Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống dòng chè (camellia sinensis(l ) o kuntze) ở việt nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)
Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 163 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Thông tin cơ bản
Định dạng
Số trang
163
Dung lượng
6,4 MB
Nội dung
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
Trần Đức Trung
Nghiên cứuđánhgiásựđadạngditruyềncác giống/dòng chè
(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze)ởViệtNam
bằng chỉthịhìnhtháivàchỉthịphântửmicrosatellite(SSR)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học
Người hướng dẫn khoa học: TS. Lã Tuấn Nghĩa
Hà Nội- 2009
Dànhtặngnhữngngườitôithươngyêunhất;
…bốmẹ…
…vợ…
…giađình…
…vàbéTrầnĐứcHoàngMinh….
viii
Lờicảmơn
Trước hết, tôi xin gửi lời cảmơn chân thành và sâu sắc tới
TS. Lã Tuấn Nghĩa, ngườiđãtậntìnhhướngdẫn,giúpđỡvàhỗtrợtôi
trongsuốtquátrìnhcôngtáccũ
ngnhưtrongthờigianhọctập,nghiêncứu
vàhoànthànhluậnvănnày.
TôixinbàytỏlòngbiếtơntớicácthầycôvàcánbộcôngtáctạiViện
CôngnghệSinhhọcthực
phẩm,Việnđàotạosauđạihọc‐TrườngĐạihọc
BáchkhoaHàNộiđãdạydỗvàtạomọiđiềukiệnthuậnlợi chotôitrongsuốt
quátrìnhhọctậptạ
itrường.
Nhândịpnày,tôicũngxingửilờicảmơnchânthànhtớicáccánbộ
công tác tại Viện Khoa học kỹ thu ật Nông‐Lâm nghiệp miền núi phía Bắc
(NOMAFSI)đãnhiệt
tìnhgiúpđỡtôitrongthờigianthuthậpsốliệuvàvật
liệunghiêncứutạiViện.
Tôixinchânthànhcảmơncáccánbộ,anhchịemtrongNhómnghiên
cứuĐad ạngditruyền
vàCôngnghệsinhhọcNôngnghiệp,ViệnDitruyền
Nôngnghiệp,đãgiúpđỡvàđộngviêntôitrong quátrìnhcôngtácvànghiên
cứukhoahọcvừaqua.
Cuốicùng,tôixinchânthànhcảmơngiađìnhvà
bạnbèđãnhiệttình
độngviên,giúpđỡtôitrongquátrìnhhọctập,nghiêncứukhoahọccũng
nhưtrongcuộcsống.
LuậnvănnàyđượcthựchiệnvớinguồnkinhphítừCh
ươngtrìnhCông
nghệsinhhọcNôngnghiệp.
Xinchânthànhcảmơn!
HàNội,tháng10năm2009
TrầnĐứcTrung
i
Lờicamđoan
Tôixincamđoanđãtrựctiếpthựchiệncácnghiêncứutrongluậnvăn
này.Mọikếtquảthuđượcnguyên bản,khôngchỉnhsửahoặcsaochéptừcác
nghiêncứukhác;cácsốli
ệu,sơđồkếtquảcủaluận vănnàych ưatừngđược
côngbố.
Mọidữliệu,hìnhảnh,biểuđồvàtríchdẫnthamkhảotrongluậnvăn
đềuđược thuthậpvàsửdụng
từnguồndữliệumởhoặcvớisựđồngýcủa
tácgiả.Cácphầnm ềmphântíchTotalLabv2009,QuantityOne,NYSYSpc
2.11X, TreeCon, POPGENE32, Dendroscopes, PHYLIP v3.69đều có bản
quyềnhoặcsửdụngvới
sựđồngýcủa(nhóm)tácgiảxâydựngphầnmềm.
Tôixinhoàntoànchịutráchnhiệmvớinhữnglờicamđoantrên!
TrầnĐứcTrung
ii
Mục lục
Trang
Lời cam đoan
i
Mục lục
ii
Danh mục chữ viết tắt
iv
Danh mục bảng
v
Danh mục hình ảnh minh họa
vi
Mở đầu
1
Chương 1: Tổng quan
4
1.1. Khái quát chung về cây chè Camellia sinensis (L.) O. Kuntze
4
1.1.1. Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới
và ViệtNam 4
1.1.2. Nguồn gốc vàphân bố của cây chè 5
1.1.3. Phân loại thực vật và
đặc điểm hìnhthái của cây chè 8
1.1.4. Đặc điểm ditruyền của cây chè
Camellia sinensis (L.) O. Kuntze 14
1.1.5. Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới vàViệtNam 17
1.1.6. Công tác lai tạo giốngchè 19
1.1.6.1. Phương pháp truyền thống 19
1.1.6.2. Áp dụng công nghệ sinh học
trong chọn tạo giốngchè 21
1.2. Chỉthị trong đánhgiáđadạngditruyền 22
1.2.1. Chỉthịhìnhthái 23
1.2.2. Chỉ thị
hóa sinh 24
1.2.3. Chỉthị DNA 25
1.2.3.1. Chỉthị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉthị RFLP
(Restriction Fragment Length Polymorphism) 29
1.2.3.2. Chỉthị DNA ngẫu nhiên 30
1.2.3.3. Chỉthị DNA dựa trên đahìnhcác vị trí nhận biết
giới hạn 31
1.2.3.4. Chỉthị DNA dựa trên các trình tự lặp 33
1.2.3.5. Chỉthị DNA dựa trên trình tự DNA 41
1.2.3.6. Một số loại chỉthị DNA khác 42
1.3. Thành tựu trong nghiêncứu
đa dạngditruyềnchè
(Camellia sinensis (L.) O. Kuntze) 43
iii
1.3.1. Nghiêncứuđadạngditruyềnchèbằngchỉthịhìnhthái 43
1.3.2. Nghiêncứuđadạngditruyềnchèbằngchỉthị hóa sinh 44
1.3.3. Nghiêncứuđadạngditruyềnchèbằngchỉthị DNA 45
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiêncứu
50
2.1. Vật liệu nghiêncứu 50
2.2. Phương pháp nghiêncứu 55
2.1.1. Đánhgiá đặc điểm hìnhtháichè 55
2.1.2. Thu thập mẫu lá chè 55
2.1.3. Trích ly DNA tổng số từ mẫu lá chè 57
2.1.4. Nhận d
ạng ditruyềncácgiốngchèbằngchỉthị SSR 58
2.1.5. Phân tích kết quả 60
2.1.5.1. Phân tích số liệu kiểu hình 60
2.1.5.2. Phân tích số liệu kiểu gen 61
2.1.5.3. Phân loại thứ chè theo tỷ lệ nguồn gen 63
Chương 3: Kết quả và bàn luận
64
3.1. Phân tích đadạngditruyềnchè dựa trên đặc điểm hìnhthái 64
3.1.1. Đánhgiá đặc điểm hìnhthái 64
3.1.2. Phân tích đadạngditruyền dựa trên đặc điểm hìnhthái
của các giống/dòng chè 67
3.2. Phân tích đadạngdi truy
ền chèbằngchỉthị SSR 73
3.2.1. Trích ly DNA tổng số 73
3.2.2. Nhận dạngditruyềnchèbằngchỉthị SSR 75
3.2.3. Phân tích tính đadạngditruyền của các locus SSR 81
3.2.4. Phân tích đadạngditruyền giữa 9 quần thể chè
bằng chỉthị SSR 84
3.2.5. Phân tích đadạngditruyền 96 giống/dòng chè
bằng chỉthị SSR 91
3.2.5.1. Phân nhóm ditruyền dựa trên
mức độ tương đồng Jaccard 92
3.2.5.2. Phân nhóm ditruyền dựa trên
khoảng cách ditruyền Nei72 98
3.3. Kết hợ
p chỉthịhìnhtháivàchỉthị SSR
trong phân tích đadạngditruyềncác giống/dòng chè 106
Kết luận và kiến nghị
109
Tài liệu tham khảo
111
Phụ lục
122
iv
Bảng chữ viết tắt
AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism
APS Amonium persulfate
CAPs Cleaved Amplification Polymorphism Sequence
cs Cộng sự
CTAB Cetyl trimethylammonium bromide
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid
EST Expressed sequence tag
EthBr Ethidium bromide
IPGRI International Plant Genetic Resource Institute
ISSR Inter-simple sequence repeat
MAS Molecular Assisted Selection
PCA Principles Component Analysis
PCR Polymerase Chain Reaction
PIC Polymorphism Information Content
RAPD Random Aplification Polymorhism DNA
RFLP Restriction Fragment length Polymorphism
SSR Simple sequence repeat
STS Sequence- tagged site
TAE Tris-Acetic acid- EDTA
TEMED N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine
v
Danh mục bảng
Trang
Bảng 1.1: So sánh đánhgiá đặc điểm của một số loại chỉthị được ứng
dụng trong nghiêncứuđadạngditruyền thực vật 28
Bảng 1.2: So sánh ưu/nhược điểm của các phương pháp phân lập
và phát triển chỉthị SSR 40
Bảng 2.1: Danh sách 96 giống/dòng chè thu thập từ NOMAFSI 50
Bảng 2.2: 9 quần thể chènghiêncứu 52
Bảng 2.3: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụ
ng trong nghiêncứu 53
Bảng 2.4: 12 đặc điểm hìnhthái được sử dụng để đánhgiá
các giống/dòng chè 56
Bảng 2.5: Thành phầnphản ứng SSR-PCR 59
Bảng 2.6: Thành phần gel polyacrylamide 12% 60
Bảng 3.1: Giá trị đặc trưng của 90 thành phần trong phân tích PCA
(khoảng cách ditruyền Euclidean của 90 giống/dòng chè) 71
Bảng 3.2: Tần số alen của 21 locus SSR 82
Bảng 3.3: Thống kê cácchỉ số đadạngditruyền của 21 locus SSR 83
Bảng 3.4: Kết quả đánhgiáđadạngditruyền giữa 9 quần thể chè 85
Bảng 3.5: Khoảng cách ditruyền giữa 9 quần thể chènghiêncứu 87
Bảng 3.6: Giá trị đặc trưng của 96 thành phần trong phân tích PCA
(khoảng cách ditruyền Nei72 của 96 giống/dòng chè) 102
vi
Danh mục hình ảnh minh họa
Trang
Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê
năm 2007 7
Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B) 10
Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc (C.sinensis var. sinnensis) 12
Hình 1.4: Cây chè Assam (C. sinensis var. assamica) 13
Hình 1.5: Cây chè Cambod (C. sinensis var. assamica sub sp.
