Bài viết trình bày kết quả phân tích di truyền tế bào và di truyền tế bào phân tử để xác định nguồn gốc thể nhiễm sắc của cây lai tự nhiên giữa các loài trong chi khoai môn Colocasia (Araceae). Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm chi tiết nội dung nghiên cứu.
26(3): 43-47 9-2004 Tạp chí Sinh học Phân tích di truyền tế bào di truyền tế bào phân tử để Xác định nguồn gốc thể nhiễm sắc lai tự nhiên loài chi khoai môn Colocasia (Araceae) Nguyễn Xuân Viết Trờng đại học S phạm Hà Nội Hiện tợng lai tự nhiên loài khoai môn loài dọc mùng chi Khoai môn Colocasia đ đợc phát dựa nghiên cứu biến dị điện di isôzym [5] Tuy nhiên, nguồn gốc thể nhiễm sắc (TNS) tế bào lai cha đợc xác định Lai chỗ gien nhân (genomic in situ hybridization, GISH) kỹ thuật xác định vị trí TNS trình tự ADN bổ sung với trình tự mẫu dò ADN đ đợc đánh dấu Kỹ thuật GISH đ đợc ứng dụng thành công nhiều nghiên cứu để xác định nguồn gốc TNS lai khác loài, kiểm tra nguồn gốc thể nhị bội tự nhiên kiểm tra xuất biến dị genôm v.v [1, 4, 10] Trong báo này, báo cáo kết phân tích di truyền tế bào di truyền tế bào phân tử giúp xác định nguồn gốc TNS lai tự nhiên khác loài chi Colocasia Các lai tự nhiên đ đợc phát qua nghiên cứu biến dị điện di isôzym đ công bố báo trớc [5] I phơng pháp nghiên cứu Vật liệu Cây khoai môn Colocasia esculenta (L.) Schott dọc mùng Colocasia gigantea (Bl.) Hook f thuộc chi Khoai môn (Colocasia), họ Ráy (Araceae) đ đợc dùng để chiết tách ADN tổng số Lai chỗ ADN gien đợc tiến hành tiêu TNS làm từ đỉnh rễ C81126 C81114-những đợc giả định lai tự nhiên khoai môn dọc mùng chúng mang đặc trng phổ điện di isôzym khoai môn dọc mùng [5] Phơng pháp Quan sát hình thái đếm số lợng TNS kỳ tế bào đỉnh rễ tiến hành nh mô tả báo cáo trớc [3] Quan sát TNS giảm phân đợc tiến hành tế bào mẹ hạt phấn lấy từ hoa non đợc nhuộm 2% oxêin axêtic phút Độ hữu thụ hạt phấn đ đợc tính toán dựa tiêu nhuộm hạt phấn cacmin axêtíc Hạt phấn hữu thụ có dạng hình cầu nhuộm màu đỏ đậm Tiêu TNS sử dụng để tiến hành lai ADN đợc chuẩn bị theo phơng pháp tiêu kính phết Rễ cố định sau đ ngâm rửa khoảng 10 phút nớc cất đợc thủy phân ủ dung dịch enzym (2% (w/v) xenlulaza (Onozuka R-10) 2% (w/v) pectinaza (Sigma) hoà tan đệm 0,1 M natri xitrat, pH 4,9) khoảng nhiệt độ 37oC Loại bỏ vách tế bào ly tâm rửa dung dịch cố định (3 cồn : axêtic) Dịch huyền phù tế bào đợc nhỏ lên lam kính làm khô tự nhiên Các tiêu đợc giữ tủ -20oC tiến hành lai ADN tổng số khoai môn dọc mùng đợc chiết tách từ tơi đệm CTAB [9] có thay đổi nhỏ Mẫu dò ADN đợc đánh dấu digoxigenin-high prime (DIG-High Prime) Phát ADN đánh dấu DIG anti-digoxigenin-AP GISH đ đợc tiến hành theo Murata (1992) [3] có cải tiến Xử lý tiêu TNS ì SSC chứa 100 àg/ml RNaza 37oC Rửa tiêu lần x SSC nhiệt độ phòng Khử nớc ngâm lần lợt qua dung dịch cồn (700, 850, 99,50) phút loại Hỗn hợp dung dịch lai chøa 43 50%(v/v) phãcmamit, 10% (v/v) dextran sunfat, ì SSC, 20 ng/àl ADN khoai môn dọc mùng đ đánh dấu digoxigenin 400 ng/àl ADN không đánh dấu dọc mùng khoai môn 30 àl hỗn hợp dung dịch lai đ đợc nhỏ lên tiêu