Đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen lúa nếp thơm và kháng bệnh bạc lá bằng chỉ thị SSR

Hiện nay ở Việt Nam, lúa nếp chưa có nhiều có giống mới, chủ yếu là các giống lúa truyền thống. Các giống này có chất lượng tốt nhưng năng suất thường thấp, cây cao dễ đổ, thời gian sinh trưởng dài, dễ bị nhiễm bệnh. Các giống lúa nếp cải tiến có năng suất cao, chống chịu sâu bệnh nhưng chất lượng lại kém. Nguồn gen lúa nếp địa phương rất phong phú, có nhiều đặc điểm quý, có giá trị sử dụng cao là vật liệu cho công tác chọn tạo giống. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành khảo sát đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính trên 50 mẫu giống lúa nếp, chọn ra giống lúa nếp thấp cây, cảm ôn, thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, chất lượng tốt, có mùi thơm, có chứa các gen thơm, gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng chỉ thị phân tử. Kết quả chúng tôi thấy có 8 mẫu giống có mùi thơm trên hạt gạo. Có 43 giống mang gen kháng Xa7, 13 giống mang gen Xa4, trong đó có 8 giống mang cả hai gen kháng Xa4 và Xa7 Qua việc xác định quan hệ di truyền của các giống lúa nếp và kết hợp với các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh bạc lá, mùi thơm chúng tôi chọn được 5 mẫu giống tương đối tốt, vừa có khả năng kháng bệnh vừa có tiềm năng cho năng suất cao, chất lượng tốt là: Nếp Gà Gáy, 1013232, 10861, 10912, 10923.

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng: Đây là công trình nghiên cứu khoa học do tôi thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Phan Hữu Tôn. Số liệu và kết quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là khách quan, trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một công trình nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Xuân Trường i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô trong khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận tình truyền đạt kiến thức trong bốn năm học tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Phan Hữu Tôn-Trưởng bộ môn SHPT & CNSH Ứng dụng -khoa Công nghệ sinh học- trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, đã tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện để em hoàn thành đề tài này. Em xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình, hướng dẫn chỉ bảo của Ths. Nguyễn Văn Hùng, cùng các anh chị làm việc tại Trung tâm bảo tồn và Phát triển nguồn gen cây trồng đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để em hoàn thành quá trình thực tập này. Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những người luôn bên cạnh động viên, quan tâm giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài này. Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ kĩ năng của bản thân còn nhiều hạn chế nên bài báo cáo không tránh khỏi những thiếu sót. Em kính mong nhận được sự góp ý, nhận xét từ phía quý thầy, cô để kiến thức của em được hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Xuân Trường ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU viii TÓM TẮT ix PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 1.1.Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2 1.2.1. Mục đích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Tổng quan chung về bệnh bạc lá 3 2.1.1.Nguyên nhân gây bệnh 3 2.1.2. Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa 3 2.1.3. Đặc điểm phát sinh phát triển của bệnh và biện pháp phòng trừ 4 2.2. Tình hình nghiên cứu chọn tạo lúa nếp trong nước 5 2.3. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa nếp kháng bệnh bạc lá 7 2.4. Nghiên cứu tính trạng mùi thơm 9 2.5. Các phương pháp đánh giá quan hệ di truyền giữa các mẫu giống 10 2.5.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị 10 2.5.2. Chỉ thị hình thái 11 2.5.3. Chỉ thị isozyme 11 2.5.4. Chỉ thị phân tử - chỉ thị DNA( Phan Hữu Tôn, 2005) 11 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1. Vật liệu nghiên cứu 14 iii 3.2. Phương pháp nghiên cứu 15 3.2.1. Bố trí thí nghiệm đồng ruộng 15 3.2.2. Kỹ thuật trồng và chăm sóc 15 3.2.3. Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản 16 3.2.4. Phương pháp đánh giá mùi thơm 17 3.2.5. Phương pháp đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo 17 3.3.Phương pháp xác định gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng chỉ thị phân tử 17 3.3.1. Phương pháp tách chiết DNA 17 3.3.2. Kiểm tra khả năng mang gen kháng Xa4, Xa7 bằng PCR 18 3.4. Phương pháp xử lý số liệu 19 PHẦN IV.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 20 4.1. Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học 20 4.1.1. Một số chỉ tiêu sinh trưởng 20 4.1.2. Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 23 4.1.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 25 4.1.4. Kết quả đánh giá mùi thơm 28 4.2. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 30 4.2.1. Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo 30 4.2.2. Kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng PCR 33 4.2.3. So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 35 4.3. Đánh giá đa dạng di truyền bằng các chỉ thị phân tử SSR 37 4.3.1. Phân tích đa hình DNA của 25 giống lúa nếp bằng kỹ thuật PCR 37 4.3.2. Mối quan hệ di truyền của 25 giống lúa nếp 41 PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 5.1. Kết luận 46 5.2. Đề nghị 46 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các mẫu giống lúa làm vật liệu đánh giá 14 Bảng 3.2. Thành phần dung dịch chiết tách 18 Bảng 3.3. Thành phần dung dịch TE 18 Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR của gen Xa4 và Xa7 19 Bảng 3.5. Danh sách các cặp mồi và nhiệt độ gắn mồi của các cặp mồi sử dụng 19 Bảng 4.1. Thời gian sinh trưởng, độ dài giai đoạn trỗ, chiều cao cây 20 Bảng 4.2. Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ nhánh hữu hiệu 23 Bảng 4.3. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 25 Bảng 4.4. Kết quả đánh giá mùi thơm 29 Bảng 4.5. Kết quả lây nhiễm nhân tạo với các dòng nhiễm chuẩn 30 Bảng 4.6. So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm nhân tạo của các mẫu giống 35 Bảng 4.7. Danh sách 25 mẫu giống tiến hành đánh giá đa dạng di truyền 37 Bảng 4.8. Hệ số tương đồng di truyền của 25 giống lúa nếp 42 vi DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Đánh giá mùi thơm trên lá 29 Hình 4.2. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24 31 32 Hình 4.3. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4 32 32 Hình 4.4. Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 32 Hình 4.5. Kết quả điện di đồ gen Xa4 với cặp mồi MP2 33 Hình 4.6. Kết quả điện di đồ gen Xa7 với cặp mồi P3 34 Hình 4.7. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-154 39 Hình 4.8. Kết quả điện di đồ PCR của mồi RM-536 40 Hình 4.9. Biểu đồ hình cây của 25 giống lúa nếp tính hệ số di truyền theo Dice 44 và kiểu phân nhóm UPGMA 44 vii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU AFLP Amplified Fragment Lenght Polymorphism RAPD Random amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment length polymorphism SSR Simple Sequence Repeat DNA Acid Deoxyribo Nucleic PCR – based marker Polymerase Chain Reaction– based marker ALP Amplicon length polymorphism DAF DNA amplification fingerpringting SSCP Single strand conformation polymorphism AP-PCR Arbitrary Primer – PCR NST Nhiễm sắc thể NSLT Năng suất lý thuyết CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic STT Số thứ tự KH Ký hiệu TGST Thời gian sinh trưởng viii TÓM TẮT Hiện nay ở Việt Nam, lúa nếp chưa có nhiều có giống mới, chủ yếu là các giống lúa truyền thống. Các giống này có chất lượng tốt nhưng năng suất thường thấp, cây cao dễ đổ, thời gian sinh trưởng dài, dễ bị nhiễm bệnh. Các giống lúa nếp cải tiến có năng suất cao, chống chịu sâu bệnh nhưng chất lượng lại kém. Nguồn gen lúa nếp địa phương rất phong phú, có nhiều đặc điểm quý, có giá trị sử dụng cao là vật liệu cho công tác chọn tạo giống. Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành khảo sát đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính trên 50 mẫu giống lúa nếp, chọn ra giống lúa nếp thấp cây, cảm ôn, thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao, chất lượng tốt, có mùi thơm, có chứa các gen thơm, gen kháng bệnh bạc lá Xa4, Xa7 bằng chỉ thị phân tử. Kết quả chúng tôi thấy có 8 mẫu giống có mùi thơm trên hạt gạo. Có 43 giống mang gen kháng Xa7, 13 giống mang gen Xa4, trong đó có 8 giống mang cả hai gen kháng Xa4 và Xa7 Qua việc xác định quan hệ di truyền của các giống lúa nếp và kết hợp với các đặc điểm nông sinh học, khả năng kháng bệnh bạc lá, mùi thơm chúng tôi chọn được 5 mẫu giống tương đối tốt, vừa có khả năng kháng bệnh vừa có tiềm năng cho năng suất cao, chất lượng tốt là: Nếp Gà Gáy, 10132-3-2, 10861, 10912, 10923. ix PHẦN I. MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề Lúa nếp từ lâu đã đóng một vai trò rất quan trọng trong đời sống của người dân Việt Nam. Đặc biệt là các dân tộc thiểu số, tại đây lúa nếp được coi là đặc sản là cây lương thực chủ yếu. Đối với vùng đồng bằng, lúa nếp được sử dụng nhiều trong các dịp lễ Tết, cúng bái Tổ tiên. Ngoài ra, lúa nếp còn là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp chế biến như rượu, bánh kẹo Do đó, việc chọn tạo ra các giống lúa nếp mới có năng suất và chất lượng cao có ý nghĩa rất quan trọng. Các giống lúa nếp đang được trồng hiện nay chủ yếu là các giống nếp địa phương như Nếp Cái Hoa Vàng , Nếp Mỡ ….có chất lượng cao tuy nhiên thường phản ứng với ánh sáng ngày ngắn, năng suất không cao, chống chịu sâu bệnh kém, đặc biệt là nhiễm bệnh đạo ôn, bạc lá. Do vậy, việc lai tạo và chọn lọc các giống lúa nếp không phản ứng với ánh sáng ngày ngắn, đồng thời cho năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh, đặc biệt là bệnh bạc lá thì nguồn gen đóng một vai trò rất quan trọng. Nguồn gen càng phong phú đa dạng bao nhiêu thì khả năng chọn tạo ra giống càng thành công bấy nhiêu. Để khảo sát các giống lúa nếp có chứa gen kháng bạc lá hay gen mùi thơm bằng phương pháp truyền thống thì tốn nhiều thời gian, phụ thuộc vào điều kiện môi trường, hiệu quả chưa cao mà đôi khi còn dễ nhầm lẫn. Hiện nay, trong công tác lai tạo giống lúa mới, các nhà chọn giống thường ghép cặp ngẫu nhiên giữa các giống khác nhau, điều này dẫn đến nhiều cặp lai không cho ưu thế lai cao, do chúng có khoảng cách di truyền rất gần nhau. Ngày nay, phát triển của các chỉ thị phân tử như AFLP, RAPD, RFLP, SSR đã trợ giúp cho việc xác định khoảng cách di truyền giữa các mẫu giống nhanh chóng. Để từ đó lựa chọn cặp lai cho ưu thế lai cao. Trong số các chỉ thị DNA thì chỉ thị SSR được sử dụng rộng rãi và hiệu quả nhất trong nghiên cứu cấu trúc di truyền lúa trồng O.sativa. Hiện nay, đã có hơn 15.000 chỉ thị SSR đã được thiết lập, phủ kín trên bản đồ liên kết di truyền của lúa( Giarrocco và cộng sự, 2007). Trong nghiên cứu này, sau khi tiến hành khảo sát các mẫu giống chúng tôi sử dụng các chỉ thị SSR nghiên cứu đa dạng di truyền các mẫu giống cho năng suất cao, chất lượng tốt, thơm, có chứa gen kháng bệnh bạc lá. Từ đó chọn cặp lai giữa các mẫu giống để lai tạo giống lúa nếp mới. 1 [...]... tốt, xôi dẻo và thơm, cảm ôn và đặc biệt cần kháng bền vững với bệnh bạc lá, một loại dịch bệnh đang phổ biến hiện nay ở các vùng trồng lúa miền Bắc là việc làm rất cần thiết 2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa nếp kháng bệnh bạc lá Vào những năm 80 viện nghiên cứu lúa quốc tế đã xác định bản chất di truyền tính chống bệnh bạc lá lúa là do gen quy định Theo Sawaguchi và các nhà khoa... và yêu cầu của đề tài 1.2.1 Mục đích - Phát hiện được các mẫu giống lúa nếp năng suất cao, chất lượng tốt, chứa gen thơm, gen kháng bạc lá để làm vật liệu lai tạo giống lúa nếp mới - Xác định mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống thơm, chứa gen kháng bệnh bạc lá từ đó ghép cặp lai cho ưu thế lai cao 1.2.2 Yêu cầu - Khảo sát các đặc tính nông sinh học, đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp - Đánh giá. .. được sự khác nhau về di truyền giữa các cá thể( hoặc giữa các giống) gọi là các chỉ thị 10 Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng: • Chỉ thị hình thái • Chỉ thị isozyme • Chỉ thị phân tử 2.5.2 Chỉ thị hình thái Gen chỉ thị bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái nào đó mà người ta có thể phát hiện được Tuy nhiên, nếu dựa vào những chỉ thị này để lập bản đồ gen và chọn lọc sẽ mất... nông sinh học, đánh giá mùi thơm các giống lúa nếp - Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo - Xác định sự có mặt của các gen kháng bạc lá Xa4, Xa7 ở các giống lúa nếp - Đánh giá đa dạng di truyền của các giống lúa nếp 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan chung về bệnh bạc lá 2.1.1.Nguyên nhân gây bệnh Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae là vi khuẩn hình gậy hai... vụ lúa xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta 2.1.2 Triệu chứng của bệnh bạc lá lúa Năm 1960, Goto đã chỉ ra rằng: vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.oryzae gây ra ba triệu chứng điển hình của bệnh bạc lá lúa ở nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (Kresek hay Wilt) và vàng nhợt (Goto, 1960).Những nghiên cứu trong nhà lưới chứng tỏ: hiện tượng héo và bạc lá khác nhau một cách rõ ràng và độc lập Héo và bạc lá những triệu... được bóc vỏ, làm trắng và nghiền Bột gạo của mỗi giống được đặt trong một hộp chứa 500μl KOH 1.7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong vòng 10 phút Đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngửi và cho điểm như trên lá 3.2.5 Phương pháp đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo Lây nhiễm bệnh bạc lá bằng phương pháp cắt đầu lá sử dụng 10 chủng vi khuẩn, lây vào giai đoạn từ phân hoá... lọc gián tiếp trên cơ sở nhân DNA bằng kĩ thuật PCR, sau đó chạy điện di rồi xác định sự đa hình giữa kiểu gen kháng, nhiễm Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống 7 Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng. .. (2005a) thì mùi thơm chỉ có ở loài lúa trồng không có ở các loài lúa dại, điều đó chứng tỏ mùi thơm do đột biến gen lặn gây lên xẩy ra trong quá tiến hóa từ loài lúa dại thành loài lúa trồng Có nhiều gen quy định các mùi thơm khác nhau, và ít nhất có 6 nhiễm sắc thể chứa các gen quy định mùi thơm ở lúa đã được xác định Mỗi giống lúa có một kiểu chất thơm và do các gen khác nhau điều khiển Siddiq et al (1986)... De và Ba và các giống không thơm là Le và R2 2.5 Các phương pháp đánh giá quan hệ di truyền giữa các mẫu giống 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gen khác nhau Trình tự bộ gen của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau do sự xuất hiện của một loài đột biến nào đó Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, ... CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu - Vật liệu nghiên cứu gồm 50 mẫu giống lúa nếp bao gồm các giống lúa nếp thường và nếp Cẩm đang được lưu giữ giống tại Trung tâm Bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng – Đại học Nông ngiệp Hà Nội Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau: IRBB4, IRBB7 và giống nhiễm chuẩn IR24 - Giống lúa đối chứng là TK90 - 6 chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv.ozyzae . các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Sinh viên Nguyễn Xuân Trường i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, em chân thành cảm ơn quý. quả nghiên cứu trình bày trong luận văn là khách quan, trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kỳ một công trình nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và. vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời. Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy