Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR”.. Mục tiêu nghiê

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ QUANG THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ QUANG THƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ SỰ ĐA DẠNG

DI TRUYỀN MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG

TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG KĨ THUẬT SSR

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG THỊ THU YẾN

THÁI NGUYÊN - 2014

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc

Tác giả

Lê Quang Thương

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến -

Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học - người đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu để tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn các thầy cô và tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống, cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên

đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tới các cán bộ công tác tại Viện Khoa học sự sống - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Nhân dịp này tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán

bộ, Công ty chè Sông Cầu - Huyện Đồng Hỷ - Thành Phố Thái Nguyên, nhân dân vùng chè Trại Cài - Minh Lập - Đồng Hỷ và Vùng chè Tân Cương -Thành Phố Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thu thập vật liệu nghiên cứu làm đề tài

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn

bè, đồng nghiệp và nhóm nghiên cứu di truyền đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tác giả

Lê Quang Thương

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Cây chè 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè 3

1.1.2 Đặc điểm di truyền của cây chè 4

1.1.3 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam 5

1.1.4 Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên 9

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam và thế giới 13

1.2.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè trên thế giới 13

1.2.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam 15

1.3 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu tính đa dạng genome sinh vật 17

1.3.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms - đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn) 17

1.3.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc) 18

1.3.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1 Nguyên liệu 22

2.1.2 Hóa chất 22

2.1.3 Thiết bị 23

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lá chè 23

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 23

2.2.3 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 25

2.2.4 Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số 26

2.2.5 Phương pháp PCR - SSR 26

2.2.6 Phân tích số liệu 28

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Tách chiết DNA tổng số từ lá chè 29

3.2 Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu 31

3.3 Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu dựa trên phân tích PCR - SSR 41

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

PHỤ LỤC 53

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Sản lượng chè một số nước trên thế gới 6

Bảng 1.2 Khối lượng xuất khẩu chè của một số nước xuất khẩu chính giai đoạn 2006-2010 7

Bảng 1.3 Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam 9

Bảng 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010 10

Bảng 2.1 Danh sách tên và địa điểm thu mẫu của 25 mẫu chè nghiên cứu 22

Bảng 2.2 Danh mục các thiết bị, dụng cụ được sử dụng 23

Bảng 2.3 Danh sách 9 cặp mồi SSR được sử dụng trong nghiên cứu 27

Bảng 2.4 Thành phần của phản ứng PCR - SSR 28

Bảng 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - SSR 28

Bảng 3.1 Phổ hấp thụ DNA ở bước sóng 260nm và 280nm và nồng độ DNA tổng số của 25 mẫu chè 30

Bảng 3.2 Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi 32

Bảng 3.3 Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi 33

Bảng 3.4 Bảng hệ số tương đồng di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu 42

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên 10

Hình 1.2 Đa hình DNA SSR giữa 2 cá thể có motif (AT)n 21

Hình 3.1 Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8% của 25 mẫu chè nghiên cứu 29

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28 34

Hình 3.3 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS64 35

Hình 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS27 36

Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS98 37

Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS83 37

Hình 3.7 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YTS104 38

Hình 3.8 Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3 39

Hình 3.9 Sơ đồ quan hệ di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu 44

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Cây chè (Camellia sinensis (L.) O Kuntze) thuộc họ chè Theaceae là

loại cây trồng lưu niên có thời gian thu lợi kinh tế kéo dài đến hơn 60 năm Sản xuất và chế biến chè đã trở thành một trong những ngành kinh tế nông nghiệp quan trọng ở nhiều quốc gia với sản phẩm tạo ra có giá trị xuất khẩu cao Chè (trà) không chỉ là thức uống giải khát hàng ngày mà còn là một nét văn hóa đặc trưng, một thứ nghệ thuật (Trà đạo) của người dân châu Á Từ những kinh nghiệm dân gian cho đến các nghiên cứu khoa học gần đây đã khẳng định giá trị của cây chè đối với sức khỏe

Ở Việt Nam, phát triển cây chè là một trong 10 chương trình trọng điểm về phát triển nông nghiệp nông thôn, nước ta có một số vùng trồng chè lớn như : vùng chè Tây Bắc, vùng chè Việt Bắc, vùng chè trung du Bắc Bộ, vùng chè Bắc Trung Bộ, vùng chè Tây Nguyên… [13] Theo thống kê Việt Nam hiện có khoảng 120 giống chè, bên cạnh các giống chè lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở nhiều vùng trong cả nước thì, các giống chè địa phương tuy năng suất không cao nhưng lại có chất lượng tốt, được coi là đặc sản

Hiện nay có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các giống cây trồng nói chung và cây chè nói riêng như RADP, RFLP, AFLP, SSR,… Các phương pháp này đã khắc phục được nhược điểm của các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây trồng

Trong những năm gần đây, diện tích trồng các giống chè địa phương có

xu hướng giảm, nhiều giống chè quí hiếm sẽ bị mất dần Như vậy, việc tìm hiểu và nghiên cứu các giống chè đặc sản của địa phương sẽ góp phần bảo tồn nguồn gen cây chè là rất cần thiết

Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức độ DNA là cơ sở khoa học để đề xuất việc lựa chọn những giống chè có năng suất cao, chất lượng tốt, góp phần bảo tồn và phát triển nguồn gen Từ đó tuyển chọn giống chè đặc sản

làm vật liệu chọn giống là những vấn đề rất được quan tâm nghiên cứu Xuất

phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đánh giá sự đa dạng di truyền một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên bằng kĩ thuật SSR”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Phân tích được chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu của một số giống chè đặc sản địa phương

