Bài viết Phân tích di truyền trước làm tổ bệnh Hemophilia B báo cáo một trường hợp gia đình thực hiện chẩn đoán di truyền trước làm tổ (Preimplantation genetic testing for monogenic disorders, PGT-M) bệnh Hemophilia B (HEMB) sàng lọc thành công phôi không mang bệnh.
HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 Yamsri S, Sanchaisuriya K, Fucharoen G, Sae-Ung N, Fucharoen S Genotype and phenotype characterizations in a large cohort of beta-thalassemia heterozygote with different forms of alpha-thalassemia in northeast Thailand Blood Cells Mol Dis 2011;47(2):120-4 Rund D, Filon D, Strauss N, Rachmilewitz EA, Oppenheim A Mean corpuscular volume of heterozygotes for beta-thalassemia correlates with the severity of mutations Blood 1992;79(1):238-43 Boonyawat B, Monsereenusorn C, Traivaree C Molecular analysis of betaglobin gene mutations among Thai betathalassemia children: results from a single center study Appl Clin Genet 2014;7:253-8 Guvenc B, Canataroglu A, Unsal C, Yildiz SM, Turhan FT, Bozdogan ST, et al betaThalassemia mutations and hemoglobinopathies in Adana, Turkey: results from a single center study Arch Med Sci 2012;8(3):411-4 Amin S, Jalal S, Ali K, Rasool L, Osman T, Ali O, et al Molecular Characterization and Disease-Related Morbidities of betaThalassemia Patients from the Northeastern Part of Iraq Int J Gen Med 2020;13:1453-67 Karim MF, Ismail M, Hasan AM, Shekhar HU Hematological and biochemical status of Beta-thalassemia major patients in Bangladesh: A comparative analysis Int J Hematol Oncol Stem Cell Res 2016;10(1):7-12 10 Kassab-Chekir A, Laradi S, Ferchichi S, Haj Khelil A, Feki M, Amri F, et al Oxidant, antioxidant status and metabolic data in patients with beta-thalassemia Clin Chim Acta 2003;338(1-2):79-86 11 Lynch JR, Brown JM, Best S, Jennings MW, Weatherall DJ Characterization of the breakpoint of a 3.5-kb deletion of the betaglobin gene Genomics 1991;10(2):509-11 PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TRƯỚC LÀM TỔ BỆNH HEMOPHILIA B Đặng Tiến Trường1, Bùi Thu Anh1, Trần Hồng Loan2 TÓM TẮT 23 Mục tiêu: Báo cáo trường hợp gia đình thực chẩn đốn di truyền trước làm tổ (Preimplantation genetic testing for monogenic disorders, PGT-M) bệnh Hemophilia B (HEMB) sàng lọc thành công phôi không mang bệnh Học Viện Quân y Công Ty TNHH KHKT&DV Genome Chịu trách nhiệm chính: Đặng Tiến Trường Email: truongdt@vmmu.edu.vn Ngày nhận bài: 23/7/2022 Ngày phản biện khoa học: 08/08/2022 Ngày duyệt bài: 26/08/2022 172 Đối tượng phương pháp: Gia đình gồm người vợ mang đột biến c.192T>G, người chồng bình thường, gái mang gen đột biến, trai bị bệnh Chúng thiết kết cặp mồi nhận diện gen AMELX bảy cặp mồi nhận diện trình tự lặp lại ngắn (Short tandem repeats, STR) liên kết với gen F9 Chúng tiến hành khuếch đại tồn hệ gen phơi Chẩn đoán PGT-M nghiên cứu thực kỹ thuật phân tích di truyền liên kết gen haplotype giải trình tự Sanger Kết quả: Chúng tiến hành thiết lập sơ đồ liên kết gen (phương pháp gián tiếp) xác TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 định dạng đột biến (phương pháp trực tiếp) Kết từ hai phương pháp đồng Kết phôi ba bốn phôi mang gen đột biến, phôi hai phôi không mang đột biến Riêng phôi thứ nhất, phát hai đỉnh T G giải trình tự Dựa vào kết kết hợp với kết phân tích liên kết gen, kết luận phôi thứ mang dị hợp tử đột biến c.192T>G Kết