 Vùng ITS x x x x x xx x xx x x x 100 83,3 Vùng matK rbcL x x x 50 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ AF1 AF2 A3 A4 LD1 LD2 Ký hiệu AF1 AF2 A3 A4 LD1 LD2 Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus sp Anoectochilus sp Lusidia discolor Lusidia discolor Tỷ lệ khuếch đại (%) Tên khoa học Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus sp Anoectochilus sp Lusidia discolor Lusidia discolor Tỷ lệ khuếch đại (%) Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x TT CNSH TT CNSH HCM Đà Nẵng Quảng Nam TT CNSH Nơi thu thập TT CNSH TT CNSH HCM Đà Nẵng Quảng Nam TT CNSH x x x x x x x x x 66,7 83,3 Vùng rpoB Vùng rpoC 10 11 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 83,3 83,3 83,3 83,3 Chú thích: 1/Khuếch đại vùng ITS1 với cặp primer ITS1-F ITS1-R, 2/Khuếch đại vùng ITS2 với cặp primer ITS2-F ITS2-S3R, 3/Khuếch đại vùng ITS với cặp primer ITS1-F ITS4-R, 4/Khuếch đại vùng rbcL với cặp primer rbcLaF-và rbcLa-R, 5/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK1-Fvà matK1-R, 6/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK390-F matK1326-R, 7/Khuếch đại vùng matK với cặp primer matK2.1-F matK5-R, 8/Khuếch đại vùng rpoB1 với cặp primer rpoB1-F rpoB1-R, 9/Khuếch đại vùng rpoB2 với cặp primer rpoB2-F rpoB2-R, 10/Khuếch đại vùng rpoC1 với cặp primer rpoC1-F rpoC1R, 11/Khuếch đại vùng rpoC2 với cặp primer rpoC2-F rpoC2-R HCM: thành phố Hồ Chí Minh TT CNSH: Trung tâm công nghệ sinh học Tp Hờ Chí Minh Hình 2: Kết PCR của 03 vùng DNA barcode: A/ gen ITS, B/gen rbcL, C/ gen matK gel agarose 1,2% vùng DNA barcode khác cho tỷ lệ khuếch đại thấp từ 50-83,3% (Bảng 3) với kích thước vùng gen matK (900-1000bp), rbcL (1500-1600bp), rpoB1 rpoB2 (550-600bp), rpoC1 rpoC2 (500-600bp) Các vạch xuất rõ phân tích Vùng ITS1, ITS2 cho tỷ lệ khuếch đại 06 mẫu lan thuộc chi Anoectochilus, Lusidia với 100%, kích thước tương ứng 450-500 bp 550-600 bp Vùng gen ITS cho tỷ lệ khuếch đại đạt 83,3% cho băng sản phẩm mẫu A3 và A4 Đối với Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x gel agarose 1,2% Đối với vùng gen matK sử dụng cặp primer matK2.1F matK5R để khuếch đại không cho sản phẩm Tuy nhiên, nghiên cứu trước sử dụng cặp primer để phân tích lồi lan thuộc chi Dendrobium cho tỷ lệ khuếch đại từ 90-100% (Nhóm tác giả, 2018) Đây là điểm đáng chú ý tiến hành nghiên cứu giải trình tự vùng gen thuộc chi khác của họ phong lan Dựa kết PCR của mẫu lan nghiên cứu khả nhận diện của DNA barcode mức độ khác để tiến hành chọn lựa vùng DNA barcode và primer để tiến hành giải trình tự Vùng ITS2 khuếch đại với primer ITS2-F và ITS2-S3R chọn lựa để giải trình tự có tỷ lệ khuếch đại đạt 100% và vùng ITS2 sử dụng nhiều việc nhận dạng số loài lan Kim tuyến 3.2 Đánh giá, định danh, phân tích mới quan hệ di truyền của giớng lan Kim Tún 600 bp giải trình tự công ty Macrogen (10F, 254 Beotkkot-ro geumcheon-gu, Soul 08511, Rep of Korea) Hiệu chỉnh trình tự phần mềm ATGC Các trình tự sau hiệu chỉnh BLAST NCBI và phát sinh loài xây dựng phần mềm MEGA 7.0 với hệ số bootstrap 1000 Kết BLAST NCBI cho thấy trình tự tương đồng mức độ bao phủ của DNA barcode nghiên cứu trình tự NCBI của 06 mẫu lan nghiên cứu vùng ITS1 (99%-100%, 98100%), ITS2 (76-79%, 99-100%) Điều cho thấy trình tự vùng ITS1, ITS2 khuếch đại của giống nghiên cứu mức độ tương đồng cao so với trình tự cơng bố NCBI Phân tích hai lồi Anoectochilus sp (A3) có tương đồng với Anoectochilus formosanus (GQ396668.1 GQ328777.1) với tỷ lệ 99-100% Anoectochilus sp (A4) có tương đồng với Anoectochilus roxburghii (KR815828.1) Các loài xác định dựa hình thái có tương đồng cao so với trình tự công bố (Bảng 4) Kết PCR cho thấy vùng ITS1 có kích thước khoảng 450-500 bp, vùng ITS2 