Xác định được khoảng cách di truyền của một số giống chè đặc sản địa phương được trồng ở Thái Nguyên

3 Nội dung nghiên cứu

- Thu thập các giống chè được đánh giá có chất lượng tốt và là đặc sản được trồng tại một số vùng trồng chè ở Thái Nguyên

- Thực hiện kỹ thuật PCR - SSR với 9 cặp mồi để đánh giá sự đa dạng trong trình tự genome của chè

- Sử dụng phần mềm sinh học phân tử NTSYS version 2.0 để phân tích kết quả của PCR - SSR và chỉ ra được mối quan hệ di truyền giữa các giống nghiên cứu

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cây chè

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây chè

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinnesis (L) O Kumtze và thuộc hệ

thống phân loại sau [3]:

Loài (Camellia sinensis)

Họ chè có 29 chi và khoảng 550 loài phân bố chủ yếu ở các nước nhiệt đới

và cận nhiệt ở cả hai bán cầu, đặc biệt ở Đông và Đông Nam Á Ở Việt Nam có khoảng 11 chi với trên 200 loài

Cây chè có nguồn gốc phát sinh ở khu vực gió mùa Đông Nam Á và có lịch sử rất lâu đời Cho đến nay, chè đã có thời gian phát triển gần 5000 năm Qua nhiều con đường, cây chè được trồng rộng rãi ở nhiều nước trên thế giới [3], [12] Năm 661, lịch sử của Triều Tiên đã ghi chép phong tục cúng chè

dâng tổ tiên của nhà vua Soro Năm 729, Hoàng đế Shomu Nhật Bản ban tiệc

chè cho 100 nhà sư thời Nara Vào thời Heian (794-1185), chè đã trở thành nét văn hóa dân gian phổ biến ở Nhật Bản Năm 850, các lái buôn Ả Rập mua

chè Trung Quốc theo con đường tơ lụa Chè xuất hiện ở Châu Âu năm 1560 Năm 1833, Sa Hoàng nước Nga trồng chè nhập từ Trung Quốc Giữa thế kỉ XVII, chè được trồng ở Châu Mỹ Đến thế kỷ XX, các vùng sản xuất chè

được mở rộng liên tục, các nhà máy chế biến tăng nhanh, khoa học kỹ thuật

chè phát triển mạnh

Hiện nay vẫn còn nhiều quan điểm khác nhau về nguồn gốc của cây chè Dựa trên những cơ sở về lịch sử, khảo cổ học và thực vật học Một số quan điểm được nhiều người công nhận nhất là:

* Cây chè có nguồn gốc từ Vân Nam - Trung Quốc

Carl Von Linnaeus là người đầu tiên xác nhận Trung Quốc là nguyên sản

của cây chè và định tên khoa học của chè là Theaceaae sinensis, phân thành hai thứ chè là Thea bohea (chè đen) và Thea viridis (chè xanh) [12]

Bên cạnh đó, các nhà khoa học Trung Quốc đã giải thích sự phân bố của chè mẹ như sau: tỉnh Vân Nam là nơi bắt đầu hàng loạt các con sông lớn đổ

về các con sông ở Việt Nam, Lào, Campuchia và Mianma Đầu tiên chè mọc

ở Vân Nam, sau đó lan dần ra các nơi khác [8]

* Cây chè có nguồn gốc từ vùng Atxam (Ấn Độ)

Năm 1823, Bruce đã phát hiện được những cây chè dại lá to ở vùng Atxam (Ấn Độ), từ đó các học giả người Anh cho rằng: nguyên sản của cây chè là vùng Atxam chứ không phải là ở vùng Vân Nam - Trung Quốc

* Cây chè có nguồn gốc từ Việt Nam

Djemukhatze (1961- 1976) đã có những công trình nghiên cứu về phức chất catechin của lá chè, so sánh về thành phần các chất catechin giữa các loại chè được trồng và chè mọc hoang dại đã nêu luận điểm về sự tiến hóa hóa sinh của cây chè, trên cơ sở đó ông đã kết luận: “Nguồn gốc cây chè chính là

ở Việt Nam” [12], [7]

1.1.2 Đặc điểm di truyền của cây chè

Mặc dù là loại cây trồng quan trọng ở nhiều nước trên thế giới nhưng cho đến nay, vẫn chưa có nhiều thông tin về bộ gen của cây chè [37] Những nghiên cứu từ trước đến nay đã cho kết quả rất khác nhau Năm 2001, nghiên

cứu của Hanson cho thấy kích thước bộ gen của cây chè Camellia sinensis

vào khoảng 15.298 Mbp [28] Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu của Tanaka và Taniguchi (năm 2007) trên các giống chè Nhật Bản lại cho thấy kích thước bộ

gen của cây chè được ước tính khoảng 4 Gbase [37] Nghiên cứu tế bào học các giống chè của Kondo (1979) đã xác định cây chè là loài thực vật lưỡng bội (2n = 30, số nhiễm sắc thể cơ sở là 15) và kiểu nhân (karotype) biến đổi khác nhau giữa các giống chè [22]

