Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống dòng chè (camellia sinensis(l ) o kuntze) ở việt nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)

Trước nhu cầu tăng nhanh cả về năng suất và chất lượng, công tác chọn tạo giống chè đã được đẩy mạnh, nhiều giống chè mới đã được tạo ra, đặc biệt ở các nước Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc…

-Trần Đức Trung

Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các giống/dòng chè

(Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ở Việt Nam

bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Luận văn Thạc sỹ Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học: TS Lã Tuấn Nghĩa

Hà Nội- 2009

Trước  hết,  tôi  xin  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  và  sâu  sắc  tới         

TS.  Lã  Tuấn  Nghĩa,  người  đã  tận  tình  hướng  dẫn,  giúp  đỡ  và  hỗ  trợ  tôi 

trong suốt quá trình công tác cũng như trong thời gian học tập, nghiên cứu 

và hoàn thành luận văn này. 

Tôi  xin  bày  tỏ  lòng biết  ơn  tới  các  thầy cô  và  cán  bộ  công  tác  tại  Viện 

Công  nghệ  Sinh  học  thực  phẩm,  Viện  đào  tạo  sau  đại  học‐  Trường  Đại  học 

Bách khoa Hà Nội đã dạy dỗ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt 

quá trình học tập tại trường. 

Nhân  dịp  này,  tôi  cũng  xin  gửi  lời  cảm  ơn  chân  thành  tới  các  cán  bộ 

công  tác  tại  Viện  Khoa  học  kỹ  thuật  Nông‐Lâm  nghiệp  miền  núi  phía  Bắc 

 

        Trần Đức Trung

 

Tôi xin cam đoan đã trực tiếp thực hiện các nghiên cứu trong luận văn  này. Mọi kết quả thu được nguyên bản, không chỉnh sửa hoặc sao chép từ các  nghiên cứu khác; các số liệu, sơ đồ kết quả của luận văn này chưa từng được  công bố. 

Mọi dữ liệu, hình ảnh, biểu đồ và trích dẫn tham khảo trong luận văn   đều được thu thập và sử dụng từ nguồn dữ liệu mở hoặc với sự đồng ý của  tác giả. Các phần mềm phân tích TotalLab v2009, QuantityOne, NYSYS pc  2.11X,  TreeCon,  POPGENE32,  Dendroscopes,  PHYLIP  v3.69  đều  có  bản  quyền hoặc sử dụng với sự đồng ý của (nhóm) tác giả xây dựng phần mềm. 

Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm với những lời cam đoan trên! 

 

Trần Đức Trung

1.1 Khái quát chung về cây chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze 4

1.1.1 Lược sử ngành sản xuất- chế biến chè trên thế giới

1.1.3 Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái của cây chè 81.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè

1.1.5 Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới và Việt Nam 17

1.1.6.1 Phương pháp truyền thống 191.1.6.2 Áp dụng công nghệ sinh học

1.2 Chỉ thị trong đánh giá đa dạng di truyền 22

1.2.3.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉ thị RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism) 29

1.2.3.3 Chỉ thị DNA dựa trên đa hình các vị trí nhận biết

giới hạn 311.2.3.4 Chỉ thị DNA dựa trên các trình tự lặp 331.2.3.5 Chỉ thị DNA dựa trên trình tự DNA 411.2.3.6 Một số loại chỉ thị DNA khác 421.3 Thành tựu trong nghiên cứu đa dạng di truyền chè

1.3.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị hóa sinh 441.3.3 Nghiên cứu đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị DNA 45

2.1 Vật liệu nghiên cứu 502.2 Phương pháp nghiên cứu 55

2.1.3 Trích ly DNA tổng số từ mẫu lá chè 572.1.4 Nhận dạng di truyền các giống chè bằng chỉ thị SSR 582.1.5 Phân tích kết quả 60

2.1.5.3 Phân loại thứ chè theo tỷ lệ nguồn gen 63

3.1 Phân tích đa dạng di truyền chè dựa trên đặc điểm hình thái 64

3.1.2 Phân tích đa dạng di truyền dựa trên đặc điểm hình thái

3.2 Phân tích đa dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 733.2.1 Trích ly DNA tổng số 733.2.2 Nhận dạng di truyền chè bằng chỉ thị SSR 753.2.3 Phân tích tính đa dạng di truyền của các locus SSR 813.2.4 Phân tích đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè

3.2.5.2 Phân nhóm di truyền dựa trên

Bảng chữ viết tắt

AFLP Amplification Fragment Length Polymorphism

CAPs Cleaved Amplification Polymorphism Sequence

cs Cộng sự

CTAB Cetyl trimethylammonium bromide

DNA Deoxyribonucleic acid

dNTPs Deoxy nucleotide triphosphates

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EST Expressed sequence tag

EthBr Ethidium bromide

IPGRI International Plant Genetic Resource Institute ISSR Inter-simple sequence repeat

MAS Molecular Assisted Selection

PCA Principles Component Analysis

PCR Polymerase Chain Reaction

PIC Polymorphism Information Content

RAPD Random Aplification Polymorhism DNA

RFLP Restriction Fragment length Polymorphism SSR Simple sequence repeat

STS Sequence- tagged site

TAE Tris-Acetic acid- EDTA

TEMED N,N,N’,N’- Tetraethyl methylendiamine

Danh mục bảng

Trang

Bảng 1.1: So sánh đánh giá đặc điểm của một số loại chỉ thị được ứng

dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật 28

Bảng 1.2: So sánh ưu/nhược điểm của các phương pháp phân lập

Bảng 2.1: Danh sách 96 giống/dòng chè thu thập từ NOMAFSI 50

Bảng 2.2: 9 quần thể chè nghiên cứu 52 Bảng 2.3: Danh sách các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu 53 Bảng 2.4: 12 đặc điểm hình thái được sử dụng để đánh giá

Bảng 2.6: Thành phần gel polyacrylamide 12% 60

Bảng 3.1: Giá trị đặc trưng của 90 thành phần trong phân tích PCA

Bảng 3.3: Thống kê các chỉ số đa dạng di truyền của 21 locus SSR 83

Bảng 3.4: Kết quả đánh giá đa dạng di truyền giữa 9 quần thể chè 85

Bảng 3.5: Khoảng cách di truyền giữa 9 quần thể chè nghiên cứu 87 Bảng 3.6: Giá trị đặc trưng của 96 thành phần trong phân tích PCA

Danh mục hình ảnh minh họa

Trang

Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê

Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B) 10

Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc (C.sinensis var sinnensis) 12 Hình 1.4: Cây chè Assam (C sinensis var assamica) 13 Hình 1.5: Cây chè Cambod (C sinensis var assamica sub sp

lasiocalyx) 13

Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè

(C sinensis var sinensis) 15

Hình 1.7: Kích thước biến thiên của lá chè 16

Hình 1.8: Biểu đồ sản lượng chè khô của một số nước năm 2005, 2006

Hình 1.13: Đa hình DNA SSR giữa hai cá thể có motif (AT)n 37

Hình 1.14: Quy trình phát triển chỉ thị SSR từ thư viện hệ gen 39

Hình 2.1: Phân loại chè Cambod dựa trên tỷ lệ nguồn gen 63

Hình 3.4: Cây chè dạng thân gỗ 66 Hình 3.5: Cây chè dạng thân bụi 67 Hình 3.6: Sơ đồ cây phân nhóm 90 giống/dòng chè dựa trên

Hình 3.7: Phân tích PCA 90 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè dựa

trên ma trận khoảng cách di truyền Euclidean

Porebski) 74

Hình 3.9: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Hình 3.10: Ảnh điện di xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Hình 3.11: Kết quả nhận dạng di truyền 96 giống/dòng chè

Hình 3.14: Sơ đồ phân nhóm di truyền 9 quần thể chè

Hình 3.15: Phân tích PCA biểu diễn quan hệ nhóm của 9 quần thể chè

trong không gian ba chiều 88

Hình 3.16: Sơ đồ cây phân loại 96 giống/dòng chè

Hình 3.17: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè

Hình 3.18: Sơ đồ cây phân nhóm 96 giống/dòng chè

Hình 3.19: Phân tích PCA 96 giống/dòng chè thuộc 9 quần thể chè

Hình 3.20: Cây phân nhóm 96 giống/dòng chè

dựa trên khoảng cách di truyền Nei72

(xây dựng bằng phần mềm PHYLIP 3.69 và Dendroscopes) 105

MỞ ĐẦU

Chè (trà) không chỉ là thức uống giải khát hàng ngày mà còn là một nét văn hóa đặc trưng, một thứ nghệ thuật (Trà đạo) của người dân châu Á Cùng với cà phê và ca cao, chè là một trong ba loại đồ uống có nguồn gốc tự nhiên không chứa cồn được cả thế giới ưa chuộng Hơn hai phần ba dân số thế giới uống chè hàng ngày không chỉ bởi hương vị đặc sắc mà còn vì những lợi ích cho sức khỏe mà chè mang lại Từ những kinh nghiệm dân gian cho đến các nghiên cứu khoa học gần đây đã khẳng định giá trị của cây chè đối với sức khỏe

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là

loại cây trồng lưu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao Năm 2003, diện tích trồng chè trên toàn thế giới đã lên tới 2,7 triệu ha với tổng sản lượng chè khô khoảng 3 triệu tấn [47] Trước nhu cầu tăng nhanh

cả về năng suất và chất lượng, công tác chọn tạo giống chè đã được đẩy mạnh, nhiều giống chè mới đã được tạo ra, đặc biệt ở các nước Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc… Tuy nhiên, do đặc điểm nông- sinh học khác biệt của cây chè nên công tác chọn tạo bằng phương pháp lai tạo hữu tính giữa các cặp bố mẹ được chọn lựa dựa trên kiểu hình gặp rất nhiều khó khăn Để có được những dòng triển vọng thì các nhà chọn giống sẽ phải tiêu tốn rất nhiều thời gian, công sức và cần có những điều kiện cơ sở vật chất khác Trong khoảng 20 năm trở lại đây, với việc ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống đã khắc phục được những trở ngại trong phương pháp chọn tạo truyền thống Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử- MAS (Molecular-Assisted Selection) đang được áp dụng rộng rãi không chỉ trong chọn tạo giống cây trồng mà còn

cả trong chăn nuôi Nhờ các chỉ thị phân tử mà các nhà khoa học xác định được sự khác biệt về mặt di truyền của quần thể giống khởi đầu, từ đó xác định các cặp lai có khoảng cách di truyền phù hợp có thể cho ưu thế lai cao nhất Việc tiếp cận ở mức độ phân tử cho phép đánh giá các giống bố mẹ một cách chính xác, không bị tác động bởi các điều kiện ngoại cảnh, rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả công tác lai tạo

Ở Việt Nam, cây chè và các sản phẩm từ chè đã được người dân trồng và chế biến từ lâu Nước ta có nhiều vùng trồng và chế biến chè nổi tiếng như Mộc Châu, Thái Nguyên hay B’lao- Lâm Đồng, cùng với nhiều giống chè quý như chè Shan ở Hà Giang, Suối Giàng; chè Tân Cương ở Thái Nguyên… Bên cạnh đó, nhằm đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành sản xuất chế biến chè, nhiều giống/dòng chè đã được nhập từ các nước trên thế giới như Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc, Nhật Bản… Đây là nguồn vật liệu rất có giá trị đối với chương trình chọn tạo giống chè

Hiện nay cây chè được xác định là một trong những cây trồng chủ lực trong quy hoạch phát triển kinh tế các tỉnh trung du và miền núi phía Bắc nước ta Tuy nhiên, để thâm canh cây chè đạt hiệu quả cao, tránh lãng phí trong đầu tư ban đầu thì việc phải có những giống chè cho năng suất cao, chất lượng tốt, phù hợp với điều kiện khí hậu- thổ nhưỡng là một yêu cầu cần được quan tâm Trong bối cảnh đó, công tác đánh giá đa dạng di truyền cây chè ở nước ta- có vai trò rất quan trọng trong khai thác hiệu quả nguồn gen, vẫn còn nhiều hạn chế Cho đến nay việc nghiên cứu đánh giá sự đa dạng nguồn gen cây chè trên quy mô lớn để có thể cung cấp cơ sở di truyền ban đầu và hỗ trợ cho công tác chọn tạo giống chè còn rất khiêm tốn Vì vậy, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền các

giống/dòng chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ

thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite (SSR)” với mong muốn có

được cái nhìn tổng quan về sự đa dạng di truyền của các giống/dòng chè ở Việt Nam

Để đạt được mục tiêu của đề tài, chúng tôi đã tiến hành những nội dung nghiên cứu sau:

1 Dựa trên một số chỉ tiêu chính, đánh giá đặc điểm hình thái của các giống/dòng chè thuộc các quần thể chè được bảo tồn ở vườn quỹ gen chè- Viện Khoa học Kỹ thuật Nông-Lâm nghiệp miền núi phía Bắc (NOMAFSI)

2 Nhận dạng di truyền các giống/dòng chè bằng chỉ thị phân tử SSR

3 Phân tính đánh giá sự đa dạng di truyền của các giống/dòng chè dựa trên kết quả đánh giá hình thái

4 Phân tích đánh giá sự đa dạng di truyền của các quần thể chè; của các giống /dòng chè bằng chỉ thị phân tử SSR

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ là cơ sở dữ liệu hữu ích trong phân loại các giống/dòng chè, hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống chè mới năng suất cao, chất lượng tốt, góp phần thúc đẩy phát triển ngành sản xuất-chế biến chè nước ta

Chè từ lâu đã quen thuộc với đời sống của người dân các nước châu Á

Các tài liệu của Trung Quốc đều cho rằng cây chè được phát hiện một cách

tình cờ bởi Thần Nông (một vị vua trong truyền thuyết) vào khoảng năm 2737

trước Công nguyên Tuy nhiên, cũng có những giả thuyết cho rằng ngay khi

người Trung Quốc biết đến các giá trị y học của cây chè thì nhu cầu về các

sản phẩm từ chè đã nảy sinh và cùng với đó là sự ra đời ngành trồng và chế

biến chè ở tỉnh Tứ Xuyên- Trung Quốc từ cách nay khoảng 3000 năm Về

sau, kiến thức về canh tác cây chè đã được phổ biến rộng rãi cùng với những

cuộc hành hương và di cư của các tín đồ đạo Phật, từ rất lâu trước khi sự phát

tán cây chè được ghi nhận

Tại Ấn Độ năm 1823, thiếu tá Robert Bruce tìm thấy cây chè dại đầu tiên

ở tỉnh Assam, nhưng cho đến năm 1834, các hạt giống chè vẫn được nhập từ

Trung Quốc (bởi Gordon) để phục vụ nhu cầu thành lập các vườn trồng chè

thương mại Về sau, các cây chè bản xứ đã được đưa vào trồng nhiều hơn nhờ

C.A Bruce, người quản lý trang trại chè thuộc chính phủ Anh tại thuộc địa

Ấn Độ Lợi ích thương mại từ cây chè ngày càng gia tăng và cho đến

12-02-1839, công ty chè đầu tiên- Công ty chè Assam- đã được thành lập ở Jorhat,

Assam dưới sự điều hành của Nghị viện Anh Đây chính là mốc đánh dấu sự

ra đời ngành công nghiệp chè ở Ấn Độ cũng như trên thế giới [47] Hiện nay

trên toàn thế giới đã có hơn 30 quốc gia trồng và sản xuất chè, trong đó tập

trung chủ yếu ở các nước châu Á với năng suất chiếm hơn 85% tổng sản lượng chè thế giới (hình 1.1)

Tại Việt Nam, cây chè và sản phẩm từ chè đã được người dân sản xuất, chế biến và sử dụng từ rất lâu Cho đến trước khi thực dân Pháp đô hộ nước

ta, cây chè đã được trồng chè khá phổ biến (đặc biệt ở miền Bắc) nhưng chủ yếu là tự phát nhằm đáp ứng nhu cầu tại chỗ của người dân Đến thời kỳ đô

hộ của thực dân Pháp (1982-1945), chè là nguồn tài nguyên mà thực dân rất chú ý bóc lột để chuyển về châu Âu, nơi mà chè là món hàng xa xỉ cao cấp

Từ đầu thế kỷ 20, Pháp đã lập ra các trạm nghiên cứu và đồn điền trồng chè ở Phú Hộ (Phú Thọ- 1918), Pleiku (1927) và Bảo Lộc (Lâm Đồng- 1931) nhằm tăng cường mở rộng sản xuất chè để phục vụ chính quốc, nhờ đó mà cây chè Việt Nam được khảo sát nghiên cứu khá kỹ lưỡng và ngành sản xuất chế biến chè được mở rộng Theo Nguyễn Ngọc Kính, lịch sử của ngành sản xuất chè Việt Nam có thể chia ra ba giai đoạn chính:

• Giai đoạn từ 1890 đến 1945: Những đồn điền chè đầu tiên được thiết lập, sản xuất chè bước vào quy mô tập trung Đến năm 1938, diện tích trồng chè lên đến hơn 13 nghìn hecta với sản lượng đạt 6100 tấn chè khô

• Giai đoạn từ 1945 đến 1954: Do ảnh hưởng của chiến tranh, ngành sản xuất chè suy giảm mạnh, tổng sản lượng chè khô năm 1946 chỉ đạt

300 tấn

• Giai đoạn từ 1954 đến nay: giai đoạn phát triển không ngừng của ngành chè, không chỉ đáp ứng nhu cầu nội địa mà còn hướng tới xuất khẩu Năm 2008 cả nước có hơn 131 nghìn hecta trồng chè với sản lượng hơn đạt hơn 160 nghìn tấn chè khô

Hiện nay, chè được trồng ở trên 30 tỉnh thành trong cả nước, tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (cả về diện tích và sản lượng) Với lợi thế về

giống, đất đai và nguồn lao động, chè được xác định là ngành kinh tế chủ đạo

ở các tỉnh trung du và miền núi nước ta [2, 6, 78]

1.1.2 Nguồn gốc và phân bố của cây chè

Cho đến nay, nguồn gốc phát sinh chính xác của cây chè vẫn còn là đề tài tranh cãi của các nhà nghiên cứu Tuy nhiên, tất cả đều khẳng định rằng Đông Nam Á là quê hương khởi nguồn của cây chè Theo Wight (1959), xuất phát điểm nguyên thủy của cây chè được cho là ở khoảng 29 độ vĩ Bắc và 98

độ kinh Đông, thuộc vùng thượng nguồn sông Irrawaddy- là vùng đất giao nhau giữa Assam, bắc Myanmar, tây nam Trung Quốc và Tây Tạng Trong khi đó, trong một nghiên cứu công bố sớm hơn, Kingdon và Ward (1950) lại cho rằng xuất phát điểm của cây chè là ở đông nam Trung Quốc, vùng tiếp giáp với hai bang Mizoram và Meghalaya ở đông bắc Ấn Độ (tỉnh Vân Nam) Bởi vậy, các khu vực địa lý trên đều được xem như là nơi khởi nguồn và phát

tán của chi Camellia nói chung (Sealy, 1958) [46, 47] Khoảng 20 năm sau,

trong những nghiên cứu phân loại cây chè dựa trên thành phần catechin, Djemukhatze (1961-1976) đã kết luận rằng thành phần catechin chủ yếu của các giống chè dại Việt Nam đơn giản và gần giống nhất với các giống chè mọc hoang dại từ cổ xưa Từ đó ông đưa ra kết luận mới: nguồn gốc của cây chè chính là ở Việt Nam [1, 2, 78]

Các kết luận trên có được từ những nghiên cứu khác nhau và mặc dù chưa có một thống nhất cuối cùng về nguồn gốc thì ngày nay cây chè đã được phổ biến rãi tới nhiều quốc gia và vùng địa lý trên thế giới, trải rộng từ 45 độ

vĩ Bắc đến 34 độ vĩ Nam, thích nghi với nhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau và khác xa với khu vực nguyên sản ban đầu (Đông Nam Á) (hình 1.1)

Hình 1.1: Các nước trồng chè dựa vào sản lượng được thống kê năm 2007

Vùng khoanh đỏ là khu vực khởi nguồn và cũng là vùng phân bố tự nhiên

của cây chè

Châu Á: Ấn Độ, Bangladesh, Đài Loan, Hàn Quốc, Indonesisa, Iran,

Malaysia, Myanmar, Nepal, Nhật Bản, Sri-Lanka, Trung Quốc, Việt Nam

Châu Phi: Burundi, Cameroon, Ethipoia, Kenya, Maritius,

Mozambique, Nam Phi, Rwanda, Tanzania, Uganda, Zaire

Nam Mỹ: Argentina, Brazil, Ecuador, Peru

Châu Đại Dương: Australia, Papua-New Ghine

Châu Âu: Thổ Nhĩ Kỳ, USSR

Từ Trung Quốc, quốc gia biết đến chè đầu tiên, cây chè được du nhập vào Nhật Bản trong nửa đầu thế kỷ 8 Đến thế kỷ 17, ngành trồng chè mở rộng từ Nhật Bản sang Indonesia Cây chè lần đầu tiên được trồng ở Srilanka vào năm 1839 từ những hạt giống chè mang đến từ Calcutta (Ấn Độ) Ở các nước thuộc Liên bang Xô Viết trước đây, ngành trồng chè bắt đầu khi hạt giống được nhập từ Trung Quốc vào khoảng cuối thế kỷ 19 Về sau, từ Liên bang Xô Viết, hạt giống chè được xuất khẩu sang Thổ Nhĩ Kỳ những năm 30-

40 của thế kỷ 20 Chè du nhập vào châu Âu năm 1740 thông qua công ty

Đông Ấn của đại úy Goff, nhưng những cây được trồng lưu giữ ở Vườn bách thảo Hoàng gia (Kew- tây nam London, Anh) đã không sống được (Sealy, 1958) Không lâu sau đó, vào năm 1768 nhà tự nhiên học John Ellis và một lái buôn người Anh đã du nhập và trồng thành công cây chè ở châu Âu (Aiton, 1789; Booth, 1830); từ đây, cây chè được du nhập vào các nước châu Phi vào cuối thế kỷ 19 Ngày nay, cây chè đã được trồng ở hơn 52 quốc gia trên toàn thế [47]

1.1.3 Phân loại thực vật và đặc điểm hình thái của cây chè

Carl Linnaeus (1707-1778)- nhà động-thực vật học người Thụy Điển- là người đầu tiên xây dựng hệ thống phân loại thực vật trong đó có cây chè Trong cuốn sách “Các loài thực vật” (The Species of Plant) xuất bản năm

1753, Carl Linnaeus đã đề xuất chi Camellia thay cho Thea như trước đây để tưởng nhớ những đóng góp của Georg Kamel (tên Latin là Camellia ) đối với

ngành thực vật học (Georg Kamel (?-1708) là một thầy tu dòng Jesuit người Czech đã có nhiều khám phá về thực vật trong thời gian truyền giáo ở các nước châu Á như Philippin, Trung Quốc ) Cũng trong cuốn sách này, Carl

Linnaeus đã mô tả hai loài trong chi Camellia là cây chè Camellia sinensis (sinensis trong tiếng Latin có nghĩa là Trung Quốc- lúc đó được cho quê hương của cây chè) và cây chè (hoa) Camellia japonica Đến năm 1958, trong

cuốn chuyên khảo “A Revision of the Genus Camellia”, J Robert Sealy đã hệ

thống lại và định danh cho các loại thực vật liên quan tới chi Camellia đã được nhận dạng vào lúc đó Ông phân chia chi Camellia ra 12 nhóm và mô tả

đặc điểm hình thái của 87 loài [56] Ngày nay, các nhà khoa học thừa nhận

Camellia C L là một chi trong hệ thống phân loại thực vật và tên khoa học chính thức của cây chè là Camellia sinensis (L.) O Kuntze (để tưởng nhớ nhà

thực vật học người Đức Otto Carl Ernst Kuntze, 1843-1907) [16]

Trong chi chè Camellia có đến hơn 100 loài khác nhau [80, 81], bao gồm

những loài tự nhiên và lai tạo Một số loài trong đó có giá trị dược liệu được

sử dụng làm thuốc hoặc mỹ phẩm (Camellia kissii), làm cây cảnh trang trí (Camellia japonica, các loài hoa Trà, hoa hải đường Camellia amplexicaulis

ở Việt Nam) hoặc là nguồn tách chiết tinh dầu (Camellia assimilis) Chỉ có duy nhất loài Camellia sinensis (L.) O Kuntze (cây chè) là được sử dụng

trong sản xuất và chế biến các loại chè làm đồ uống

Do có quá trình phân tán lâu dài giữa các vùng địa lý khác nhau cùng với những tác động của con người (lai tạo, chọn lọc) nên cây chè có sự đa dạng cả

về hình thái và đặc điểm di truyền Vì vậy mà hệ thống phân loại các giống chè còn nhiều điểm chưa được thống nhất Các giống chè ở Việt Nam được khảo sát và phân loại từ khá sớm (những năm 30 của thế kỷ 20) Theo Nguyễn Ngọc Kính (1979), Deuss và Du Pasquire (trước đó là Cohen Stuart, 1919) dựa trên đặc điểm hình thái đã phân chia các giống chè (chủ yếu khảo sát ở Việt Nam, Trung Quốc) thành bốn thứ, bao gồm: [2, 6, 78]:

• Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var macrophylla)

• Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var bohea)

• Chè Shan (Camellia sinensis var Shan)

• Chè Ấn Độ (Assam) (Camellia sinensis var assamica)

Hình 1.2: Phân bố tự nhiên các thứ chè theo Stuart (A) và Barua (B)

Hệ thống phân loại này phân chia các giống chè theo vùng địa lý rất rõ ràng (hình 1.2) Tuy nhiên về sau, khi bản chất di truyền pha trộn của cây chè được nghiên cứu kỹ hơn thì hai thứ chè Trung Quốc lá to và chè Shan được cho là dạng lai giữa hai thứ chè Trung Quốc và Assam Đặc điểm hình thái của chè Trung Quốc lá to (giống với thứ chè Trung Quốc lá nhỏ) và chè Shan (giống với thứ chè Assam) có thể là do sự pha trộn vật chất di truyền không cân bằng tại các vùng địa lý mà chè Trung Quốc lá nhỏ chiếm ưu thế (nam Trung Quốc) hoặc chè Assam chiếm ưu thế (Đông Nam Á)

Hệ thống phân loại các thứ chè theo Stuart hiện nay vẫn được áp dụng rộng rãi ở Việt Nam Tuy nhiên, trên thế giới cách phân loại này ít được sử dụng Một số cơ sở dữ liệu về phân loại thực vật chỉ công nhận chè Trung

Quốc và Assam là hai thứ chè thuộc loài chè Camellia sinensis (L.) O

Kuntze Các thứ chè khác tuy được liệt kê nhưng không được công nhận chính thức Theo cơ sở dữ liệu ITIS (Integrated Taxonomic Information System), cây chè được phân loại như sau [12]:

Camellia sinensis var sinensis

Như vậy, theo cơ sở dữ liệu này, cây chè có hai thứ chính có tên khoa học đã

được công nhận là thứ chè Assam- Camellia sinensis var assamica (Masters) Kitam và thứ chè Trung Quốc- Camellia sinensis var sinensis (L.) Kuntze

[12, 80] Hai giống chè này được phân biệt với nhau bởi đặc điểm hình thái bên ngoài rất dễ nhận biết: Giống chè Assam có nguồn gốc từ Assam- Ấn Độ

có lá to, trong khi đó giống chè Trung Quốc có lá nhỏ

Barua (1963) đã tổng hợp những đặc điểm hình thái của các giống chè (đặc biệt là thân và lá) để thiết lập hệ phân loại chè mới gồm ba thứ: ngoài các thứ chè Assam và chè Trung Quốc còn có thứ chè Cambod [47] Những đặc điểm hình thái chính của ba thứ chè được Barua mô tả như sau:

Thứ chè Trung Quốc (C sinensis var sinensis): có thân dạng bụi (cao

1-3m), có nhiều thân nhỏ phát sinh từ một gốc Lá chè khá nhỏ, mỏng và dai;

có những khí khổng tạo thành vùng hõm trên phiến lá Cuống lá ngắn và mập giúp cho lá có tư thế thẳng đứng và thường mọc thành cụm có từ 3 đến 7 lá (hình 1.3) Hoa chè thứ Trung Quốc

thường là hoa đơn hoặc theo cặp mọc

từ nách lá có cuống dài 6-10mm với

2-3 cặp lá bắc đối xứng nhau Hoa có 7-8

cánh hình chén, các cánh hoa dài 1,5-2

cm và có hình dạng thay đổi từ oval

rộng đến hình cầu với 3-5 vòi nhụy

Quả nang có 1, 2 hoặc 3 ngăn mang

1-3 hạt hình cầu với đường kính khoảng

10-15 mm Camellia sinensis var

sinensis có nguồn gốc từ vùng đông

nam Trung Quốc, là loại được tìm ra và

Hình 1.3: Cây chè Trung Quốc

(C.sinensis var sinensis) 

đưa vào canh tác sớm nhất Các giống chè Trung Quốc là nguyên liệu chủ yếu

Assam thường dài 8-20 cm và rộng

3,5-7,5 cm Hoa thường mọc đơn lẻ

hoặc theo cặp có 3 lá bắc con màu

xanh Hoa có nhiều nhị, 5-6 lá đài bền

với 7-8 cánh hoa màu trắng (hình 1.4)

Camellia sinensis var assamica là thứ

chè bản địa vùng Assam-Ấn Độ được

tìm ra vào thế kỷ 19 Các giống chè

Assam được sử dụng chế biến chè đen

Thứ chè Cambod (C sinensis

var assamica sub sp lasiocalyx):

Thân cây đứng thẳng cao 6-10 m, ít

phân nhánh, các cành thường phát triển

ngang Lá mọc thẳng đứng có màu biến

thiên từ xanh nhạt đến vàng đồng hay

và thứ chè Assam (hình 1.5) Hoa khá giống với chè Assam, có 4 hoặc nhiều hơn lá bắc, có 3-4 noãn với 5 ngăn và 3-5 vòi nhụy Các giống Cambod phổ biến ở khu vực Ấn Độ và Indonesia

Hệ thống phân loại chè của Barua được nhiều nhà khoa học ủng hộ và sử dụng rộng rãi trong các công trình nghiên cứu chè trên thế giới

