Nghiên cứu khoa học " PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SAO LÁ HÌNH TIM (HOPEA CORDATA VIDAL) THUỘC HỌ DẦU (DIPTEROCARPACEAE) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ " pot

1 Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 10/2006, 75-77. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SAO LÁ HÌNH TIM (HOPEA CORDATA VIDAL) THUỘC HỌ DẦU (DIPTEROCARPACEAE) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNVN Tóm tắt Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) là loài cây bản địa họ Dầu, hiện chỉ còn thấy tại 3 điểm nhỏ thuộc hai xã của huyện Cam Ranh, Khánh Hoà, hiện có số cây cá thể không quá 250 và luôn bị đe doạ chặt phá, vì vậy đánh giá đa dạng di truyền để đưa ra biện pháp bảo tồn thích hợp là rất cần thiết. Kết quả phân tích một số gen lục lạp và chỉ thị nhân (RAPD) cho thấy về mặt tiến hóa, các mẫu Sao lá hình tim có cùng nguồn gốc vì không tìm thấy sự đa hình các gen lục lạp đã nghiên cứu. Có sự khác biệt nhỏ trong bộ gen nhân mà nguyên nhân có thể là có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của từng vùng cụ thể. Do thực tế là nguồn gen bị suy giảm mạnh và đa dạng di truyền của loài rất thấp nên việc bảo tồn loài đứng trước thách thức lớn. Cần phải bảo vệ 3 quần thể cuối cùng của loài để duy trì càng nhiều gen càng tốt cho sự tồn tại của loài trong tương lai. Mặt khác cần sớm thu hái hạt giống từ cả 3 vùng trong một số năm để gieo ươm, gây trồng bảo tồn loài ở nơi có điều kiện bảo vệ tốt nhất. Từ khoá: Đa dạng di truyền, RAPD, cpADN, Hopea cordata Vidal, Mở đầu Cây họ Dầu (Dipterocarpaceae) phân bố rộng khắp trên thế giới, là một họ thực vật điển hình của rừng nhiệt đới Đông Nam Á trong đó Việt Nam cũng có 42 loài của 6 chi và có ý nghĩa lớn về kinh tế và sinh thái học (Ashton, 1982; Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999; 2005). Ngoài việc cung cấp gỗ tròn, gỗ xẻ dùng trong xây dựng và sản xuất đồ gia dụng, sản xuất ván nhân tạo, các loài cây họ Dầu còn cho một số sản phẩm dầu nhựa làm sơn, được trồng làm cây cảnh quan đường phố, cây bóng mát trong công viên. Do hậu quả của chiến tranh, khai thác không hợp lý, đốt nương làm rẫy và chuyển đổi đất trồng cây nông nghiệp mà rừng hỗn giao cây họ Dầu đã giảm đi đáng kể cả về diện tích và trữ lượng. Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) là loài cây bản địa họ Dầu, hiện chỉ còn thấy tại 3 điểm nhỏ thuộc hai xã của huyện Cam Ranh, Khánh Hoà (Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999; 2005). Số lượng cây cá thể hiện chỉ còn không quá 250 cây trưởng thành, sống trên đất cát khô cằn ven biển, vẫn luôn bị đe doạ chặt phá làm củi. Để có cở sở triển khai bảo tồn loài, cần phải đánh giá mức độ đa dạng di truyền của loài sau những biến động mạnh về phạm vi phân bố và suy giảm số lượng cá thể. Phân tích đánh giá mức độ đa dạng di truyền của một số loài thực vật trong những năm gần đây ở nước ta đã được thực hiện bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử, trong đó có Lim xanh và một số loài họ Dầu (Dipterocarpaceae)(Quách Thị Liên et al., 2004; Nguyễn Hoàng Nghĩa et al., 2005; Nguyễn Đức Thành et al., 2005; Nguyễn Thuý Hạnh et al., 2005; Dayanandan et al., 1999; Lee et al., 2000, 2001, 2004). Trong các nghiên cứu trước, chúng tôi đã tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 6 chi thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) và 12 loài chi Dầu (Dipterocarpus). Trong nghiên cứu này, dựa vào chỉ thị RAPD và chỉ thị ADN lục lạp, chúng tôi đi sâu đánh giá đa dạng di truyền của 50 mẫu lá loài Sao lá hình tim thuộc họ Dầu để đề xuất các biện pháp bảo tồn thích hợp. Vật liệu và phương pháp Vật liệu: Năm mươi (50) mẫu lá Sao lá hình tim (Hopea cordata Vidal) đã được thu thập từ ở 3 điểm phân bố cuối cùng của loài: Thuỷ Triều 1 (Cam Hải Đông, ký hiệu từ A1- A9), Thuỷ Triều 2 (Cam Hải Đông, ký hiệu từ B1- B15) và Trạm Xá (Cam Hải Tây, ký hiệu từ C1- C26) đều thuộc huyện Cam Ranh, Khánh Hoà. Hoá chất. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu gồm: 5 mồi RAPD là OPC8, OPC11, OPB11, OPB14, OPB15 mua từ hãng Operon, Mỹ. 4 mồi lục lạp (cpADN): trnH- trnK, psbC- trnS, trnD- trnT, rbcL- trnL(UAA) được cung cấp bởi hãng IDT, Mỹ. Các enzym giới hạn: Hinf I, Hae III, HhaI mua từ hãng Promega, Mỹ. Phương pháp: ADN tổng số được tách chiết từ 50 mẫu lá Sao lá hình tim theo phương pháp CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromicle) của Saghai Maroof và cs (1994). Phản ứng PCR với các mồi RAPD PCR được tiến hành với tổng thể tích là 25 l/mẫu, gồm những thành phần sau: ADN tổng số (75 ng); mồi RAPD (20 ng); dNTP (200 M mỗi loại); MgCl 2 (1,5 mM); enzyme Taq polymeraza (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94 o C - 3 phút; 94 o C - 1 phút; 35 o C - 1phút; 72 o C - 2 phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 o C - 5 phút; giữ nhiệt độ ở 4C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 0,8 %, quan sát dưới đèn cực tím. 2 Phản ứng PCR với các mồi lục lạp Kỹ thuật PCR với các mồi lục lạp được tiến hành với tổng thể tích là 25l/mẫu gồm những thành phần sau: ADN tổng số (20 ng); mồi cpADN(10 ng); dNTP (200 M mỗi loại); MgCl 2 (1,5 mM); enzym Taq polymeraza (0,5 đơn vị) và đệm thích hợp cho enzym. Chu trình nhiệt bao gồm các bước: 94 o C - 4phút; 94 o C - 1phút; 57 o C - 1phút; 72 o C - 2phút, lặp lại 45 chu kỳ từ bước 2 đến bước 4; 72 o C - 7phút; giữ nhiệt độ ở 4 o C. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5 %, quan sát dưới đèn cực tím. Phân tích số liệu Các băng ADN được ghi nhận dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của chúng ở các mẫu nghiên cứu theo ADN chuẩn (ADN marker). Nếu có thì ký hiệu là 1, còn không có thì ký hiệu là 0. Các số liệu này được đưa vào sử lý theo chương trình NTSYS pc để tính ma trận tương đồng giữa các đôi mẫu (Rohlf, 1993). Việc tính toán ma trận tương đồng dựa trên công thức: J ij = a/(n-d) a: Số băng ADN có ở hai dòng i và j d: Số băng ADN không có băng cả hai dòng i và j n: Tổng số băng thu được J ij : Hệ số tương đồng Jaccard giữa hai dòng i và j Sau đó các mẫu nghiên cứu được sử lý tiếp trong NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim. Kết quả và thảo luận 1. Kết quả phân tích với các mồi lục lạp Sản phẩm PCR với các mồi lục lạp được thể hiện trên hình 1, 2 và 3. Kết quả cho thấy với mỗi mồi lục lạp đều nhận được băng đặc trưng và không cho đa hình giữa các mẫu nghiên cứu. Khi dùng các enzym giới hạn cắt các sản phẩm PCR của các ADN genome với các mồi lục lạp cũng không nhận được đa hình. Kết quả trên cho thấy về mặt tiến hóa các mẫu Sao lá hình tim có cùng nguồn gốc vì các đoạn gen lục lạp rất bảo thủ và mang đặc trưng của loài, nó cũng chứng tỏ nguồn gen của loài hiện đã bị suy giảm mạnh và hầu như không còn sự đa dạng di truyền. 2. Kết quả phân tích với các mồi RAPD Sản phẩm PCR với các mồi RAPD được thể hiện trên hình 4 và 5. Với việc sử dụng 5 mồi RAPD đã nhân bản được 1166 phân đoạn ADN từ 50 mẫu cây đại diện cho 50 mẫu loài Sao lá hình tim tại 3 địa điểm khác nhau, trong đó có 616 phân đoạn cho đa hình giữa các mẫu. Số phân đoạn đa hình giao động từ 3 đến 49 Hình1. Sản phẩm PCR của mồi trnD – trnT với ADN genome các cây Sao lá hình tim Hình 2. Sản phẩm PCR của mồi trnH- trnK với ADN genome các cây Sao lá hình tim cắt với enzym HhaI Hình 3. Sản phẩm PCR của mồi psbC-trnS với ADN genome các cây Sao lá hình tim cắt với enzym HinfI 3 tương đương với 37,1% đến 78,4%. Mồi OPC8 cho nhiều băng đa hình nhất (181 băng) còn mồi OPB14 cho ít băng đa hình nhất (93 băng). Số liệu thu được chúng