Nói chung, các nhiễm sắc thể của chè có kích thước nhỏ và có xu hướng

kết lại với nhau thành khối Giá trị r (tỷ lệ chiều dài giữa cánh dài và cánh

ngắn của nhiễm sắc thể) của 15 cặp nhiễm sắc thể trong khoảng 1,00 đến 1,91 Sự đồng nhất của các nhiễm sắc thể lưỡng bội cho thấy đặc điểm cùng

nguồn (monophyletic) tất cả các loài thuộc chi Camellia

1.1.3 Tình hình sản xuất chè trên thế giới và ở Việt Nam

Hơn 300 năm sau khi chè từ châu Á du nhập vào châu Âu, nhu cầu của thị trường thế giới về các sản phẩm từ chè đã tăng vọt và kéo theo đó là sự phát triển mạnh mẽ của ngành sản xuất và chế biến chè Từ vùng nguyên sản Đông Nam Á, đến nay trên thế giới đã có hơn 52 quốc gia sản xuất và chế biến chè [28] Chè với vai trò là đồ uống đã được chế biến thành nhiều dạng sản phẩm như chè đen, chè xanh, chè trắng, chè Ô Long; cách thức pha chế và thưởng thức chè cũng rất đa dạng, từ pha hãm truyền thống đến các loại chè túi lọc tiện lợi và nhanh chóng Bên cạnh đó, lá chè với nhiều thành phần có lợi cho sức khỏe cũng được sử dụng làm thuốc, mỹ phẩm…

Theo thống kê của FAO năm 2010 (bảng 1.1), sản lượng chè thế giới năm 2000 là 2,96 triệu tấn, tới năm 2010 là 4,1 triệu tấn, tăng trung bình 4,1%/ năm, 17 nước trồng chè ở Châu Á đã chiếm 89% diện tích trồng chè trên thế giới, tiếp theo là châu Phi với 18 nước chiếm 9% Trong 6 nước đứng đầu thế giới về trồng chè về diện tích chè thì có đến 5 nước Châu Á, gồm Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Indonesia và Việt Nam, chỉ có 1 nước Châu Phi là Kenya

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, 2010)

Nhìn vào bảng trên ta thấy 5 nước có sản lượng chè lớn nhất thế giới là Trung Quốc, Ấn Độ, Srilanka, Kenya, Việt Nam Đặc biệt Trung Quốc có mức tăng sản lượng chè là lớn nhất, năm 2004 sản lượng chè Trung Quốc 855,422 nghìn tấn đứng sau Ấn Độ (878 nghìn tấn), năm 2006 sản lượng chè Trung Quốc là 1028,1 nghìn tấn, nhưng tới năm 2010 sản lượng chè Trung Quốc đạt 1355,6 nghìn tấn Chè Ấn Độ năm 2006 đứng thứ hai thế giới về sản lượng 985,2 nghìn tấn, năm 2007 tăng tới mức 989,7 nghìn tấn, nhưng sau đó thì giảm nhẹ 982,1 nghìn tấn năm 2009 và 970,3 nghìn tấn năm 2010

Hàng năm có tới 45% sản lượng chè sản xuất ra là dành cho xuất khẩu Xuất khẩu chè chiếm một vai trò quan trọng trong nền kinh tế quốc dân của nhiều nước, đặc biệt là trong vấn đề an toàn lương thực Theo thống kê của FAO, hoạt động xuất khẩu đã mang lại 33% thu nhập xuất khẩu từ các sản phẩm nông sản cho Kenya, 55% cho Srilanka, 5% tại Tanzania, 2% ở Indonesia Bên cạnh đem lại nguồn thu cho nước xuất khẩu, xuất khẩu chè còn góp phần nâng cao vị trí của quốc gia trên trường quốc tế, chính vì vậy mà các nước không ngừng đẩy mạnh hoạt động xuất khẩu chè ra thị trường quốc tế Tình hình xuất khẩu chè ở một số nước xuất khẩu chính giai đoạn 2006-2010 được thể hiện ở bảng 1.2

Bảng 1.2 Khối lượng xuất khẩu chè của một số nước xuất khẩu chính

Theo bảng 1.2 nhận thấy: bảng xếp hạng về kim ngạch xuất khẩu chè có vài sự thay đổi khi khối lượng xuất khẩu chè của Kenya năm 2010 vươn lên đứng đầu thế giới với 281,1 nghìn tấn (tăng 28,77% so với năm 2009), năm

2009 là 361,1 nghìn tấn (tăng 15,02% so với năm 2008) Trung Quốc sụt giảm số lượng và đứng thứ 2, giảm so với 2009 là 0,14%; năm 2006 Srilanka đứng đầu với 314,9 nghìn tấn, nhưng lại bị sụt giảm liên tục những năm sau đó: năm 2007 giảm 6,57% so với năm 2006, năm 2008 phục hội nhẹ tăng 2,4% so với năm 2007, năm 2009 lại giảm 7,10% so với 2008, năm 2010 tăng 6,68% Năm 2010 khối lượng xuất khẩu chè của Srilanka đứng thứ 3 thế giới

Ở Việt Nam chè là cây công nghiệp dài ngày được bắt đầu sản xuất từ hơn 3000 năm trước Trước đây nhân dân chỉ trồng làm bóng mát và lấy búp làm đồ uống giải nhiệt Do có khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm với 2/3 diện tích lãnh thổ là đồi núi, cây chè đã trở thành cây trồng mang tính chất sản phẩm hàng hóa, sản phẩm chè được đưa ra bán ở nhiều thị trường khác nhau Theo thống kê của Tổng cục Hải quan, (năm 2013) Việt Nam là quốc gia sản xuất

và xuất khẩu chè đứng thứ 5 thế giới Hiện nay, cả nước có 35 tỉnh trồng chè với diện tích khoảng 131 nghìn ha Tuy nhiên, diện tích tập trung chủ yếu thuộc miền núi, trung du phía Bắc, tỉnh Nghệ An, Lâm Đồng Phát triển mạnh nhất ở các tỉnh Thái Nguyên, Tuyên Quang, Hà Giang, Phú Thọ, Yên Bái, Sơn La Số lượng các doanh nghiệp sản xuất chè quy mô công nghiệp khoảng