có kích thước 550Bảng 4: Đánh giá mức độ tương đồng bao phủ của trình tự DNA vùng ITS1, ITS2 của mẫu nghiên cứu với trình tự tương ứng NCBI Mẫu AF1 AF2 A3 A4 LD LD AF1 AF2 A3 A4 LD LD Vùng gen ITS1 ITS2 Trình tự tham chiếu GQ396668.1 GQ328777.1 GQ396668.1 KR815828.1 KR815834.1 KR815834.1 GQ328777.1 GQ328777.1 GQ328777.1 KR815828.1 KR815834.1 AJ539483.1 Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus roxburghii Lusidia discolor Lusidia discolor Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus formosanus Anoectochilus roxburghii Lusidia discolor Lusidia discolor Độ bao phủ (%) 99 100 100 99 98 99 76 76 79 78 77 77 Độ tương đồng(%) 99 100 100 100 99 99 99 99 99 99 99 100 khác biệt trình tự DNA của lồi so với lồi Phân tích trình tự DNA của vùng gen ITS1, ITS2 cịn lại 25 vị trí có khác biệt từ lồi trở lên sau hiệu chỉnh có kích thước tương ứng so với lồi cịn lại, ITS2 35/477 vị trí 393 bp 477 bp, thực phân tích phần vị trí khác biệt trình tự DNA của lồi so với mềm MEGA 6.0 cho kết vùng bảo tồn của trình lồi cịn lại 29 vị trí có khác biệt từ lồi tự ITS1 365/393, ITS 438/477 vị trí, vùng trở lên so với lồi cịn lại (Bảng 5,6) biến đổi của trình tự ITS1 là 27/393 vị trí Bảng 5: Vị trí sai khác của lồi lan Kim tún dựa trình tự DNA vùng ITS1 Vị trí sai khác 52 60 117 126 128 135 Mẫu AF1 T A A G A T AF2 T A A G A T A3 T A A G A T A4 T A A G A T LD1 C T G A T G LD2 C T G A T G Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 143 145 147 148 171 174 175 186 200 245 260 275 284 285 289 290 302 309 329 335 359 393 T G C T T A C C A A A C G G A A G A C A A A Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x T G C T T A C C A A A C G G A A G A C A A A T G C T T A C C A A A C G G A A G A C A A A T G C T T A C A A A A C G G A A A A C A A A C A T C C G T C G T G T A A T C C T T G T A C A T C C G T C G T G T A A T C C T T G T T Bảng 6: Vị trí sai khác của loài lan Kim tuyến dựa trình tự DNA vùng ITS2 Vị trí sai khác 24 32 91 100 102 109 117 119 121 122 145 148 149 160 174 219 234 249 258 259 263 264 276 283 303 309 311 Mẫu AF1 A C T A A G A T T G C T T A C A A A A C T G A A A T C A G AF2 A C T A A G A T T G C T T A C A A A A C G G A A G A C A G A3 A C T A A G A T T G C T T A C A A A A C G G A A G A C A G A4 G T T A A G A T T G C T T A C C A A G T G A A G A A T G C LD1 A C C T G A T G C A T C C G T A G T G T A A T C C T T G G LD2 A C C T G A T G T A T C C G T A G T G T A A T C C T T G T Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 332 416 457 475 476 477 A G A C A C Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x A G C G T C A G C T C C T T A G T A T G A G T C T G A T C T thuộc chi Anoectochilus dựa trình tự DNA vùng gen ITS2 cho thấy vị trí biến đổi cao là 20 vị trí Và hai lồi thuộc chi Lusidia có vị trí khác biệt Điều này cho thấy đặc điểm hình thái tương tự xét di truyền phân tử có khác Kết chứng tỏ sử dụng vùng gen ITS1 ITS2 để đánh giá mối quan hệ di truyền và xác định hai loài Anoectochilus roxburhii, Anoectochilus formosanus Kết phân tích trình tự DNA của vùng ITS1, ITS2 cho thấy có khác biệt giữa hai chi Anoectochilus Lusidia Khi dựa trình tự DNA vùng gen ITS1 để phân tích cho thấy giữa lồi thuộc chi Anoectochilus có hai vị trí khác biệt điều cho thấy việc xác định loài khác thuộc chi gặp nhiều khó khăn dựa trình tự Tuy nhiên, phân tích lồi Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Hình 3: Cây phát sinh loài của mẫu Anoectochilus sp (2), Anoectochilus formosanus (2), Lusidia discolor (2) dựa trình tự vùng gen ITS1, ITS2, ITS1+ITS2 trình tự tham chiếu cơng bớ genbank thuộc chi Anoectochilus chia làm nhánh nhỏ Mẫu A4 KR815828.1 (Anoectochilus roxburhii) nhánh Mẫu A3, loài Anoectochilus formosanus và trình tự tham chiếu genbank thuộc loài này nằm nhánh Từ kết cho thấy mẫu A4 chưa xác định loài thuộc loài Anoectochilus roxburhii và mẫu A3 thuộc loài Anoectochilus formosanus Kết phân tích dựa trình tự DNA vùng ITS1 cho thấy hai chi Anoectochilus Lusidia phân làm nhánh khác Hai loài nghiên cứu thuộc chi Lusidia thu thập từ hai nguồn khác loài thu thập Thành phố Hồ Chí Minh lồi thu thập Quảng Nam có mối quan hệ di truyền gần Khi phân tích lồi Anoectochilus roxburhii, Anoectochilus formosanus 10 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Kết phân tích dựa trình tự DNA vùng ITS2 cho thấy phân nhánh di truyền tương tự vùng ITS1 có phân tách rõ ràng Đối với loài Anoectochilus formosanus (AF) nằm riêng nhánh so với loài này và loài Anoectochilus roxburhii Dựa trình tự nucleotide của loài này so với trình tự loài có vị trí sai khác Dựa phân loại di truyền của vùng ITS2 cho thấy Anoectochilus sp (A4) KR815828.1 (Anoectochilus roxburhii) nằm nhánh; Anoectochilus formosanus, Anoectochilus sp (A3) GQ328777.1 (Anoectochilus formosanus) nằm chung nhóm Khi so sánh với trình tự genbank cho thấy Anoectochilus sp (A3) thuộc loài Anoectochilus formosanus với mức độ tương đồng 100% Điều này cho thấy trình tự DNA vùng ITS2 bước đầu phân xiệt loài nghiên cứu thuộc chi Anoectochilus TÀI LIỆU THAM KHẢO Asahina, H., Shinozaki, J., Masuda, K., Morimitsu, Y., and Satake, M., 2010 "Identification of medicinal Dendrobium species by phylogenetic analyses using matK and rbcL sequences." Journal of Natural Medicines 64(2): 133-138 Cameron, K M., 2006 "A comparison and combination of plastid atpB and rbcL gene sequences for inferring phylogenetic relationships within Orchidaceae." Aliso 22: 447-464 Cameron, K M., Chase, M W., Whitten, W M., Kores, P J., et al., 1999 "A phylogenetic analysis of the Orchidaceae: evidence from rbcL nucleotide sequences." American Journal of Botany 86(2): 208-224 Chen, J.-R and Y.-J Shiau., 2015 "Application of internal transcribed spacers and maturase K markers for identifying Anoectochilus, Lusidia, and Ludochilus." Biologia plantarum 59(3): 485-490 Đỗ Thị Gấm, Hoàng Đăng Hiếu., Phạm Bích Ngọc Chu Hồng Hà., 2017 "Phân tích quan hệ di truyền của số loài lan Việt Nam" Trong: Báo cáo khoa học sinh thái tài nguyên thực vật Hội nghị khoa học toàn quốc sinh thái tài nguyên thực vật lần Hà Nội, ngày 20/10/2017 NXB Khoa học tự nhiên công nghệ Hà nội, trang 133-139 Doyle, J J.,1987 "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue." Phytochem Bull 19: 11-15 Du, X M., Sun, N Y., Hayashi, J., Chen, Y., Sugiura, M., and Shoyama, Y., 2003 "Hepatoprotective and antihyperliposis activities of in vitro cultured Anoectochilus formosanus." Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives 17(1): 30-33 Fang, H L., Wu, J B., Lin, W L., Ho, H Y and Lin, W C., 2008 "Further studies on the hepatoprotective effects of Anoectochilus formosanus." Phytotherapy Research: An International Journal Devoted to Pharmacological and Toxicological Evaluation of Natural Product Derivatives 22(3): 291-296 Freudenstein, J V and M W Chase., 2015 "Phylogenetic relationships in Epidendroideae (Orchidaceae), one of the great flowering plant radiations: progressive specialization and diversification." Annals of botany 115(4): 665681 Kết phân tích dựa kết hợp hai vùng gen ITS1 và ITS2 để phân tích nhằm đánh giá mức độ xác định so với việc đánh giá gen riêng lẻ Kết cho thấy loài Anoectochilus formosanus nằm nhóm và Anoectochilus roxburhii nằm riêng nhánh KẾT LUẬN Kết khảo sát vùng gen ITS1, ITS2, ITS, rbcL, matK, rpoB1, rpoB2, rpoC1, rpoC2 06 mẫu lan thuộc chi Anoectochilus, Lusidia cho tỷ lệ khuếch đại thành công từ 50 - 100% Trong nghiên