Ngày nay, số lượng các loài thuộc chi chè Camellia nói chung và các giống thuộc loài chè Camellia sinensis (L.) O Kuntze nói riêng được các nhà

khoa học công bố đã tăng lên rất nhiều, khoảng 267 giống [56] Ngoài một số

loài hoang dại mới được tìm thấy ở các khu vực nguyên sản của chi Camellia

[48] thì hầu hết các giống mới là các giống được lai tạo phục vụ nhu cầu làm

cảnh (các giống làm hoa cây cảnh như Camellia japonica var.) và nâng cao

năng suất ngành sản xuất chè

1.1.4 Đặc điểm di truyền của cây chè Camellia sinensis (L.) O

Kuntze

Mặc dù là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nước trên thế giới nhưng cho đến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về bộ gen của cây chè [63] Những nghiên cứu từ trước đến nay đã cho kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên

cứu của Hanson cho thấy kích thước bộ gen 4C DNA của cây chè Camellia sinensis khoảng 15,61±1,06 pg Do 1C DNA tương đương với 3824 Mbp và

1pg= 980Mbp nên kích thước bộ gen chè theo kết quả của Hanson vào khoảng 15.298 Mbp [47] Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [63] Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n=30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biến đổi

khác nhau giữa các giống chè [36] (hình 1.6); điều này đã khẳng định lại kết quả nghiên cứu của Bezbaruah (1971) với các giống chè Ấn Độ [47]

Hình 1.6: Tiêu bản nhiễm sắc thể ở kỳ giữa của cây chè

(C.sinensis var sinensis)

Kiểu nhân 1: 2n=30=18m=12sm

Kiểu nhân 2: 2n=30=21m+6sm+2sm sat +1 st

Kiểu nhân 3: 2n=30=21m+2m sat +5sm+2sm sat

Kiểu nhân 4: 2n=30=20m+10sm

Kiểu nhân 5: 2n=30=18m+2m sat +6sm+1sm sat +2st+1st sat

Kiểu nhân 6: 2n=30=18m+8sm+4sm sat

(m= metacentric- tâm cân, sm= submetacentric- tâm lệch, st= subtelocentric- tâm cận mút, t= telocentric- tâm mút) [36]

Nói chung, các nhiễm sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu hướng

kết lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh

ngắn của nhiễm sắc thể) của 15 cặp nhiễm sắc thể trong khoảng 1,00 đến

1,91 Sự đồng nhất của các nhiễm sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc điểm cùng

nguồn (monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia Bên cạnh thể lưỡng

bội, nhiều thể đa bội của cây chè (phần lớn do lai tạo) cũng đã được ghi nhận,

ví dụ như thể tam bội 2n=45 (TV-29, UPASI-3, UPASI-2…), tứ bội 2n=60, ngũ bội 2n=75 và thể bội không hoàn chỉnh (aneuploid) 2n±1 (Singh, 1980; Zhan và cs, 1987) [36, 47, 63]

Do quá trình lai chéo xảy ra phổ biến giữa các loài thuộc chi Camellia

nên đã tạo ra các con lai ở trạng thái chuyển giao mang vật chất di truyền lẫn

tạp; cây chè Camellia sinensis cũng không nằm ngoài xu hướng này Các cây

chè lai có những đặc điểm hình thái từ giống thứ chè Trung Quốc (lá nhỏ) đến dạng trung gian rồi giống thứ chè Assam (lá to) (hình 1.7); đến nay, rất nhiều giống chè lai được xếp vào một trong các thứ chè Trung Quốc, Assam hay Cambod dựa vào tính tương đồng về kiểu hình của chúng với các thứ chè này

Hình 1.7: Kích thước lá biến thiên từ nhỏ (thứ chè Trung Quốc- 1, 2) đến lớn

(thứ chè Assam 6, 7) Thứ chè Cambod có kích thước lá trung gian (3, 4, 5)

Cây chè có thể lai tốt với các giống hoang dại, do đó các nhà phân loại học luôn quan tâm xác định các cá thể lai này bởi qua đó có thể xác định được

sự tham gia hình thành nên vốn gen (gene pool) cây chè của các giống hoang

dại Có hai loài được đặc biệt quan tâm là C irrawadiensis và C taliensis vốn

có đặc điểm hình thái tương đồng với cây chè Một số loài khác thuộc chi

Camellia cũng được cho là góp phần hình thành nên vốn gen của cây chè thông qua quá trình lai tự nhiên như C flava, C.petelotii và C lutescens, trong

đó C taliensis được cho là dạng lai giữa C.sinensis và C irrawadiensis Cho đến nay, các nhà khoa học cho rằng ba thứ chè C.assamica; C.sinensis; C assamica sub sp lasiocalyx và ở chừng mực nào đó là C.irrawadiensis đều là

các nhân tố chính tham gia hình thành nên vốn gen của cây chè Có một thực

tế là rất khó xác định liệu có tồn tại hay không một giống chè tự nhiên mang vật chất di truyền nguyên trạng không bị pha trộn Bởi vậy khái niệm “cây chè” bao trùm toàn bộ các giống, dòng là con lai của các thứ chè này [47]

1.1.5 Ngành sản xuất, chế biến chè trên thế giới và Việt Nam

Hơn 300 năm sau khi chè từ châu Á du nhập vào châu Âu, nhu cầu của thị trường thế giới về các sản phẩm từ chè đã tăng vọt và kéo theo đó là sự phát triển mạnh mẽ của ngành sản xuất và chế biến chè Từ vùng nguyên sản Đông Nam Á, đến nay trên thế giới đã có hơn 52 quốc gia sản xuất và chế biến chè [47] Chè với vai trò là đồ uống đã được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm như chè đen, chè xanh, chè trắng, chè Ô Long; cách thức pha chế và thưởng thức chè cũng rất đa dạng, từ pha hãm truyền thống đến các loại chè túi lọc tiện lợi và nhanh chóng Bên cạnh đó, lá chè với nhiều thành phần có lợi cho sức khỏe cũng được sử dụng làm thuốc, mỹ phẩm…

Năm 2007, tổng sản lượng chè trên toàn thế giới đạt trên 3,5 triệu tấn, trong đó Trung Quốc và Ấn Độ là hai trong số những quốc gia có sản lượng

chè lớn nhất thế giới [67] Với giá niêm yết trên các sàn giao dịch chè khoảng

2 USD cho một kg, thì giá trị tổng sản lượng chè (dưới dạng chè khô) trên toàn thế giới ước đạt 7 tỉ USD Việt Nam được xếp vào nhóm 10 quốc gia sản xuất, chế biến và xuất khẩu chè lớn nhất thế giới (hình 1.8)

Hình 1.8: Biểu đồ sản lượng chè khô của một số nước năm 2005, 2006

và 2007 (số liệu theo thống kê của ITC London-2008 [67])

Hình 1.9: Biểu đồ khối lượng sản xuất và xuất khẩu chè khô của một số

nước năm 2007 (số liệu theo thống kê của ITC London-2008 [67])

Một điều khá thú vị là nếu xét theo tỷ lệ xuất khẩu/tổng sản lượng thì Trung Quốc, Ấn Độ là các quốc gia có sản lượng chè cao và cũng là những nước xuất khẩu chè ít hơn cả Bởi vì chè không chỉ là thức uống quen thuộc hàng ngày mà còn là một nét văn hóa đặc trưng của các quốc gia này (hình 1.9)

Mặc dù là loại cây trồng có giá trị thương mại cao nhưng do hạn chế về diện tích đất canh tác và điều kiện khí hậu nên diện tích trồng chè không được

mở rộng đáng kể Chính vì lẽ đó, để nâng cao sản lượng cũng như chất lượng chè thì biện pháp tối ưu nhất chính là tạo ra các giống chè mới đáp ứng được các yêu cầu về cả lượng và chất Từ các giống chè hiện có, công tác lai tạo chè từ lâu đã rất được chú ý đầu tư Ở một số quốc gia như Ấn Độ, Srilanka, Trung Quốc, Nhật Bản, Việt Nam… có các trung tâm nghiên cứu về chè là nơi tiến hành các nghiên cứu lai tạo ra các giống chè mới và cũng đã đưa nhiều giống có năng suất, chất lượng tốt ra trồng sản xuất đại trà