700 doanh nghiệp Có 230 doanh nghiệp xuất khẩu trực tiếp ra nước ngoài tới khoảng hơn 100 nước trên thế giới Số lượng người lao động trong ngành chè

là 1,5 triệu người [5] Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam giai đoạn 2001-2010 được trình bày ở bảng 1.3

Bảng 1.3 Diện tích, sản lượng, xuất khẩu chè Việt Nam

Năm Tổng diện

tích (ha)

Sản lượng (tấn khô)

Số lượng XK (tấn khô)

Kim ngạch (triệu USD)

Giá XK bình quân (USD/tấn)

(Nguồn: Hiệp hội chè Việt Nam)

Theo Hiệp hội chè Việt Nam, định hướng phát triển ngành chè Việt Nam trong thời gian tới là nâng cao chất lượng, an toàn vệ sinh thực phẩm Mục tiêu là phát triển diện tích trồng chè từ 130 nghìn ha năm 2010 lên 135 nghìn ha năm 2015 và đến năm 2020 là 150 nghìn ha Ngành chè sẽ không phát triển nhiều diện tích mà giữ diện tích ổn định, nâng cao năng suất, chất lượng chè và phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng với giá bình quân của thế giới

1.1.4 Đặc điểm một số dòng chè trồng tại Thái Nguyên

Thái Nguyên là một tỉnh Trung du miền núi, địa hình chủ yếu là đồi bát úp,

có độ dốc không lớn [7] Với dạng địa hình này Thái Nguyên rất thuận lợi cho việc phát triển sản xuất chè Những năm gần đây, Thái Nguyên đã chú trọng đến việc chọn lựa, xây dựng cơ cấu giống chè phù hợp, dần dần thay thế các giống chè trồng bằng hạt có năng suất và chất lượng thấp bằng các giống nhập nội cho năng suất, chất lượng cao hơn, cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên thể hiện ở bảng 1.4 [15]

Bảng 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001 - 2010 Chủng loại/

Giống chè

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

DT (ha)

Tỷ lệ (%)

(Nguồn: UBND Tỉnh Thái Nguyên)

Thông qua trồng thử nghiệm bước đầu đã xác định một số giống nhập nội có triển vọng để bổ sung vào cơ cấu giống của tỉnh là Tri 777, Phúc Vân Tiên, Keo Am Tích đó là các giống có khả năng chế biến chè xanh chất lượng cao

Hình 1.1 Hình ảnh một số giống chè đặc sản trồng tại Thái Nguyên

Hiện nay 60% diện tích trồng chè ở Thái Nguyên là giống Trung du Giống chè Trung du (hay còn gọi là chè ta) có đặc điểm búp nhỏ nên năng

suất không cao Nhưng nếu biết cách chế biến, chè Trung du sẽ cho ra sản phẩm có chất lượng cao hơn hẳn các loại chè được làm từ các giống khác, để chế biến loại chè thượng hạng tôm nõn thì nhất thiết nên dùng búp chè Trung

du Chè Trung du thường rất đậm đà, cánh nhỏ đều, nước chè sánh và hậu vị ngọt đậm, hương trà lưu lại lâu [7]

Theo tìm hiểu của chúng tôi, chè Bát Tiên ngon ngoài yếu tố giống tốt còn do quy trình trồng, chăm sóc, nhất là khâu chế biến yêu cầu sự tỉ mỉ cao Đất trồng chè phải có tầng canh tác trên 80 cm, kết cấu tơi xốp Tới thời kỳ thu hoạch, người sản xuất thường hái chè vào ngày nắng tránh ngày mưa, nếu không chè sẽ bị ngấm nước mất vị ngon Thời điểm thu hái tốt nhất là từ khoảng 9h sáng đến 4h chiều, khi hái thường hái búp chè bánh tẻ, chọn búp

có khoảng 5 lá Sau khi thu hoạch phải đem chè về rải ra nền sạch khoảng 30 phút để chè thoáng, bay hết hơi nước ẩm ướt Sau đó mới tiến hành các bước

vò sao chè tới khi nào thấy chè toả ra mùi thơm như bánh mật, tiếng chè nổ kêu lách tách là được Không chỉ vậy, để nước chè Bát Tiên có màu xanh, hương thơm đặc trưng, khi pha chè chỉ pha với một lượng vừa đủ, có thể tráng chè qua nước sôi

Chè Bát Tiên có nguồn gốc từ Đài Loan được nhập nội và trồng thành công ở một số tỉnh trung du miền núi phía Bắc Đặc điểm của chè Bát Tiên là cây to trung bình, tán đứng, mật độ cành hơi thưa, lá màu xanh nhạt, răng cưa

rõ, chóp lá hơi nhọn Do phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng khí hậu, người dân lại có kinh nghiệm trồng chè nhiều năm nên khi đưa vào trồng chè Bát Tiên có tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng và phát triển tốt nhanh cho thu hoạch, năng suất khá [7]