lasiocalyx) 13
Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè
(C. sinensis var. sinensis) 15
Hình 1.7: Kích thước biến thiên của lá chè 16
Hình 1.8: Biểu đồ sản lượng chè khô của một số nước nă
m 2005, 2006
và 2007 18
Hình 1.9: Biểu đồ khối lượng sản xuất và xuất khẩu chè khô của một số
nước năm 2007 18
Hình 1.10: Nguyên lý phản ứng PCR 26
Hình 1.11: Nguyên lý kỹ thuật kỹ thuật AFLP 32
Hình 1.12: Phân loại trình tự lặp SSR 35
Hình 1.13: Đahình DNA SSR giữa hai cá thể có motif (AT)
n
37
Hình 1.14: Quy trình phát triển chỉthị SSR từ thư viện hệ gen 39
Hình 2.1: Phân loại chè Cambod dựa trên tỷ lệ nguồn gen 63
Hình 3.1: Màu sắc lá chè non 65
Hình 3.2: Búp chè non 65
Hình 3.3: Thế lá chè 66
Hình 3.4: Cây chèdạng thân gỗ 66
Hình 3.5: Cây chèdạng thân bụi 67
Hình 3.6: Sơ đồ cây phân nhóm 90 giống/dòng chè dựa trên
đặc điểm hìnhtháibằng phương pháp UPGMA 69
Hình 3.7: Phân tích PCA 90 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa
trên ma trận khoảng cách ditruyền Euclidean
(đặc điểm hình thái) 72
vii
Hình 3.8: Kết quả trích ly DNA tổng số chè (dựa trên quy trình
Porebski) 74
Hình 3.9: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu
cho mồi CamsinM6 (SSR-6) 75
Hình 3.10: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu
cho mồi MSCjaH46 (SSR-17) và MSCjaF37 (SSR-20) 76
Hình 3.11: Kết quả nhận dạngditruyền 96 giống/dòng chè
bằng chỉthị SSR CamsinM1và CamsinM4 77
Hình 3.12: Kết quả nhận dạngditruyền 96 giống/dòng chè
bằ
ng chỉthị SSR CamsinM8 và CamsinM13 78
Hình 3.13: Kết quả phản ứng PCR của 96 giống/dòng chè
với 21 cặp mồi SSR 80
Hình 3.14: Sơ đồ phân nhóm ditruyền 9 quần thể chè
dựa trên khoảng cách ditruyền Nei72 88
Hình 3.15: Phân tích PCA biểu diễn quan hệ nhóm của 9 quần thể chè
trong không gian ba chiều 88
Hình 3.16: Sơ đồ cây phân loại 96 giống/dòng chè
bằng phương pháp UPGMA 94
Hình 3.17: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè
dựa trên mức độ tương đồngditruyền Jaccard 97
Hình 3.18: Sơ đồ cây phân nhóm 96 giống/dòng chè
bằng phương pháp Weighted- Neighbor Joining 99
Hình 3.19: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè
dựa trên khoảng cách ditruyền Nei72 103
Hình 3.20: Cây phân nhóm 96 giống/dòng chè
dựa trên khoảng cách ditruyền Nei72
(xây dựng bằngphần mềm PHYLIP 3.69 và Dendroscopes) 105
[...]... chính, đánhgiá đặc điểm hìnhthái của các giống/ dòngchè thuộc các quần thể chè được b o tồn ở vườn quỹ gen chèViện Khoa học Kỹ thuật Nông-Lâm nghiệp miền núi phía Bắc (NOMAFSI) 2 Nhận dạngditruyềncác giống/ dòngchèbằngchỉthịphântử 3 Phân tính đánhgiásựđadạngditruyền của các giống/ dòngchè SSR dựa trên kết quả đánhgiáhìnhthái 4 Phân tích đánhgiásự đa dạngditruyền của các quần thể chè; ... năng đánhgiá mức độ đa dạngditruyền khác nhau Trong đó, chỉthịhìnhthái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánhgiáphân loại sinh vật, còn chỉthị hóa sinh và đặc biệt chỉthị DNA hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ trong đánhgiá đa dạngditruyền mà còn là công cụ hữu hiệu hỗ trợ công tác chọn t ogiống 1.2.1 Chỉthịhìnhthái Trước đây, sựđadạng giữa các cá thể trong... (L .) OKuntze)ởViệtNambằngchỉthịhìnhtháivàchỉthịphântửmicrosatellite(SSR) với mong muốn có Trần Đức Trung – Cao học CNSH khóa 2007-2009, ĐH Bách khoa Hà Nội 3 Luận văn thạc sỹ công nghệ sinh học được cái nhìn tổng quan về sự đa dạngditruyền của các giống/ dòngchèởViệtNam Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiêncứu sau: 1 Dựa trên một số chỉ. .. di n từng các thể vàđánhgiá được sựđadạng trong quần thể nghiêncứu So với chỉthịhìnhtháithìchỉthị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein là sản phẩm của một gen, do đó sựđahìnhcác protein cũng phản ánh gián tiếp sựđahình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể có quan hệ ditruyền gần gũi (đặc biệt là giữa cácgiống cây trồng) thìcác sản phẩm biểu hiện gen (protein,... pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công o n trong chiến lược chọn t o giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉthịphântửvà nuôi cấy mô phôi tế b o [46, 47]: • Áp dụng chỉthịphântử trong đánhgiá đa dạngditruyền các giống chè, hỗ trợ chọn lựa cặp lai phù hợp; nhận dạngditruyềncácgiốngchèvà đặc biệt đóng vai trò quan trọng trong chọn giốngphân tử. .. và giữa các quần thể được xác định thông qua đánhgiácác đặc điểm hìnhthái nổi trội (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận) Với ưu điểm như dễ dàng tiếp cận vànghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉthịhìnhthái được sử dụng khá rộng rãi trong nghiêncứuđadạngditruyền thực vật Trong đánhgiávà chọn t ogiốngtruyền thống, chỉthịhình thái. .. để đánhgiá tính đadạngditruyền giữa các cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể o đếm được Hiện nay, tuy có nhiều nhược điểm và trong bối cảnh chỉthị DNA được sử dụng phổ biến hơn, nhưng chỉthịhìnhthái vẫn được áp dụng khá hiệu quả trong đánhgiáđadạngditruyền (đặc biệt đối với các đối tượng mà chỉthịphântử chưa có nhiều) hoặc trong nghiên cứu. .. sinh thái, là sựđadạng giữa các loài trong quần xã hay sựđadạngở cấp độ ditruyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đadạngditruyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa và thích nghi của các sinh vật; mọi biến độngở cấp độ đadạngditruyền đều có những tác động đến những cấp độ cao hơn và cuối cùng là ảnh hưởng đến đadạng sinh học [61] Đadạng di. .. chế biến các loại chè làm đồ uống Do có quá trình phân tán lâu dài giữa các vùng địa lý khác nhau cùng với những tác động của con người (lai t o, chọn lọc) nên cây chè có sựđadạng cả về hìnhtháivà đặc điểm ditruyền Vì vậy mà hệ thống phân loại cácgiốngchè còn nhiều điểm chưa được thống nhất CácgiốngchèởViệtNam được kh o sát vàphân loại từ khá sớm (những năm 30 của thế kỷ 2 0) Theo Nguyễn... đời và được biết đến là loại chỉthị mới -chỉ thị DNA thế hệ đầu tiên- với những ưu điểm vượt trội so với những chỉthịhìnhtháivàchỉthị hóa sinh đang được sử dụng trong đánhgiáđadạngditruyền lúc đó (Botstein, 198 0) Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉthịphântử nói riêng và sinh học phântử nói chung chính là phát minh phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains Reaction- . GI O DỤC VÀ Đ O T O TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Trần Đức Trung Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè (Camellia sinensis (L .) O. Kuntze) ở Việt Nam bằng. số loại chỉ thị DNA khác 42 1.3. Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền chè (Camellia sinensis (L .) O. Kuntze) 43 iii 1.3.1. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hình thái. 43 1.3.2. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hóa sinh 44 1.3.3. Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị DNA 45 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 50 2.1. Vật liệu nghiên cứu