1.1.6 Công tác lai tạo giống chè

Hiện nay, công tác lai tạo nhân giống chè được tiến hành rất phổ biến ở các quốc gia trồng chè với mục tiêu không chỉ tạo ra giống chè mới năng suất cao, chất lượng tốt mà còn với số lượng lớn phục vụ sản xuất Ngoài các phương pháp truyền thống như lai hoa lấy hạt, giâm ghép…, với sự phát triển khoa học kỹ thuật- nhất là công nghệ sinh học, thì nhiều công nghệ mới đã được áp dụng cho hiệu quả vượt trội so với các phương pháp truyền thống

1.1.6.1 Phương pháp truyền thống

Chương trình lai tạo giống chè giữa các quốc gia, khu vực rất khác nhau, dựa trên yêu cầu thực tế của từng nơi nhưng đều hướng tới mục tiêu nâng cao năng suất và cải thiện chất lượng Ở các vùng sản xuất chè đen như Kenya, Srilanka, Ấn Độ chương trình lai tạo giống chè chú trọng đến tạo giống cho

năng suất và chất lượng búp cao, trong khi các vùng sản xuất chè khác (Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc) lại tập trung nâng cao tính chống chịu lạnh, sương muối và các điều kiện bất lợi khác… Các phương pháp lai tạo giống chè truyền thống như lai hữu tính, lai đa bội, lai khác loài… được áp dụng khá phổ biến; nhìn chung có thể quy về hai hướng chính là chọn lọc từ quần thể chè triển vọng và lai tạo giữa các giống chè tiềm năng

Chọn lọc cá thể là phương thức đã được áp dụng từ rất lâu, nhất là đối với các giống chè nhập nội nhằm thu được các dòng chè mới không chỉ mang những ưu điểm về năng suất- chất lượng của giống gốc mà còn thích ứng tốt với điều kiện vùng sinh thái mới Dựa vào đặc điểm hình thái (tương ứng với những chỉ tiêu năng suất, chất lượng) các dòng chè triển vọng trong quần thể vật liệu ban đầu được chọn lựa, cho tự thụ để thu hạt và gieo trồng thế hệ sau

Cứ qua mỗi thế hệ, các cá thể tốt nhất, đồng đều không mang biến dị sẽ được lựa chọn làm đầu dòng cho các bước tiếp theo Quá trình chọn lọc cứ như vậy kéo dài qua nhiều thế hệ (2, 3 hoặc hơn) có thể thu được các dòng chè triển vọng áp dụng cho sản xuất đại trà Đã có khá nhiều giống/dòng chè tốt được tạo ra theo hướng này như giống Đại Bạch Trà- Trung Quốc (chọn lọc từ quần thể chè Kỳ Môn), giống TRI 777- Srilanka (chọn lọc từ giống chè Shan Chồ Lồng- Mộc Châu, Việt Nam) Ở Việt Nam, nhiều giống/dòng chè tiềm năng cũng đã được chọn lọc như TB11, TB14 (chọn lọc từ chè Shan Pousang- Lào); các giống PH1, 1A, F23 được chọn lọc từ các giống chè Ấn Độ [6] Cùng với chọn lọc cá thể, lai hữu tính cũng là hướng tiếp cận phổ biến trong công tác chọn tạo giống chè Dựa trên các đánh giá đặc điểm hình thái

và đặc tính nông học (nguồn gốc sinh thái, đặc tính số lượng, đặc tính chất lượng, tính kháng bệnh, tính chống chịu điều kiện bất lợi…) các nhà tạo giống thường lựa chọn cặp lai mà cây bố mang những ưu điểm mà cây mẹ không có (và ngược lại) Về mặt lý thuyết thì cây con tạo ra sẽ mang những đặc tính tốt

của cả cây bố lẫn cây mẹ (nếu bố mẹ mang kiểu gen thuần chủng quy định những tính trạng quan tâm) Nếu bố mẹ không thuần chủng thì các con lai có những biến dị với kiểu hình rất khác nhau Lúc này bằng các phương pháp chọn lọc cá thể có thể thu được giống mới đáp ứng yêu cầu ban đầu [6, 46] Ở Việt Nam có một số giống chè đã được tạo ra theo hướng này như LDP1, LDP2 (chọn lọc từ cặp lai Đại Bạch Trà (Trung Quốc) và PH1); Phúc Vân Tiên (chọn lọc từ cặp lai Đại Bạch Trà và Vân Nam lá to) [6]

Do đặc điểm di truyền và nông-sinh học riêng biệt của cây chè mà phương pháp lai tạo truyền thống thường tốn nhiều thời gian và công sức (thời gian sinh trưởng đạt tới lúc ổn định khoảng 2-3 năm) Bên cạnh đó chè còn là loài có đặc điểm hình thái biến đổi theo tiểu vùng khí hậu nên các đánh giá kiểu hình thường có sai lệch, không đảm bảo chính xác để làm cơ sở chọn cặp lai và sàng lọc con lai

1.1.6.2 Áp dụng công nghệ sinh học trong chọn tạo giống chè

Trong khoảng vài năm trở lại đây, công nghệ sinh học đã dần được áp dụng trong chọn tạo giống chè Nhằm khắc phục những điểm yếu của phương pháp truyền thống, công nghệ sinh học đã hỗ trợ hoặc thay thế một số công đoạn trong chiến lược chọn tạo giống, phổ biến nhất là hai mảng công nghệ chỉ thị phân tử và nuôi cấy mô phôi tế bào [46, 47]:

• Áp dụng chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền các giống chè, hỗ trợ chọn lựa cặp lai phù hợp; nhận dạng di truyền các giống chè

và đặc biệt đóng vai trò quan trọng trong chọn giống phân tử MAS

• Áp dụng công nghệ cứu phôi nhằm nâng cao tỷ lệ sống sót của

các phôi lai và công nghệ nhân giống vô tính in vitro nhân nhanh hàng loạt

cây con

Với những ưu điểm vượt trội, công nghệ sinh học đang ngày càng được

áp dụng phổ biến trong nghiên cứu và chọn tạo giống chè Tuy nhiên, ở Việt Nam lĩnh vực này còn chưa nhận được sự quan tâm thích đáng

1.2 CHỈ THỊ TRONG ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

Đa dạng sinh học là vấn đề rất được quan tâm hiện nay Gìn giữ và bảo tồn đa dạng sinh học là mục tiêu sống còn trong việc duy trì cân bằng sinh thái, đảm bảo môi sinh của các sinh vật trên Trái đất, trong đó có con người Khái niệm đa dạng sinh học được hiểu theo nhiều cấp, đó có thể là sự đa dạng của các quần xã sinh vật trong hệ sinh thái, là sự đa dạng giữa các loài trong quần xã hay sự đa dạng ở cấp độ di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài Mặc dù là cấp độ thấp nhất, nhưng đa dạng di truyền lại có vai trò vô cùng quan trọng trong tiến hóa và thích nghi của các sinh vật; mọi biến động

ở cấp độ đa dạng di truyền đều có những tác động đến những cấp độ cao hơn

và cuối cùng là ảnh hưởng đến đa dạng sinh học [61]

Đa dạng di truyền là kết quả của quá trình biến đổi trong vật chất di truyền sinh vật (trình tự DNA, số lượng cấu trúc nhiễm sắc thể) theo các con đường tự nhiên (lai, phân ly-tái tổ hợp, đột biến tự nhiên ) hay bởi bàn tay con người (lai-chọn tạo giống, gây đột biến, chuyển gen…) Tất cả những quá trình này gây nên những biến đổi trong gen và tần số alen, dẫn đến những thay đổi trong kiểu hình của sinh vật