Chè Keo Am Tích là giống chè có thân và tán to vừa, cành nhiều, lá hơi thuôn, dài, hình bầu dục, lá dày, chóp lá nhọn, răng cưa sâu và rõ, mặt lá phẳng, màu lá xanh nhạt, búp màu xanh nhạt, hơi phớt tím, nhiều tuyết Cây sinh trưởng khá, mật độ búp dày, búp sinh trưởng khoẻ và mập Khi trồng cây

có tỷ lệ sống cao, cây 1 tuổi có đường kính thân 0,73 cm Nhân giống vô tính bằng giâm hom có tỷ lệ sống trên 95%, chè 20 tháng tuổi đạt 348 kg/ha [8]

Giống chè Phúc Vân Tiên là giống lai giữa Vân Nam lá to và Phúc Đỉnh Đại Bạch chè Bật mầm sớm đầu tháng 3, mật độ búp cao Năng suất rất cao, chè 4 - 8 tuổi đạt năng suất trên 10 tấn/ha, chống chịu sâu bệnh tốt, chống hạn tốt Thích hợp trồng ở vùng trung du và núi cao [8]

Giống chè Kim Tuyên được chọn lọc từ tổ hợp lai hữu tính giữa mẹ là giống Ô Long lá to của địa phương và bố là giống Raiburi của Ấn Độ vào năm 1975 Giống chè này nhập nội vào Việt Nam từ 1994

Giống chè Kim Tuyên có dạng thân bụi, thế lá ngang, kích thước lá nhỏ răng cưa mờ, có 8 đôi gân lá Màu sắc xanh đậm, trơn bóng, mép lượn sóng,

lá non phớt tím Bật mầm sớm, sức sinh trưởng mạnh, mật độ búp trung bình

Là giống cho sản lượng khá và ổn định Năng suất trung bình 6 - 8 tấn/ha, năng suất thâm canh đạt 10 - 12 tấn/ha [4]

Giống chè LDP1 và LDP2 là hai dòng chè được tạo ra từ phép lai hữu tính giữa cây mẹ là Đại Bạch Trà và cây bố là giống PH1 Qua quá trình chọn lọc, hai dòng này biểu hiện nhiều ưu điểm như lá to, búp có màu xanh và mật

độ búp dày, cây sinh trưởng khỏe và cho năng suất cao

Giống chè Hùng Đỉnh Bạch là giống chè quí có nguồn gốc từ Phúc Kiến -Trung Quốc Đặc điểm của Hùng Đỉnh Bạch là cây dạng thân gỗ, thế lá nằm ngang, lá thuôn dài, búp lớn Vị của Hùng Đỉnh Bạch rất đậm đà

Giống chè Tri 777 có nguồn gốc từ Srilanka, được chọn lọc từ chè Shan Mộc Châu - Srilanka, có đặc điểm phân cành thấp, dễ giâm cành, hệ số nhân giống cao, chịu hạn tốt, chống chịu sâu bệnh trung bình Búp 1 tôm 2 lá: 60 - 75gr Tanin 30,5% Chế biến chè xanh Trồng thích hợp nhất ở vùng núi thấp

100 - 500 m so với mực nước biển [12]

Giống chè Shan là cây chè Việt Nam do Viện Nghiên cứu chè Phú Thọ điều tra phân loại, có đặc điểm lá dài, rộng, thân cao to, tán rộng, số lứa hái ít,

lông tuyết nhiều, hương thơm tự nhiên, búp lớn, P100 búp: 70gr chất lượng búp tốt, giâm cành khó hơn so với các giống khác Chế biến chè xanh Trồng

ở vùng núi cao (> 1000m so với mực nước biển) sẽ cho năng suất cao [15] Giống chè Yabukita có nguồn gốc Nhật Bản, với đặc điểm Thân bụi, rễ chùm, búp sinh trưởng đồng loạt, tỷ lệ búp mù thấp Nhiễm sâu bệnh nặng (họ cánh tơ, nhện đỏ), chịu hạn kém Trọng lượng 100 búp: 50gr Hướng sản xuất chủ yếu để chế biến chè xanh [15]

Giống chè Yakatamidozi có nguồn gốc Nhật Bản, được chọn tạo ra bằng phương pháp lai giữa giống Yabukita và S6 Yakatamidozi là giống chè thích ánh sáng, lá mềm, búp nhỏ chịu sâu bệnh tốt, trọng lượng 100 búp: 50gr Sinh trưởng nhanh, được trồng để chế biến chè xanh [15]

1.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam và thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè trên thế giới

Việc nghiên cứu các giống cây được coi là tiền đề , là nguồn tư liệu tiên quyết không thể thay thế trong sản xuất nông nghiệp Trong quá trình sản xuất chè, giống có vai trò rất quan trọng trong việc nâng cao năng suất , sản lượng

và chất lượng sản phẩm Do đó các giống chè tốt không ngừng được quan tâm nghiên cứu và triển khai vào trồng trên quy mô lớn

Ấn Độ là quốc gia đứng đầu thế giới về sản lượng chè do rất quan tâm nghiên cứu triển khai các giống tốt cho năng suất cao vào sản xuất Từ những năm 50 của thế kỷ XX , Ấn Độ đã thành công trong việc chọn ra 110 giống chè tốt Công tác chọn giống chè, kết hợp chọn giống có sản lượng cao và có khả năng chống hạn , chống bệnh rất được chú ý ở Srilanca Nhờ đó đã tạo được các giống nổi tiếng nh ư Tri 777, TRI2043 Cũng theo Đỗ Ngọc Quý (2000) thì Ấn Độ, Nhật Bản, Srilanca, Trung Quốc, Liên Xô cũ… đã sử dụng công nghệ sinh học trong chọn giống chè tốt , sử dụng ưu thế lai để tạo ra giống chất lượng cao phục vụ cho sản xuất [14]