cứu này đánh giá và chọn lọc vùng gen ITS1, ITS2 thích hợp cho việc phân tích và xác định loài của số loài lan thuộc hai chi Dựa kết khuếch đại của vùng gen DNA barcode, sản phẩm PCR vùng gen ITS1 và gen ITS2 giải trình tự để phân tích mối quan hệ di truyền, xác định loài Kết phân tích trình tự DNA của vùng gen ITS1 ITS2 dùng để định danh hai mẫu chưa xác định loài Dựa kết BLAST genbank phát sinh chủng loài của hai vùng ITS1, ITS2 ITS1+ITS2 cho thấy mẫu A3 thuộc loài Anoectochilus formosanus mẫu A4 thuộc loài Anoectochilus roxburhii Các kết trên, chứng tỏ sử dụng vùng ITS1 và ITS2 để đánh giá mối quan hệ di truyền và xác định số loài thuộc chi Anoectochilus cụ thể là Anoectochilus formosanus Anoectochilus roxburhii LỜI CẢM TẠ Group, C P B., Li, D Z., Gao, L M., et al., 2011 "Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants" Proceedings of the National Academy of Sciences 108(49): 19641-19646 Các tác giả xin chân thành cảm ơn Trung tâm Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ phần kinh phí và sở vật chất để thực nghiên cứu 11 Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Tập 55, Số chuyên đề: Công nghệ Sinh học (2019): x-x Group, C P W., Hollingsworth, P M., Forrest, L L., et al., 2009 "A DNA barcode for land plants." Proceedings of the National Academy of Sciences 106(31): 12794-12797 Kim, H M., Oh, S H., Bhandari, G S., Kim, C S and Park, C W., 2014 "DNA barcoding of Orchidaceae in Korea." Molecular Ecology Resources 14(3): 499-507 Lee, N., 2011 "Illustrated flora of Korean orchids." Seoul (South Korea): Ewha Womans University Press (in Korean) 290-299 Lv, T., Teng, R., Shao, Q., Wang, H., Zhang, W., Li, M., and Zhang, L., 2015 "DNA barcodes for the identification of Anoectochilus roxburghii and its adulterants." Planta 242(5): 1167-1174 Teuscher, H., 1978 "Collector's item: Erythrodes, Goodyera, Haemaria and Macodes, with Anoectochilus." Amer Orchid Soc Bull 47(2): 121-129 Phạm Hoàng Hộ., 2010 Cây cỏ Việt Nam III Nhà xuất Trẻ, Thành phố Hồ Chí Minh, 789 pages Sinclair, E.A., Pérez-Losada, M and Crandall, K.A., 2005 Molecular phylogenetics for conservation biology Phylogeny and conservation Cambridge University Press, Cambridge, UK 19-56 Singh, H.K., Parveen, I., Raghuvanshi, S and Babbar, S.B., 2012 The loci recommended as universal barcodes for plants on the basis of floristic studies may not work with congeneric species as exemplified by DNA barcoding of Dendrobium species BMC research notes (1): 42 Siripiyasing, P., Kaenratana, K., Mokkamul, P., Tanee, T., Sudmoon, R and Chaveerach, A., 2012 DNA barcoding of the Cymbidium species (Orchidaceae) in Thailand African Journal of Agricultural Research 7: 393-404 Srikulnath, K., Sawasdichai, S., Jantapanon, T.K., Pongtongkam, P and Peyachoknagul, S., 2015 Phylogenetic relationship of Dendrobium species in Thailand inferred from chloroplast matK gene and nuclear rDNA ITS region The Horticulture Journal 84: 243-252 Xu, S., Li, D., Li, J., et al., 2015 Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium (Orchidaceae) from mainland Asia PloS one 10 (1) 1-12 12 ... Đăng Giáp, 2019 Nghiên cứu sử dụng số dna barcode phân tích di truyền và nhận di? ??n số loài lan kim tuyến (Anoectochilus spp.) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 55 (Số chuyên đề: Công... Chase, 2015) Hiện nay, số nhóm nghiên cứu sử dụng kỹ thuật DNA barcode để phân tích mối quan hệ di truyền và xác định loài của số loài thuộc chi Anoectochilus, Lusidia (Chen and Shiau, 2015;... quan hệ di dược liệu Do đó, việc sưu tập, đánh giá, định danh truyền giữa số loài lan Kim tuyến định bảo tồn giống lan Kim tuyến nói riêng lan danh từ làm sở cho việc phân tích di truyền dược