Đa dạng di truyền có vai trò và ý nghĩa hết sức quan trọng trong công nghệ sinh học nông nghiệp Từ những kết quả đánh giá đa dạng di truyền, các nhà khoa học có thể quy hoạch và bảo tồn các nguồn gen quý nhằm duy trì đa dạng sinh học hoặc hỗ trợ quá trình lai-chọn tạo giống thông qua chọn lựa các cặp bố mẹ trong các phép lai nhằm thu được ưu thế lai cao nhất Trên nhiều đối tượng thực vật, nghiên cứu đa dạng di truyền đã được thực hiện từ khá lâu

với nhiều phương pháp tiếp cận khác nhau, thông qua các dữ liệu kiểu hình (chỉ thị hình thái), thành phần protein và hoạt chất (chỉ thị hóa sinh) hay sự khác biệt (đa hình) trong DNA (chỉ thị DNA) Mỗi loại chỉ thị đều có những ưu- nhược điểm cũng như khả năng đánh giá mức độ đa dạng di truyền khác nhau Trong đó, chỉ thị hình thái được sử dụng sớm nhất và là cơ sở ban đầu trong đánh giá phân loại sinh vật, còn chỉ thị hóa sinh và đặc biệt chỉ thị DNA hiện nay được sử dụng rộng rãi nhất không chỉ trong đánh giá đa dạng di truyền mà còn là công cụ hữu hiệu hỗ trợ công tác chọn tạo giống

1.2.1 Chỉ thị hình thái

Trước đây, sự đa dạng giữa các cá thể trong quần thể và giữa các quần thể được xác định thông qua đánh giá các đặc điểm hình thái nổi trội (hình dạng, kích thước, đặc điểm các bộ phận…) Với ưu điểm như dễ dàng tiếp cận

và nghiên cứu, không đòi hỏi thiết bị đặc biệt cũng như quy trình thực hiện phức tạp, chỉ thị hình thái được sử dụng khá rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật Trong đánh giá và chọn tạo giống truyền thống, chỉ thị hình thái được áp dụng phổ biến và khá hiệu quả ở một số loại cây trồng như lúa, ngô, đậu tương… [9]

Tuy nhiên, còn có những nhược điểm ảnh hưởng đến tính chính xác cũng như hiệu quả của chỉ thị hình thái Thứ nhất, số lượng chỉ thị rất hạn chế (so với các loại chỉ thị khác) trong khi các đặc điểm hình thái lại chịu tác động rất lớn của môi trường cũng như phụ thuộc vào giai đoạn sinh trưởng phát triển của đối tượng nghiên cứu Mức độ tin cậy của công tác đánh giá đa dạng di truyền phụ thuộc vào số lượng các chỉ thị được xét tới, do số lượng chỉ thị hình thái không đủ nhiều nên kết quả thu được cũng không chính xác Bên cạnh đó, do tính biến thiên của các đặc điểm hình thái theo điều kiện môi trường và giai đoạn sinh trưởng nên kết quả thường có sự sai lệch giữa các lần

đánh giá hoặc trong điều kiện đánh giá khác nhau Thứ hai, việc đánh giá kiểu hình mang tính chất thống kê nên cần thực hiện trên số lượng lớn đối tượng

để đảm bảo độ chính xác Chính vì vậy sẽ cần diện tích đất đai lớn cũng như nhiều nhân lực và thời gian để gieo trồng và đánh giá đối tượng Cuối cùng,

do đặc điểm dựa trên kiểu hình để đánh giá kiểu gen nên chỉ thị hình thái không thể là thước đo chính xác để đánh giá tính đa dạng di truyền giữa các

cá thể, nhất là khi không phải toàn bộ các gen đều thể hiện ra kiểu hình có thể

đo đếm được

Hiện nay, tuy có nhiều nhược điểm và trong bối cảnh chỉ thị DNA được

sử dụng phổ biến hơn, nhưng chỉ thị hình thái vẫn được áp dụng khá hiệu quả trong đánh giá đa dạng di truyền (đặc biệt đối với các đối tượng mà chỉ thị phân tử chưa có nhiều) hoặc trong nghiên cứu lập bản đồ liên kết phục vụ chọn tạo giống cây trồng như ở lúa (Lã Tuấn Nghĩa và cs, 2000; Zeng và cs, 2003) [4, 79], ngô (Hugo và cs, 2005) [28]…

1.2.2 Chỉ thị hóa sinh

Protein và các hoạt chất trao đổi khác là sản phẩm của quá trình biểu hiện gen ở sinh vật Nghiên cứu sự khác biệt trong thành phần của các sản phẩm này có thể giúp xác định những khác biệt về mặt di truyền giữa các cá thể và loài khác nhau Bush và cs (1978) khẳng định điện di protein trên gel là phương pháp hữa hiệu có thể giúp phân biệt, nhận diện giữa các loài và phân loại sinh vật Các protein, sản phẩm trao đổi chất… được sử dụng như những chỉ tiêu đánh giá, phân biệt các sinh vật được gọi là chỉ thị hóa sinh Chỉ thị hóa sinh được sử dụng phổ biến nhất là các isozyme (các enzyme có trình tự amio acid khác nhau nhưng cùng xúc tác cho một phản ứng hóa học) Isozyme được trích ly, tinh sạch và điện di trên gel Các thành phần trong gel biến tính (thường là SDS) phá vỡ các cấu trúc bậc cao của chuỗi amino acid

và khi đó dưới tác động của điện trường, các isozyme biến tính sẽ phân tách trên gel dựa trên khối lượng và độ tích điện Từ sự đa hình giữa các băng điện

di thu được sẽ giúp nhận diện từng các thể và đánh giá được sự đa dạng trong quần thể nghiên cứu

So với chỉ thị hình thái thì chỉ thị hóa sinh đáng tin cậy hơn bởi mỗi protein là sản phẩm của một gen, do đó sự đa hình các protein cũng phản ánh gián tiếp sự đa hình trong kiểu gen của sinh vật Tuy nhiên, đối với các cá thể

có quan hệ di truyền gần gũi (đặc biệt là giữa các giống cây trồng) thì các sản phẩm biểu hiện gen (protein, enzyme ) không cho sự đa hình rõ ràng Đây là một nhược điểm của chỉ thị hóa sinh cùng với tính không độc lập với điều kiện môi trường (do quá trình biểu hiện gen thay đổi ở các điều kiện sinh trưởng khác nhau) và số lượng chỉ thị đa hình không phong phú Bởi vậy trong hầu hết những nghiên cứu đa dạng di truyền ngày nay, chỉ thị DNA được sử dụng phổ biến hơn cả

1.2.3 Chỉ thị DNA

Đầu những năm 80 của thế kỷ 20, kỹ thuật RFLP ra đời và được biết đến

là loại chỉ thị mới-chỉ thị DNA thế hệ đầu tiên- với những ưu điểm vượt trội

so với những chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa sinh đang được sử dụng trong đánh giá đa dạng di truyền lúc đó (Botstein, 1980) Tuy nhiên mốc đánh dấu quan trọng nhất của công nghệ chỉ thị phân tử nói riêng và sinh học phân tử nói chung chính là phát minh phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chains Reaction- PCR) của Karl Mullis (1983) Với khả năng tạo ra vô số bản sao của một đoạn DNA chỉ từ một vài phân tử DNA ban đầu, đây là phát minh mang tính bước ngoặt, làm thay đổi hoàn toàn cách thức tiếp cận- nghiên cứu sinh học phân tử và là cơ sở nền tảng ra đời cho thế hệ chỉ thị phân tử tiếp theo

PCR là phản ứng nhân gen in-vitro, dựa trên hoạt tính của loại enzyme

DNA polymerase chịu nhiệt Phản ứng PCR chuẩn có ba giai đoạn nhiệt độ được kiểm soát bởi máy gia nhiệt Thành phần phản ứng bao gồm :