Trung Quốc là quốc gia sản xuất chè hàng đầu thế giới , các nhà khoa học Trung Quốc đã nghiên cứu và sử dụng giống chè tốt trong sản xuất từ rất sớm Ngoài những giống chè nổi tiếng từ lâu đời , hiện nay Trung Quốc

có nhiều giống chè cho năng suất cao , chất lượng tốt để chế biến cả chè xanh và chè đen như : Phúc Vân Tiên , Hoa Nhật Kim , Hùng Đỉnh Bạch (Phúc Kiến ), Phú Thọ 10…[11]

Nhật Bản đặc biệt quan tâm chú ý đến nghiên cứu chọ n giống, nhiều giống chè mới và cho năng suất cao đã được đưa vào sản xuất Trong đó có giống Yabukita được trồng phổ biến nhất chiếm tới 70% diện tích chè ở Nhật Bản [14]

Ngày nay, để có được các giống chè cho năng suấ t cao thì việc áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật vào quá trình sản xuất chè luôn được chú trọng đầu tư Bên cạnh đó, các nhà khoa học cũng bắt đầu tập trung nghiên cứu sâu hơn về cây chè ở mức độ phân tử Kích thước genome của chè lớn, khoảng 4

Gb Do thiếu sự hiểu biết về nuôi cấy mô cũng như quá trình dịch mã xảy ra ở chè nên rất ít các thông tin về trình tự genome được biết đến Đến năm 2010, chỉ có 819 trình tự nucleotide, 12.664 đoạn trình tự biểu hiện (Expressed Sequence Tags - EST), và 478 protein từ chè được công bố trên ngân hàng Genbank Các nghiên cứu về chè chủ yếu tập trung vào các gen liên quan đến của trình trao đổi chất thứ cấp, hầu hết được phát hiện qua trình tự EST [32] Trong nghiên cứu đa dạng di truyền, chỉ thị SSR được sử dụng rất phổ biến Tuy nhiên cho tới nay, số lượng chỉ thị SSR đặc hiệu cho cây chè còn rất ít, do đó các nghiên cứu ứng dụng chỉ thị SSR trong phân tích di truyền hỗ trợ công tác chọn giống chè còn khiêm tốn Sự đa dạng di truyền sẽ chỉ ra được mức độ sai khác giữa các giống chè nghiên cứu ở mức độ phân tử, đồng thời giải thích được tính đa dạng nguồn gen của cây chè

Singh và đtg vào năm 2006 đã sử dụng chỉ thị lặp trên đoạn 5S rDNA để phân tích di truyền 28 dòng chè thuộc ba thứ chè Assam, Sinensis và

Cambod, qua đó đã xác định được một số chỉ thị có thể phân biệt được các giống chè thuộc ba thứ chè này [35]

Năm 2008, Yao và đtg đã sử dụng chỉ thị ISSR nghiên cứu đa dạng di truyền 48 giống chè có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản, Kenya và ứng dụng trong phân tích quan hệ di truyền các cây chè lai (xác định bố mẹ), hỗ trợ công tác lai tạo giống chè tại Trung Quốc [44]

Chỉ thị RFLP đã được sử dụng trong phân tích quan hệ di truyền giữa các giống cây trồng và họ hàng hoang dại của chúng từ năm 1989 [17]

Ở cây chè, ít có những báo cáo về sử dụng chỉ thị RFLP trong nghiên cứu

đa dạng di truyền Phần lớn các nghiên cứu sử dụng RFLP đến nay đều được thực hiện ở Nhật Bản [28]

Ujihara và đtg (2009) cũng sử dụng một số cặp mồi SSR thiết kế cho cây

chè hoa Camellia japonica để nhận dạng di truyền các giống chè bản địa, phục

vụ yêu cầu dán nhãn các sản phẩm chè lưu hành trên thị trường Nhật Bản [40]

Chỉ thị AFLP lần đầu tiên được áp dụng với cây chè Kết quả nghiên cứu với 32 giống chè Kenya cho thấy sự phân nhóm của ba thứ chè Assam, Trung Quốc và Cambod, trong đó quần thể chè Trung Quốc có mức độ đa dạng di truyền cao hơn cả Các nghiên cứu sau này của Lee (2003) và Mishra (2004, 2009) [23], [27], cũng cho kết quả tương tự

Năm 2009, Mishra và đtg đã sử dụng 8 tổ hợp mồi AFLP để phân tích

đa dạng di truyền của 29 giống chè chính của vùng Darjeeling (Ấn Độ) [27] Trong năm 2005, Chen và đtg đã công bố kết quả đánh giá nguồn gen 4 quần thể chè ở Vườn bảo tồn giống chè Trung Quốc bằng chỉ thị RAPD, qua

đó xác định được 20 chỉ thị RAPD có khả năng phân biệt được 15 giống chè chính đang được trồng phổ biến [17]

1.2.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng genome chè ở Việt Nam

Ở nước ta, cây chè đang được coi là cây trồng chủ lực góp phần xóa đó i giảm nghèo cho vùng sâu, vùng xa, vùng núi cao Qua nhập nội, lai tạo, trong

những năm gần đây nước đã tạo được nhiều giống chè mới đem lại hiệu quả kinh tế cao