TNS, đậy lamen gắn kín keo Tiêu sau đợc đặt đĩa nóng 92~94oC phút để làm biến tính ADN ủ tiêu hộp giữ ẩm 37oC 16~18 giê ®Ĩ thùc hiƯn lai ADN-ADN Gì bá lamen ì SSC rửa tiêu dung dịch x SSC 50% phócmamit 37oC 10 phút, ì SSC 37oC 10 phút lần ì SSC nhiệt độ phòng ADN đánh dấu DIG đợc phát ủ tiêu anti-digoxigenin-AP hộp giữ ẩm 37oC Rửa tiêu lần (5 phút/lần) dung dịch ì SSC/0,05% Tween 20 nhiệt độ phòng Các vị trí lai với mẫu dò đánh dấu DIG đợc phát sau ủ tiêu dung dịch chứa NBT/X-phốtphát 37oC TNS đợc nhuộm phụ 4',6 diamidino2-phenyliodol (DAPI, 2àg/ml) Các TNS nhuộm DAPI NBT/X-phốtphát đợc chụp ảnh phim 400 ASA/ISO (Fuji super HG) d−íi kÝnh hiĨn vi quang häc vµ kÝnh hiển vi huỳnh quang có kính lọc UV Các nghiên cứu đợc tiến hành phòng Di truyền tế bào chọn giống thực vật, khoa Nông nghiệp, trờng đại học Tổng hợp Okayama, Nhật Bản II Kết thảo luận Các C81126 C81114 đợc giả định lai tự nhiên loài khoai môn C esculenta loài dọc mùng C gigantea dựa kết phân tích điện di isôzym [5] Về hình thái, lai có thân giống với môn khác đ sử dụng nghiên cứu biến dị isôzym [4], hình 1A Số lợng TNS hai loài khoai môn dọc mùng đ đợc báo cáo nhiều công trình [ 2, 7] Theo báo cáo hai loài có dạng bội TNS 2n = 28 42 TNS Trong nghiên cứu này, số lợng TNS đ dùng làm vật liệu nghiên cứu có số 44 lợng TNS 2n = 28 (hình 1C, 1D 1E) Phân tích kiểu nhân cho thấy TNS nhân tế bào khoai môn có kích thớc lớn TNS dọc mùng Chiều dài TNS nằm khoảng 1,92 àm~3,75 àm khoai môn 1,72 àm~3,27 àm dọc mùng Cả hai loài có cặp TNS kèm, nhng cặp TNS khoai môn cặp TNS có tâm lệch dọc mùng cặp NST có tâm lệch mút (r > 3,0, hình 2) Cặp thể kèm nhân tế bào khoai môn lớn nhiều so với thể kèm dọc mùng (hình 1C 1D) Mặc dầu, vật liệu để phân tích kiểu nhân khoai môn dọc mùng bố mẹ đ trực tiếp tạo lai C81126 C81114, chúng đợc lấy ngẫu nhiên đợc thu thập Nêpan, nhng kích thớc cặp thể kèm nhân tế bào lai (hình 1E) cho thấy thể kèm có kích thớc lớn, thể kèm lại có kích thớc bé Chiều dài TNS nằm khoảng 1,75~3,82 àm Kết quan sát phán đoán nguồn gốc khác TNS tế bào lai Vì số tế bào mẹ hạt phấn đợc quan sát TNS giảm phân nghiên cứu (chỉ tế bào) để rút kÕt ln cã ý nghÜa vỊ sè cỈp TNS tơng đồng tế bào lai, nhng quan sát tế bào cho thấy có từ 1-3 cặp lỡng trị (bivalent), số lại đơn trị Sự bất bình thờng giảm phân có lẽ đ nguyên nhân đa đến bất thụ hầu hết tế bào hạt phấn Tỷ lệ hạt phấn hữu thụ lai C81126 vào khoảng % (hình 1B) Lai ADN: ADN tổng số khoai môn dọc mùng đ chiết tách từ tơi cho thấy đủ để tiến hành lai Đánh dấu DIG tạo mẫu dò đợc tiến hành ADN loài Một thử nghiệm kiểm tra hiệu đánh dấu DIG xác định điều kiện lai đợc tiến hành loài Các mẫu dò loài đ đợc lai tiêu TNS loài TNS tế bào dọc mùng đ đợc lai mẫu dò ADN gien dọc mùng đánh dấu DIG (hình 1F) Kết quan sát cho thấy 28 TNS tế bào xảy tợng lai Từ kết đó, cho phép phán đoán ADN đánh dấu điều kiện quy trình phù hợp để tiến hành lai kiểm tra nguồn gốc TNS lai Hình A) Cây lai (C81126), B) H¹t phÊn cđa C81126, C) TNS cđa C esculenta víi cỈp thĨ kÌm lín, D) TNS cđa C gigantea víi cỈp thĨ kÌm bÐ, E) TNS cđa C81126 