1 Đệm phản ứng, thường chứa Tris-HCl, KCl và MgCl2

2 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt có khả năng gắn nucleotide vào đầu 3’ của đoạn mồi gắn với DNA khuôn sợi đơn

3 Bốn loại deoxyribocnucleotide triphosphate (dNTP) là dATP, dCTP, dGTP và dTTP

4 Hai đoạn mồi oligonucleotide được thiết kế bổ sung đặc hiệu với đoạn DNA cần nhân lên

5 DNA khuôn

Nguyên lý của phản ứng PCR được thể hiện ở hình 1.10

Dựa trên nguyên lý của

phản ứng PCR, sử dụng các

loại mồi oligonucleotide khác

nhau (mồi ngẫu nhiên, mồi đặc

hiệu) nhằm nhân lên các vùng

trình tự DNA, nhiều chỉ thị

DNA đã được phát triển và

ứng dụng trong nghiên cứu đa

dạng di truyền như RAPD

1998)… [26] Các chỉ thị này đã được ứng dụng và mang lại những kết quả đáng tin cậy, có giá trị không chỉ với nghiên cứu đa dạng di truyền mà còn với nhiều lĩnh vực công nghệ sinh học nông nghiệp khác

Nghiên cứu tổng hợp của Joshi (1999) và Weising (2005) đã đề ra những đặc điểm và cũng là tiêu chuẩn cho các loại chỉ thị DNA như sau:

1 Có mức độ đa hình cao

2 Di truyền đồng trội (cho phép phân biệt cá thể đồng hợp tử- dị hợp tử)

3 Phân định rõ ràng giữa các alen

4 Tần suất xuất hiện trong hệ gen cao

5 Phân bố đều trên hệ gen

6 Có trạng thái trung tính (không chịu tác động đa gen)

7 Dễ dàng tiếp cận đánh giá

8 Có thể phân tích nhanh và đơn giản

9 Khả năng tái lặp cao

10 Kết quả có thể trao đổi dễ dàng giữa các cơ sở nghiên cứu

11 Có chi phí phát triển và thực hiện thấp

Cho đến nay có thể khẳng định rằng không một chỉ thị DNA nào có thể đáp ứng được đầy đủ các tiêu chuẩn trên (bảng 1.1) Tuy nhiên hoàn toàn có thể chọn lựa trong số những chỉ thị này một hay một vài chỉ thị mang những đặc điểm đáp ứng được yêu cầu nghiên cứu với từng đối tượng cụ thể

Bảng 1.1: So sánh đánh giá đặc điểm của một số loại chỉ thị

được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật [19, 33]

Dựa trên phản ứng PCR

Mức

độ đa hình

Tính

di truyền

Chi phí phát triển, ứng dụng

Hàm lượng- chất lượng DNA

Yêu cầu trình

tự DNA

Phát hiện bằng phóng

Các chỉ thị DNA có thể được phân chia theo nhiều tiêu chí khác nhau,

dựa trên cơ sở kỹ thuật hay tính chất di truyền của chỉ thị (trội hay đồng

trội)… Dựa trên cơ sở kỹ thuật, có thể phân chia các chỉ thị DNA thành các

4 Chỉ thị dựa trên hình dạng DNA

5 Chỉ thị microarray

Mặc dù hiện nay số lượng chỉ thị DNA rất phong phú với nhiều biến thể khác nhau nhưng nhìn chung chỉ có một số loại được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền

1.2.3.1 Chỉ thị dựa trên cơ sở lai DNA- chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Trong số các chỉ thị DNA, RFLP (đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)

là chỉ thị thế hệ đầu tiên, được phát triển sớm nhất và ban đầu được sử dụng trong nghiên cứu di truyền ở người (Botstein, 1980) Trong hệ gen sinh vật thường xảy ra các quá trình làm thay đổi trình tự DNA như các đột biến điểm, đột biến thêm-bớt đoạn DNA (với số lượng từ vài chục đến vài trăm cặp nucleotide) hay sự sắp xếp lại các đoạn nhiễm sắc thể trong quá trình phân ly- tái tổ hợp Những biến đổi này có làm tăng, giảm hoặc dịch chuyển các vị trí giới hạn (vị trí nhận biết của các enzyme giới hạn) Khi sử dụng enzym giới hạn để phân cắt DNA hệ gen, những thay đổi của vị trí nhận biết sẽ tạo ra các mảnh DNA có kích thước khác nhau [26]

Về nguyên lý, chỉ thị RFLP dựa trên sự phân cắt DNA hệ gen bằng các enzym giới hạn và sản phẩm cắt giới hạn có thể được phát hiện bởi quá trình lai Southern với các mẫu dò đánh dấu phóng xạ (đoạn trình tự DNA đặc hiệu được thiết kế để có thể bắt cặp bổ sung và qua đó phát hiện được trình tự DNA mục tiêu) sau khi điện di trên gel agarose (Southern, 1979) [61] RFLP

là chỉ thị đồng trội do có thể phát hiện được các alen khác nhau của một locus trong hệ gen nhân, hệ gen ti thể hay hệ gen lục lạp bằng một mẫu dò dặc hiệu [75]

RFLP là công cụ chủ yếu trong nghiên cứu đa dạng di truyền trong và giữa các loài động thực vật trong những năm 80 thế kỷ 20 [26, 61] Rất nhiều

nghiên cứu đa dạng di truyền trên thực vật đã được thực hiện bằng chỉ thị RFLP Tuy nhiên, do các thao tác thực hiện phức tạp, đòi hỏi kỹ thuật viên có tay nghề cao, thí nghiệm tốn nhiều thời gian và độc hại nên khi các chỉ thị phân tử khác được tìm ra thì RFLP đã không còn được sử dụng phổ biến

1.2.3.2 Chỉ thị DNA ngẫu nhiên

Tính đặc hiệu trong phản ứng nhân bản DNA phụ thuộc vào nhiều yếu tố (thành phần, điều kiện phản ứng…), trong đó tính đặc hiệu của đoạn mồi đóng vai trò quyết định Nếu đoạn mồi có độ dài lớn (trên 20 nucleotide) thì khả năng bắt cặp với DNA khuôn càng đặc hiệu và ngược lại, nếu đoạn mồi ngắn (dưới 10 nucleotide) thì khả năng bắt cặp ngẫu nhiên với DNA khuôn càng tăng Do đó với đoạn mồi ngắn, số lượng sản phẩm DNA có kích thước khác nhau của phản ứng PCR sẽ rất nhiều Đây là cơ sở của chỉ thị DNA dựa trên kỹ thuật PCR sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên

Năm 1990, William và Welsh trong những nghiên cứu độc lập đã phát triển chỉ thị ngẫu nhiên RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)- chỉ thị phân tử thế hệ thứ hai, dựa trên kỹ thuật PCR Trong kỹ thuật RAPD-PCR, đoạn mồi có trình tự ngẫu nhiên (dài 10 nucleotide, tỷ lệ GC tối thiểu 50%) bắt cặp với DNA khuôn tại các vị trí bổ sung và tổng hợp các đoạn DNA sản phẩm có kích thước khác nhau [75] Kỹ thuật RAPD-PCR dễ thực hiện, chi phí rẻ hơn rất nhiều so với RFLP và chỉ yêu cầu một lượng nhỏ DNA khuôn cho phản ứng PCR Tuy nhiên, do đặc điểm ngẫu nhiên của mồi RAPD nên kết quả phân tích không ổn định, thường có sự sai khác giữa những lần nghiên cứu cho dù chỉ thay đổi một thông số thí nghiệm Bên cạnh đó, RAPD là chỉ thị trội nên không thể phát hiện được các cá thể dị hợp tử, do đó khó ứng dụng trong lập bản đồ di truyền [5, 61]

Để khắc phục những nhược điểm trên, nhiều biến thể của chỉ thị RAPD

đã được nghiên cứu và phát triển như chỉ thị DAF (DNA Aplification