luận: Chúng xác định thành công phôi mang bệnh phương pháp trực tiếp gián tiếp Quy trình chúng tơi mang giá trị thực tiễn cao tăng độ xác chẩn đốn PGT-M Đồng thời, quy trình áp dụng cho bệnh di truyền khác Từ khóa: Phân tích di truyền trước làm tổ; bệnh máu khó đơng; Hemophilia B; HEMB; STR; PGT SUMMARY PREIMPLANTATION GENETIC TESTING ON HEMOPHILIA B Objectives: Here we report the case of successfully performing PGT-M in a HEMB patient with single point mutation Materials methods: There was a family with the mother with c.192T>G mutation, the father with no mutation, the first daughter carrying the mutation, and the second son with HEMB disease Four blastocysts were biopsied We designed one primer targeted at AMELX gene and seven primers targeted at STRs of F9 gene Whole-genome amplification of blastocysts was performed successfully Haplotypes as markers for linkage analysis were established Sanger sequencing assay was performed to determine single point mutations Results: We performed PGT-M by establishing a pedigree with genetic linkage analysis and determining the single point mutation (c.192T>G) in the F9 gene that leads to HEMB The results from the two methods were similar The results indicated that the third and fourth blastocysts carry the mutation, the second blastocyst has no mutation In the result of Sanger sequencing assay of the first blastocyst, two peaks of T and G occurred at the point of mutation Based on both two results, we concluded that the first blastocyst carries the mutation Conclusion: We successfully determined the blastocyst that carries the mutation Our study suggests that our protocol is able to improve the accuracy of PGT-M test and can be used in PGTM of various diseases Keywords: Hemophilia B; HEMB; STR; PGT I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Hemophilia B (HEMB) hay gọi bệnh máu khó đơng B bệnh di truyền gặp liên quan đến q trình đơng máu Bệnh nhân HEMB thiếu hụt yếu tố đông máu IX khiến trình đơng máu khơng thể xảy ra, gây máu dẫn đến tử vong Bệnh HEMB kết đột biến gen F9 nhiễm sắc thể X Trên toàn giới, tỷ lệ trẻ nam sinh bị mắc bệnh HEMB 30000 Nghiên cứu có 3000 đột biến gen F9 dẫn đến bệnh HEMB[4], [9] Hiện nay, có giải pháp tình đưa yếu tố đơng máu từ bên ngồi vào thể trường hợp bệnh nhân bị thương cầm máu[7], [8] Do vậy, gia đình có tiền sử bị bệnh việc dự phịng để sinh hệ sau không mang gen bệnh quan trọng Xét nghiệm rối loạn di truyền đơn gen trước chuyển phôi (Preimplantation genetic testing for monogenic disorders, PGT-M) công cụ vô hiệu bệnh nhân có nguy cao truyền lại bất 173 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 thường gen cho hệ Mục đích xét nghiệm nhận diện đặc điểm di truyền bất thường mẫu phôi, cho phép lựa chọn chuyển phôi không mang gen bệnh Do vậy, PGT-M giảm đồng thời trường hợp đình thai nguy mắc bệnh di truyền cho hệ sau[3] Tuy nhiên, xét nghiệm tiềm tàng nhiều nguy dẫn đến sai lệch kết Một nguy thường xuyên xuất tượng alen (Allel Dropout, ADO) ngoại nhiễm Việc xây dựng quy trình xét nghiệm để kiểm sốt ADO ngoại nhiễm DNA vơ quan trọng[1] Mặt khác, khơng có mẫu số chung cho tất đột biến thách thức lĩnh vực PGT-M Do vậy, để đưa chẩn đốn xác, thiết kế thí nghiệm cần cá nhân hóa tùy chỉnh để phù hợp tới gen khác nhau[2] Hiện nay, kỹ thuật sử dụng rộng rãi phân tích trình tự lặp ngắn (Short tandem repeat, STR) STR trình tự ngắn từ đến 6bp, lặp lại nhiều lần (10 đến 60) xuất phổ biến hệ gen người STR có đặc điểm tính đa hình cao liên kết chặt chẽ với gen đích, vậy, dấu hiệu quan trọng sử dụng chẩn đoán bệnh lý di truyền Tại số trung tâm di truyền Việt Nam, PGT-M thực vài năm trở lại Tuy nhiên, chưa xây đựng quy chuẩn để kiểm soát kết chẩn đoán PGT-M Bài báo báo cáo trường hợp gia đình thực PGT-M bệnh HEMB thành công sử dụng phương pháp trực tiếp gián tiếp II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu 174 Gia đình gồm người vợ mang đột biến c.192T>G, p.Cys64Trp exon hai gen F9 nhiễm sắc thể X, người chồng không mang đột biến Cặp vợ chồng có hai người gái mang gen đột biến, trai bị bệnh Hai vợ chồng tham gia thực IVF thu bốn phôi ngày năm Bộ marker STR phục vụ chẩn đốn PGT-M thiết lập thành cơng gia đình tiến hành chẩn đốn mẫu sinh thiết từ phôi thu 2.2 Phương pháp nghiên cứu Thiết kế thị STR cho gia đình nghiên cứu Chúng tơi tiến hành tách ADN từ 200µL mẫu máu bố mẹ trai QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) Kĩ thuật giải trình tự Sanger sử dụng để xác định trực tiếp đột biến thành viên gia đình Bộ thị gồm tám STRs STR liên kết với với gen AMELX (một gen đơn nằm nhiễm sắc thể X Y), bảy STR có số đa hình cao liên kết với gen F9 nhiễm sắc thể X khảo sát mẫu máu gia đình phương pháp Multiplex PCR điện di mao quản Phản ứng PCR để khuếch đại đoạn lặp ngắn thực ống PCR tổng thể tích 50 µL bao gồm 1X QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, 50-100 ng DNA, 0.01-0.4 µM mồi Chu trình nhiệt thực máy PCR ProFlex 3x320-wells (Applied Biosystems), gồm bước hoạt hóa enzyme ban đầu 950C 15 phút, 32 chu kỳ gồm biến tính 940C 30 giây, gắn mồi 600C 90 giây, kéo dài 720C phút, gia tăng thêm giây sau chu kỳ kéo dài cuối 600C 30 phút Sau tiếp tục PCR vịng hai để gắn màu huỳnh quang, thể tích 20 µL bao gồm 1X TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 QIAGEN Multiplex PCR Master Mix, µL sản phẩm PCR vịng 1, 0.2 µM mồi gắn huỳnh quang HEX, FAM, NED Điều kiện thực PCR tương tự quy trình Khảo sát mẫu sinh thiết phôi Phôi ngày năm sinh thiết tiến hành khuếch đại toàn hệ gen (WGA), sau sản phẩm sau WGA tiến hành theo bước Multiplex PCR, điện di mao quản giải trình tự Sanger để xác định tình trạng phôi III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xác định haplotype mẫu gia đình mẫu sinh thiết phôi Bệnh HEMB bệnh liên quan đến rối loạn di truyền lặn nhiễm sắc thể X Do vậy, bước đầu tiên, đặt mục tiêu xác định haplotype liên kết với nhiễm sắc thể giới tính mẫu gia đình Trong nghiên cứu này, sử dụng tám cặp mồi Một cặp mồi khuếch đại gen AMELX, gen đơn nằm vùng Xp22.1-Xp22.3 nhiễm sắc thể X vùng Yp11.2 nhiễm sắc thể Y Bảy cặp mồi lại liên kết đến gen F9 nhiễm sắc thể giới tính X[10] Kết phân tích haplotype gia đình trình bày hình Bộ haplotype thành viên gia đình xắp xếp thành cột, đánh dấu màu màu sắc Bộ haplotype mẹ cột màu da cam màu trắng Bộ haplotype bố cột màu xanh dương xanh Vì cột màu xanh thể kết khuếch đại cặp mồi AMEL, kết luận cột màu xanh haplotype liên kết với nhiễm sắc thể Y Cột màu dương haplotype liên kết với nhiễm sắc thể X Bộ haplotype người gái màu da cam màu xanh dương Trong cột màu da cam di truyền từ người mẹ, cột màu xanh dương di truyền từ người bố Như đề cập phần phương pháp nghiên cứu, người gái mang gen bệnh HEMB