tôi đưa vào xử lý theo chương trình NTSYS pc và NTSYS - SIMQUAL để tính hệ số tương đồng di truyền và được biểu hiện trên biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim (hình 6). Qua hình 6 cho thấy quan hệ di truyền giữa 50 mẫu của loài Sao lá hình tim phân thành 3 nhóm tương ứng với 3 địa điểm thu mẫu với hệ số tương đồng di truyền khá cao (khoảng 70% đến 80%). Tuy nhiên, các mẫu tại mỗi địa điểm có sự khác biệt nhau nhưng cũng không lớn: nhóm B (Thuỷ Triều 2) có mức độ đa Hình 4. Sản phẩm PCR của mồi OPB14 với ADN gennome các cây Sao lá hình tim Hình 5. Sản phẩm PCR của mồi OPB11 với ADN genome các cây Sao lá hình tim Coefficient 0.67 0.75 0.83 0.92 1.00 A1 A2 A3 A8 A5 A7 A9 A6 A4 C1 C3 C9 C14 C4 C21 C25 C24 C15 C20 C5 C22 C13 C18 C16 C17 C19 C2 C8 C7 C6 C11 C10 C12 C23 C26 B1 B5 B6 B7 B15 B14 B4 B13 B11 B9 B12 B2 B3 B8 B10 Hình 6. Biểu đồ quan hệ di truyền giữa 50 mẫu Sao lá hình tim 4 dạng cao hơn cả và có hệ di truyền tương đồng với hai nhóm A và C là 67 %, nhóm A (Thuỷ Triều 1) và nhóm C (Trạm Xá) có quan hệ gần nhau hơn với hệ số tương đồng di truyền ở mức 78%. Trong mỗi nhóm, các mẫu cây thu được đều có sự khác nhau, tuy nhiên ở mức độ rất thấp (từ 0 đến 20%). Kết quả phân tích RAPD cho thấy, các mẫu Sao lá hình tim thu từ ba địa điểm khác nhau có sự khác biệt nhỏ ở mức độ genome, các mẫu thu trong một vùng đều nằm trong cùng một nhóm riêng biệt. Sự khác nhau ở mức độ genome có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của từng vùng cụ thể. Kết luận: Từ kết quả phân tích một số gen lục lạp và chỉ thị nhân (RAPD) có thể kết luận như sau:  Xét về mặt tiến hóa thì các mẫu Sao lá hình tim có cùng nguồn gốc vì không có sự đa hình các gen lục lạp đã nghiên cứu.  Hiện tồn tại sự khác biệt nhỏ trong bộ gen nhân, có thể do biến đổi của các tính trạng thích nghi lên điều kiện sinh thái của từng vùng cụ thể.  Do thực tế là nguồn gen bị suy giảm mạnh và đa dạng di truyền của loài rất thấp nên việc bảo tồn loài đứng trước thách thức lớn. Cần phải bảo vệ 3 quần thể cuối cùng của loài để duy trì càng nhiều gen càng tốt cho sự tồn tại của loài trong tương lai. Mặt khác cần sớm thu hái hạt giống từ cả 3 vùng trong một số năm để gieo ươm, gây trồng bảo tồn loài ở nơi có điều kiện bảo vệ tốt nhất. Tài liệu tham khảo 1. Ashton, P.S.J,1982. Dipterocarparceae. In C.G.G.J. Van Steenis [ed.], Flora Malesiana, Series 1, Spermatophyta, vol.9, 237-552. Martinus Nijhoff Pulishers, The Hague. 2. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 1999. Một số loài cây bị đe doạ ở Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Cây họ Dầu Việt Nam. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 4. Nguyễn Đức Thành, 1999. ứng dụng và phát triển các chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội: 1205-1215. 5. Quách Thị Liên, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa 2004. Sử dụng các chỉ thị RAPD và ADN lục lạp trong nghiên cứu quan hệ di truyền của một số xuất xứ cây Lim xanh Erythrophloeum fordii Oliv. Hội nghị toàn quốc “Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống”, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 2004. 464 – 468. 6. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Trần Quốc Trọng, Nguyễn Đức Thành, 2005. Kết quả bước đầu đánh giá đa dạng di truyền của ba xuất xứ Lim xanh bằng chỉ thị phân tử RAPD và ADN lục lạp. Tạp chí Nông nghiệp &PTNT, 15/2004, 80 - 81. 7. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu quan hệ di truyền của một số loài thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) ở Việt Nam dựa trên đa hình ADN genome và lục lạp. Hội Nghị khoa học toàn quốc, Hà Nội 2005 - Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống. Bài đã gửi đăng. 8. Nguyễn Thuý Hạnh, Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Hoàng Nghĩa, 2005. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Hội nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu cơ bản”, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội, 2005. 89 – 92. 9. Dayanandan S., Ashton P.S., Williams S.M., Primack R.B., 1999. Phylogeny of the tropical tree family Dipterocarpaceae based on nucleotide sequences of chloroplast rbcL gene. Amer. Journal of Botany, 86: 1182-1190. 10. Lee, S. L, Tani, N, K. K. S. NG and Tsumura, Y., 2004. Characterization of 15 polymophic microsatellite loci in an endangered tropical tree Hopea bilitonensis (Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia. Molecular Ecology Notes 4:147-149. 11. Lee, S. L., K. C. Ang & M. Norwati., 2000. Genetic diversity of Dryobalanops Aromatica Gaertn. F (Dipterocarpaceae) in Peninsular Malaysia and its pertinence to genetic conservation and tree improvement. Forest Genetics 7 (3): 211-219. 12. Lee, S. L., Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2001. Comparative genetic diversity studies of Shorea Leprosula (Dipterocarpaceae) using RAPD and Allozyme markers. Journal of Tropical Forest Science 13 (1): 202-215. 13. Lee. S. L, Wickneswari. R, Mahani. M. C, Zakri. A. H., 2000. “Mating System parameters in a Tropcal Tree Species, Shorea leprosula Miq. (Dipteerocarpaceae), from Malaysian Lowland Dipterocarp Forest”. Biotropica 32(4a): 693-702. 14. Rohlf F. J., 1993. “NTSYS-pc Numerical taxonomomy and multivariate analysis system”, Version 1.80. Applied Biostatitics, New York. 15. Saghai Maroof M. A., Biyashev R. M., Yang G. P., Zhang Q., Allard R. W., 1994, Extraodirnarily polymorphic microsatellite DNA in barley: species diversity, chromosome location, and population dynamics, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 91: 5466-5470. 5 Analysis of genetic diversity of Hopea cordata Vidal, a species of Dipterocarpaceae by DNA markers Nguyen Hoang Nghia Forest Science Institute of Vietnam Nguyen Thuy Hanh, Nguyen Duc Thanh Institute of Biotechnology, VAST Summary Hopea cordata Vidal is a native tree species which occurs naturally only in 3 small areas in Cam Ranh district, Khanh Hoa province where not more than 250 mature individuals can be found and they are facing danger of cutting for fuelwood, therefore evaluation of genetic diversity in order to suggest conservation mrasures should be very necessary. Results from analysis by using cpDNA and RAPD markers showed that based on evolutionary viewpoint, samples collected from 3 areas come from one origin beacause we could not find any polymorphism in studied cpDNA. There was a small difference in nuclear genome. Due to strongly reduced genetic resources and low genetic diversity, conservation of the species is very difficult. The last 3 populations should be protected strictly to keep as many genes as possible for survival of the species in future, on the other hand, seeds should be collected in some years from 3 areas for sowing and planting in such area where species can be protected best. Keywords: Genetic diversity, RAPD, cpDNA, Hopea cordata Vidal, . 75-77. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN LOÀI SAO LÁ HÌNH TIM (HOPEA CORDATA VIDAL) THUỘC HỌ DẦU (DIPTEROCARPACEAE) BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ Nguyễn Hoàng Nghĩa Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt. 2005. Nghiên cứu mối quan hệ di truyền của 12 loài thuộc chi Dipterocarpus (họ Dipterocarpaceae) dựa trên các chỉ thị phân tử. Hội nghị Khoa học toàn quốc “Công nghệ sinh học trong nghiên cứu. các nghiên cứu trước, chúng tôi đã tìm hiểu mối quan hệ di truyền của 6 chi thuộc họ Dầu (Dipterocarpaceae) và 12 loài chi Dầu (Dipterocarpus). Trong nghiên cứu này, dựa vào chỉ thị RAPD và chỉ