Qua nhiều năm nghiên cứu , Viện nghiên cứu chè đã ứng dụng th ống kê sinh học qua phân tích tương quan dựa vào đặc trưng hình thái kết hợp với xem xét các đặc điểm phát triển bộ rễ , sinh trưởng sinh, màu sắc lá, sâu bệnh, khả năng giâm cành… để chọn nhanh các loại chè có triển vọng k hi cây chè 2

- 3 tuổi Tại trung tâm nghiên cứu phát triển chè - Viện KHKT Nông lâm nghiệp miền núi phía Bắc , bằng phương pháp gây đột biến bằng bức xạ đã chọn được một số cá thể chè sinh trưởng và phát triển tốt Ngoài ra, Viện còn sử dụng Consixin xử lý trên mầm chè giống PH 1 trong thời gian 24 - 48h với nồng độ 0,2% cũng đã thu được kết quả bước đầu Ngoài ra, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu nhân giống bằng phương pháp nhân vô tính t ừ rất sớm như ghép, giâm cành và đã thu được những kết quả tốt [4]

Ngày nay, nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong chọn giống cây trồng đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Việc sử dụng các chỉ thị phân tử khác nhau được nghiên cứu và phát triển đã trở thành công cụ mạnh

mẽ để phân tích đa dạng di truyền và xác định các mối quan hệ giữa các giống cây trồng, vật nuôi như RAPD, SSR, RFLP, AFLP Trong đó, chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeats) là một loại chỉ thị được sử dụng khá phổ biến, chính xác và hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền, xây dựng bản đồ liên kết, phân lập gen, xác định quan hệ di truyền giữa các giống, dòng cây trồng

Trong những năm gần đây phương hướng sản xuất chè ở nước ta là phát triển diện tích trồng chè, nâng cao năng suất nhưng phải đảm bảo chất lượng chè, phấn đấu giá chè xuất khẩu bằng giá bình quân của thế giới Tuy nhiên trong thực tế sản xuất chè, Việt Nam vẫn phải nhập nội rất nhiều giống chè

mà vẫn bị thất thu, do giống không đảm bảo chất lượng Vì vậy, việc nghiên cứu, ứng dụng các chỉ thị DNA nhằm tìm ra các giống chè có năng suất cao,

chất lượng tốt, thích nghi với điều kiện thổ nhưỡng, khí hậu của địa phương

có vai trò hết sức quan trọng

Ở Việt Nam có rất nhiều công trình nghiên cứu về cây chè được đề xuất, triển khai có hiệu quả , góp phần không nhỏ vào việc nâng cao sản lượng và chất lượng chè thành phẩm , giúp cho ngành chế biến và sản xuất chè ở Việt Nam ngày càng có thương hiệu , đáp ứng được yêu cầu của thị trường Các nghiên cứu về chè ở mức độ phân tử cũng bắt đầu được đề cập đến

Nguyễn Thị Thu Hương và đtg (2008), đã dùng kĩ thuật RADP với 8 mồi ngẫu nhiên để đánh giá sự đa dạng di truyền ở 1 số dòng chè Shan

(Camellia sinensis var Assamica (Mast) Pierre sec Phamh) Kết quả có 77

phân đoạn DNA ngẫu nhiên được nhân bản, trong đó 100% số phân đoạn đều đa hình [6]

Nguyễn Hữu La và đtg (2004) đã sử dụng 10 mồi RAPD trong nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền một số giống chè Shan ở Phú Hộ, Phú Thọ [9]

Năm 2009, Trần Đức Trung đã kết hợp chỉ thị hình thái và chỉ thị SSR

nhằm đánh giá sự đa dạng di truyền các giống chè (Camellia sinensis (L.) O

Kuntze) ở Việt Nam Kết quả ghi nhận được sự đa dạng di truyền ở mức độ cao giữa các giống chè [16]

1.3 Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu tính

đa dạng genome sinh vật

1.3.1 Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms - đa hình

độ dài các đoạn cắt giới hạn)

Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA

hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dò DNA bổ sung tạo ra từ cùng một locus RFLP là chỉ thị đồng trội Ưu điểm của RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng

có thể xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền, nghiên cứu quan hệ họ hàng Nhược điểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn kém và mất thời gian Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 - 200ng từ mỗi cá thể) [1]

1.3.2 Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - đa hình

độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)

Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR AFLP phát hiện một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và gắn với adaptor (đoạn tiếp hợp) AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắc tương tự như RADP, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần: phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn, phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp Phân tích sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacryamide có độ phân giải cao Sự đa hình được xác định bởi sự có mặt hay không có mặt của một phân đoạn DNA AFLP rất có hiệu quả trong xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương pháp RAPD Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình trong khoảng thời gian ngắn, đòi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết kế mồi rất phức tạp

1.3.3 Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và đtg (1990) [43] ; Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [40] Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR) PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì

nó có khả năng tạo ra một lượng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ

thể nào Hiện nay PCR được xem là phương pháp nhanh, chính xác, tương đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến

dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể

Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu Tuy nhiên, hạn chế này đã được các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [20]

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phương pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể

và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [1] Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau như chè, chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tương và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phương

1.3.4 Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản)

Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh) Kĩ thuật này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [26] Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóa protein còn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể và có kích thước khác nhau Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại được chia thành hai nhóm: trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ như các DNA transposon)

và trình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thước khác nhau (VNTR-Variable Number of Tandem Repeat) [19], [42] VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình

tự (motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhiễm sắc thể (kể cả nhiễm sắc thể giới tính) Các VNTR được phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng như vị trí của chúng trên các nhiễm sắc thể [38], [42], bao gồm DNA vệ tinh (Satellite DNA- các đoạn lặp dài

từ 100 đến 300 bp), minisatellite (các đoạn lặp dài từ 10 đến 60 bp) và DNA vi vệ tinh (Microsatellite - các đoạn lặp ngắn từ 1 đến 6 bp)

Theo Litt và Lutty (1989), vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thường

có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định, chính vì vậy số lượng alen ở mỗi locus vi vệ tinh là rất nhiều Các vi vệ tinh có thể được tìm thấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên hệ gen nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) [39] Có nhiều danh pháp khác nhau được dùng để chỉ vi vệ tinh: trình tự lặp đơn giản - SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple Tandem Repeat), trong số này, SSR là danh pháp được sử dụng phổ biến nhất [10]

Vi vệ tinh - SSR có số lượng motif rất phong phú, phân tán đều khắp hệ gen và có mức độ đa hình rất cao Theo Jurka và Pethiyagoda (1995), với bốn loại base nitơ A-T-G-C, số lượng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA có thể lên đến 501 loại khác nhau, từ motif có một nucleotide (monomeric) đến motif có sáu nucleotide (hexameric) Motif phổ biến nhất ở hệ gen thực vật là (A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n Bên cạnh đa dạng về số lượng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, đã phân chia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (i) SSR lặp lại hoàn chỉnh (perfect repeats), có chứa một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (ii) SSR lặp lại không hoàn chỉnh (imperfect repeat), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởi một hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; (iii) SSR lặp lại phức hợp (compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có hoặc không có quy luật của hơn hai motif khác nhau [42]

Trước đây, DNA lặp được coi là “ADN tạp” bởi chức năng của chúng chưa được tìm ra [42] Ngày nay, mặc dù vai trò của DNA lặp đối với hệ gen vẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng chúng đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là các chỉ thị SSR dựa trên DNA vi vệ tinh Các DNA vi vệ tinh có số lượng rất lớn, phân bố khắp mọi nơi trên hệ

gen với tần suất xuất hiện cao (mỗi 21,2 kb ở thực vật hai lá mầm và mỗi 64,6 kb ở thực vật một lá mầm) nên số lượng chỉ thị SSR rất phong phú [32] Bên cạnh đó, các đoạn mồi SSR được thiết kế dựa trên vùng trình tự sườn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên Đặc biệt, chỉ thị SSR di truyền đồng trội, có khả năng phân biệt được cá thể đồng hợp tử/

dị hợp tử và có mức độ đa dạng alen cao ở mỗi locus Chính nhờ những ưu điểm đó mà SSR là loại chỉ thị DNA hiệu quả và được sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu chọn giống cây trồng

Tuy nhiên, khác với các chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR được phát triển dựa trên trình

tự DNA đã biết trước của đối tượng nghiên cứu Quy trình phát triển chỉ thị SSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết

kế mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự đó; đây là quy trình phức tạp, đòi hỏi áp dụng nhiều kỹ thuật - phương pháp khác nhau và đặc biệt có chi phí rất cao [10], [32], [39] Đây chính là rào cản lớn nhất cho việc áp dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu chọn giống các loại cây trồng

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu

Lá của 25 mẫu chè đặc sản đang được trồng tại Thái Nguyên được thu hái làm nguyên liệu nghiên cứu Danh sách tên và địa điểm lấy mẫu của các mẫu lá chè nghiên cứu được trình bày ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Danh sách tên và địa điểm thu mẫu của 25 mẫu chè nghiên cứu

TT Ký

hiệu

Tên giống

Địa điểm thu mẫu TT

Ký hiệu

Tên giống

Địa điểm thu mẫu

C Ty chè

Sông Cầu, Huyện Đồng Hỷ, Thái Nguyên

Sông Cầu

Xã Tân Cương, Thái Nguyên

Hóa chất: Nitơ lỏng, đệm rửa (Tris HCl 1M; EDTA 0,5M, pH = 8; Sorbitol

O), cồn 70%, Cloroform : Isoamyl (24:1), Isopropannol 100%

- Hóa chất điện di DNA (agarose - hãng invitrogen, ethidium bromide)

- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR của hãng QIAGEN

- Các hóa chất thông dụng khác như : Nước khử ion, ethanol

11 Tủ lạnh nhiệt độ 40C, - 200C (Italia)

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu thập mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tươi với phần búp non có 1 - 2 lá bánh tẻ (một tôm hai lá) được thu hái trực tiếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu Các mẫu lá chè được rửa sạch, và tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay

2.2.2 Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá chè theo phương pháp của Samuel Sun (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21]

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trình tách chiết DNA tổng số bao gồm các bước cơ bản sau:

Lá chè tươi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay

- Nghiền 0,2 g lá chè trong cối chày sứ (cối chày sứ vô trùng giữ ở tủ -

20 0C) với nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn Bổ sung vào mẫu đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350 mM; H2O) Chia ra các ống eppendorf 1,5 ml Li tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 40C, thu cặn Bước này lặp lại 2 lần

- Bổ sung 800 l đệm chiết có thành phần Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0;

C trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng, 5 phút lắc đều 1 lần

- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, rồi bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút

- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C

- Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2 ml

- Bổ sung một thể tích tương đương isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C

- Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bước này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài)

- Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, rồi hòa tan trong