liên kết với nhiễm sắc thể X di truyền từ người mẹ, kết luận cột màu da cam haplotype chứa gen đột biến Kết luận xác nhận lại lần thông qua haplotype người trai Bộ haplotype trai bị bệnh cột màu da cam màu xanh Cột màu xanh haplotype liên kết với nhiễm sắc thể Y di truyền từ người bố Cột màu da cam haplotype liên kết với nhiễm sắc thể X chứa gen mang bệnh nguyên nhân gây bệnh cho người trai Bước thứ hai tiến hành xác định haplotype mẫu sinh thiết phơi (Hình 1) Kết phân tích gen cho thấy phôi một, ba bốn mang haplotype liên kết gen mang bệnh nhiễm sắc thể X (cột màu cam), vậy, kết luận phôi một, ba, bốn phôi mang bệnh Hơn nữa, phôi ba phôi bốn mang haplotype liên kết với nhiễm sắc thể Y (cột màu xanh cây), kết luận phôi ba bốn phôi nam mang bệnh Phôi nhận haplotype liên kết nhiễm sắc thể X từ người bố phôi phôi nữ mang bệnh Phôi hai nhận haplotype không liên kết với gen mang bệnh nhiễm sắc thể X (cột màu trắng), vậy, kết luận phôi hai phôi không mang bệnh Đồng thời, xác định phôi thứ hai phơi nữ phơi thứ hai di truyền haplotype liên kết với nhiễm sắc thể X từ bố 175 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 3.2 Xác định đột biến mẫu gia đình sinh thiết phơi 176 TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 518 - THÁNG - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2022 Chúng tiến hành phân tích xác định đột biến kỹ thuật giải trình trực tiếp Sanger (Hình 2) Kết cho thấy phơi số hai có một đỉnh đồng hợp T Điều này, phôi hai không mang gen đột biến Phôi ba bốn có đỉnh đồng G, phôi ba bốn mang đỉnh đột biến c.192T>G Kết phù hợp với kết phân tích di truyền liên kết gen Khác với phơi cịn lại, phơi một, kết giải trình tự Sanger cho thấy xuất đồng thời hai đỉnh T G điểm đột biến, chưa thể kết luận tình trạng phơi Vì STR sử dụng có tính đa hình cao, liên kết chặt chẽ với gen F9 vùng trước vùng sau, sử dụng kết phân tích di truyền liên kết gen phơi để đưa kết luận tình trạng phơi Kết phân tích di truyền liên kết gen phơi phôi mang nhiễm sắc thể X chứa gen đột biến Vì vậy, phơi kết luận phôi mang bệnh IV BÀN LUẬN Bệnh máu khó đơng (Hemophilia B, HEMB) bệnh lí di truyền lặn nhiễm sắc thể giới tính, đột biến gen F9 Bệnh nhân mang đột biến gen F9 thiếu hụt yếu tố đơng máu IX, khiến cho q trình đơng máu khơng thể xảy Người bệnh máu khó đơng xảy tình trạng chảy máu khơng kiểm sốt gây tử vong Hiện nay, chưa có thuốc điều trị tận gốc bệnh Chẩn đoán di truyền trước chuyển phôi (Preimiplantation Genetic Testing – PGT) loại chẩn đoán thường đề xuất để tầm sốt bệnh di truyền gia đình có gen mang bệnh Xét nghiệm cho phép lựa chọn phôi không mang gen bệnh để chuyển vào tử cung người mẹ, giúp họ sinh đứa khỏe mạnh Tối ưu hóa độ xác kĩ thguật xét nghiệm PGT vấn đề vô quan trọng, liên quan trực tiếp đến kết chẩn đoán Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành chẩn đốn PGT-M phương pháp gián tiếp trực tiếp Đối với phương pháp gián tiếp, sử dụng haplotype dấu hiệu phân tích liên kết gen Chúng thiết kế thành công haplotype thị gồm tám STRs có số đa hình cao, phân bố trước sau gen F9 Đồng thời, thị chúng tơi cịn có giá trị việc xác định giới tính phơi Đối với phương pháp trực tiếp, tiến hành phân tích trình tự đột biến kỹ thuật Sanger Chúng phát đột biến c.192T>G gen F9 mẫu người mẹ; đột biến gây bệnh Chẩn đốn di truyền trước chuyển phơi lĩnh vực khó tiếp cận nhiều nguyên nhân Trong đó, nguyên nhân cốt lõi số lượng mẫu (một vài tế bào ngoại bì nuôi phôi) thực lần không đánh giá ổn định kết Hệ gen mẫu phôi sinh thiết nhân lên kĩ thuật khuếch đại toàn hệ gen (Whole genome amplification - WGA) giải pháp vấn đề Tuy nhiên, thực chẩn đoán di truyền mẫu WGA, tượng ADO 177 HỘI NGHỊ KHOA HỌC HÌNH THÁI HỌC TỒN QUỐC LẦN THỨ XVIII NĂM 2022 ngoại nhiễm dẫn tới kết sai lên đến 30%[5], [6] Theo Hiệp hội hỗ trợ sinh sản sản phôi học Châu Âu (ESHRE), để tăng độ xác chẩn đốn di truyền trước phối cần thực đồng thời chẩn đoán trực tiếp gián tiếp[5] Quy trình chúng tơi đề xuất dựa theo khuyến cáo hiệp hội sinh sản phơi học châu Âu bao gồm chẩn đốn trực tiếp phương pháp giải trình tự Sanger chẩn đốn gián tiếp phương pháp phân tích liên kết gen dựa haplotype Trong nghiên cứu chúng tơi, kết chẩn đốn mẫu phơi hai phương pháp trùng khớp Kết củng cố vai trò việc sử dụng đồng thời hai phương pháp việc chẩn đoán di truyền trước phôi V KẾT LUẬN Chúng thực thành cơng chẩn đốn trước chuyển phơi cho phơi gia đình có tiền sử bị bệnh HEMB, sàng lọc phơi khơng mang gen bệnh Quy trình chúng tơi áp dụng đột biến điểm khác gen F9 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Blais J et al (2015), "Risk of Misdiagnosis Due to Allele Dropout and False-Positive PCR Artifacts in Molecular Diagnostics: Analysis of 30,769 Genotypes", J Mol Diagn 17 (5), pp 505-514 178 [2] Chen M et al (2016), "Preimplantation genetic diagnosis of hemophilia A", Thromb J 14 (Suppl 1), pp 33 [3] De Rycke M et al (2020), "Preimplantation Genetic Testing for Monogenic Disorders", Genes (Basel) 11 (8) [4] Goodeve A C (2015), "Hemophilia B: molecular pathogenesis and mutation analysis", J Thromb Haemost 13 (7), pp 1184-1195 [5] Group E P.-M W et al (2020), "ESHRE PGT Consortium good practice recommendations for the detection of monogenic disorders", Hum Reprod Open 2020 (3), pp hoaa018 [6] Harton G L et al (2011), "ESHRE PGD consortium best practice guidelines for fluorescence in situ hybridization-based PGD", Hum Reprod 26 (1), pp 25-32 [7] Horava S D et al (2017), "Recent advances in hemophilia B therapy", Drug Deliv Transl Res (3), pp 359-371 [8] Leebeek F W G et al (2021), "Gene therapy for hemophilia: a review on clinical benefit, limitations, and remaining issues", Blood 138 (11), pp 923-931 [9] Rallapalli P M et al (2013), "An interactive mutation database for human coagulation factor IX provides novel insights into the phenotypes and genetics of hemophilia B", J Thromb Haemost 11 (7), pp 1329-1340 [10] Tozzo P et al (2013), "Deletion of amelogenin Y-locus in forensics: literature revision and description of a novel method for sex confirmation", J Forensic Leg Med 20 (5), pp 387-391 ... áp dụng cho b? ??nh di truyền khác Từ khóa: Phân tích di truyền trước làm tổ; b? ??nh máu khó đơng; Hemophilia B; HEMB; STR; PGT SUMMARY PREIMPLANTATION GENETIC TESTING ON HEMOPHILIA B Objectives: Here... phơi Kết phân tích di truyền liên kết gen phơi phôi mang nhiễm sắc thể X chứa gen đột biến Vì vậy, phơi kết luận phôi mang b? ??nh IV B? ?N LUẬN B? ??nh máu khó đơng (Hemophilia B, HEMB) b? ??nh lí di truyền. .. Keywords: Hemophilia B; HEMB; STR; PGT I ĐẶT VẤN ĐỀ B? ??nh Hemophilia B (HEMB) hay gọi b? ??nh máu khó đơng B b? ??nh di truyền gặp liên quan đến q trình đơng máu B? ??nh nhân HEMB thiếu hụt yếu tố đông máu