víi mét thĨ kÌm lín vµ mét thĨ kÌm bÐ, F) TNS cđa C gigantea lai víi mÉu dò ADN đợc đánh dấu DIG, G H: TNS C81126 đợc lai với ADN C.gigantea đánh dấu DIG (G: 14 TNS lai quan sát thấy dới kính hiển vi quang học H: TNS không lai quan sát thấy dới kính hiển vi hnh quang) DÊu : thĨ kÌm cã ngn gèc tõ C esculenta : thĨ kÌm cã ngn gèc tõ C gigantea : TNS không lai với ADN đánh dấu DIG 45 T û lƯ c ¸ n h C e sc u l e n ta C gi ga n te a 1 10 1 CỈp C Ỉ p N ST Hình Tỷ lệ cánh TNS kiểu nhân C esculenta C gigantea Hỗn hợp dung dịch lai chứa 20 ng/àl ADN dọc mùng đánh dấu DIG ADN khoai môn không đánh dấu (tỷ lệ 1:20) đ đợc lai tiêu TNS C81126 Kết quan sát cho thấy 14 TNS nhuộm màu xanh đậm TNS khác nhuộm màu nhạt (hình 1G) Khi tiêu đợc quan s¸t d−íi kÝnh hiĨn vi hnh quang, c¸c TNS vốn không nhìn thấy dới kính hiển vi quang học ® cã thĨ quan s¸t thÊy d−íi kÝnh hiĨn vi huúnh quang Trong 14 TNS nhuém mµu huúnh quang, cã TNS phát quang rõ (hình 1H) Kết cho thấy 14 TNS bắt màu đậm nhìn thấy d−íi kÝnh hiĨn vi quang häc lµ NST cã ngn gèc tõ däc mïng mang tr×nh tù bỉ sung víi ADN dọc mùng đánh dấu DIG Các TNS nhìn thÊy d−íi kÝnh hiĨn vi hnh quang cã ngn gèc từ khoai môn không mang trình tự bổ sung với ADN mÉu dß cđa däc mïng Trong mét phÐp lai tiến hành tiêu khác, hỗn hợp ADN mẫu dò ADN khoai môn đánh dấu DIG với ADN không đánh dấu dọc mùng (1:20) đ cho kết tơng tự Các TNS nhuộm màu xanh đậm cho thấy tợng lai đ xảy TNS xảy lai mang trình tự bổ sung với mẫu dò ADN khoai môn đánh dấu DIG TNS không lai quan sát thấy dới kính hiển vi huỳnh quang Prana (1984), Okada Hambali (1989) đ báo cáo tần số hình thành cặp TNS giảm phân lai khoai môn dọc mùng họ tạo Theo báo cáo Okada 46 Hambali (1989) số cặp lỡng trị hình thành giảm phân tế bào mẹ hạt phấn từ 0~3, số đơn trị từ 21~28, đồng thời ghi nhËn vỊ sù hiƯn diƯn cđa mét cỈp thĨ kèm có kích thớc không nh tế bào lai [6, 8] Kết quan sát nghiên cứu trùng hợp với nhận xét Kết lai ADN cho thấy ADN tổng số từ loài bố mẹ đánh dấu DIG đợc dùng nh mẫu dò cho lai chỗ để phân biệt TNS đặc trng loài tế bào lai 14 số 28 TNS quan sát thấy tiêu tế bào đỉnh rễ đợc lai với ADN khoai môn ADN dọc mùng đánh dấu DIG cho phép khẳng định tồn hai đơn bội TNS hai loài tế bào lai C81126, phơng pháp lai chỗ GISH đ phơng pháp hữu hiệu cho phép xác định nguồn gốc TNS lai tự nhiên chi Colocasia Phát hiện tợng lai tự nhiên chi Colocasia dựa nghiên cứu đa hình biến dị điện di isôzym [5] kết phân tích di truyền tế bào di truyền tế bào phân tử cho phép xác định nguồn gốc TNS lai tự nhiên nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng để phân loại cách xác mức dới loài, cải tiến giống khoai môn, nghiên cứu đa dạng giống khoai môn tiến hóa chi Colocasia Lời cảm ơn: Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS.TS Yoshino H., GS TS Tahara M., khoa Nông nghiệp, trờng đại học Tổng hợp Okayama, Nhật Bản đ tạo điều kiện cần thiết hớng dẫn tận tình để công trình đợc hoàn thành Thesis, Okayama University, Japan Nguyễn Xuân ViÕt, 2001: T¹p chÝ Sinh häc, 23(3b): 131-136 Okada H and G Gregori Hambali, 1989: Cytologia, 54: 389-393 Tµi liƯu tham kh¶o Petterson G., 1989: Nord J Bot., 9: 119166 D'Hon A et al., 1996: Mol Gen Genet., 250: 405-413 Prana M S., 1984: Annales Bogorienses, 8(2): 73-76 Hotta M., 1970: Memories of the Faculty of Science, Kyoto University, series of Biology, 9(1): 72-96 Murata M., N Nakata and Y Yasumuro, 1992: Chromosoma, 102: 27-31 Ramser J., 1992: A protocol for oligonucleotide DNA fingerprinting of plant species (personal communication), Plant molecular biology, Frankfurt Univ., Germany Nguyen V X., 1998: Isozyme variation and phylogenetic relationships in taro, Colocasia esculenta (L.) Schott and related taxa Ph.D 10 Yoshino H., 1994: Studies on phylogenetic differentiation in taro, Colocasia esculenta (L.) Schott Doctor thesis The Kyoto University, Japan Identification of the parental origin of the chromosomes in the natural interspecific hybrids in Colocasia using cytogenetic and molecular cytogenetic techniques Nguyen Xuan Viet Summary Two species of the genus Colocasia, C esculenta and C gigantea, can be hybridized, but data on the extent of the hybridization under natural conditions are not available to date In the previous paper, we have reported the investigation of the natural interspecific hybrids in the genus Colocasia using isozymes [5] The present study was carried out to identify the parental origin of the chromosomes in the natural hybrids in Colocasia, using the cytogenetic and molecular cytogenetic techniques (GISH) The cytogenetic analysis showed those natural interspecific hybrids having 28 chromosomes The chromosome size ranged from 1.72~3.75 µm and one satellite pair with different size These mitotic chromosome characters were consisted in the karyotypic characters of both C esculenta and C gigantea The multiunivalent observed in pollen mother cells of the hybrids and their pollen fertilizer was too small indicated an abnormal in meiosis and suggested different chromosome origins in the hybrid cells The GISH using the DIG-labeled total DNA of one species as a probe and the non-labeled DNA of the other species as a blocking DNA confirmed the origin of the chromosomes in the hybrids The investigation of the natural hybrids and the identification of the parental origin of the chromosomes in these hybrids in our studies could provide useful information for the classification of taro varieties and the research of their phylogenetic relationships Ngµy nhËn bµi: 20-9-2002 47 ... nhiên chi Colocasia Phát hiện tợng lai tự nhiên chi Colocasia dựa nghiên cứu đa hình biến dị điện di isôzym [5] kết phân tích di truyền tế bào di truyền tế bào phân tử cho phép xác định nguồn gốc. .. ADN khoai môn ADN dọc mùng đánh dấu DIG cho phép khẳng định tồn hai đơn bội TNS hai loài tế bào lai C81126, phơng pháp lai chỗ GISH đ phơng pháp hữu hiệu cho phép xác định nguồn gốc TNS lai tự nhiên. .. định nguồn gốc TNS lai tự nhiên nghiên cứu có ý nghĩa quan trọng để phân loại cách xác mức dới loài, cải tiến giống khoai môn, nghiên cứu đa dạng giống khoai môn tiến hóa chi Colocasia Lời cảm