Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

3. Nội dung nghiên cứu

1.3.3. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Kỹ thuật RAPD là kỹ thuật phân tích sự đa hình các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản ngẫu nhiên, do hai nhóm nghiên cứu của Williams và đtg (1990) [43] ; Welsh và McClelland (1991) đồng thời xây dựng [40]. Đây là một kỹ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerase (PCR). PCR là một công cụ hữu hiệu cho việc phân tích hệ gen thực vật, vì nó có khả năng tạo ra một lƣợng lớn các trình tự DNA đặc hiệu từ bất kỳ cơ

thể nào. Hiện nay PCR đƣợc xem là phƣơng pháp nhanh, chính xác, tƣơng đối đơn giản để đánh giá sinh vật chuyển gen, phân tích nhanh chóng sự biến dị di truyền ở phạm vi quần thể và giữa các cá thể.

Sự hạn chế lớn nhất của kỹ thuật này là phải dựa trên một trình tự DNA đặc hiệu. Tuy nhiên, hạn chế này đã đƣợc các nhà sinh học phân tử cải tiến, khắc phục đó là kỹ thuật PCR sử dụng đoạn mồi ngẫu nhiên hay còn gọi là kỹ thuật RAPD [20].

Trong những năm gần đây, kỹ thuật RAPD đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Nhiều nghiên cứu đã cho thấy, RAPD là một phƣơng pháp có hiệu quả trong việc xác định kiểu gen, phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền và lập bản đồ di truyền [1]. Kỹ thuật RAPD còn dùng để nhận biết, phân loại các giống cây trồng khác nhau nhƣ chè, chuối, lúa mì, đu đủ, đậu tƣơng... và phát hiện, bảo tồn sự đa dạng di truyền đặc biệt là các loài quí hiếm hay một số giống thực vật địa phƣơng.

1.3.4. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat - trình tự lặp lại đơn giản)

Kỹ thuật SSR còn đƣợc gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh). Kĩ thuật này đƣợc Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [26].

Trong hệ gen sinh vật bậc cao, ngoài các đoạn trình tự (gen) mã hóa protein còn có các yếu tố DNA lặp lại, phân bố trên mọi nhiễm sắc thể và có kích thƣớc khác nhau. Tùy thuộc vào sự phân bố trên hệ gen, các yếu tố DNA lặp lại đƣợc chia thành hai nhóm: trình tự DNA lặp lại rải rác (ví dụ nhƣ các DNA transposon) và trình tự DNA lặp lại nối tiếp có kích thƣớc khác nhau (VNTR-Variable Number of Tandem Repeat) [19], [42]. VNTR bao gồm hàng loạt các đơn vị trình tự (motif) lặp lại nối tiếp nhau và có mặt trên các nhiễm sắc thể (kể cả nhiễm sắc thể giới tính). Các VNTR đƣợc phân chia thành các nhóm khác nhau dựa trên chiều dài motif, số lần lặp lại của các motif cũng nhƣ vị trí của chúng trên các nhiễm sắc thể [38], [42], bao gồm DNA vệ tinh (Satellite DNA- các đoạn lặp dài từ 100 đến 300 bp), minisatellite (các đoạn lặp dài từ 10 đến 60 bp) và DNA vi vệ tinh (Microsatellite - các đoạn lặp ngắn từ 1 đến 6 bp).

Theo Litt và Lutty (1989), vi vệ tinh có nhiều motif khác nhau, thƣờng có mức độ lặp lại thấp và biến đổi ở một locus nhất định, chính vì vậy số lƣợng alen ở mỗi locus vi vệ tinh là rất nhiều. Các vi vệ tinh có thể đƣợc tìm thấy khắp nơi, ở vùng mang mã (exon) và không mang mã (intron) trên hệ gen nhân và cả hệ gen ngoài nhân (ti thể, lục lạp) [39]. Có nhiều danh pháp khác nhau đƣợc dùng để chỉ vi vệ tinh: trình tự lặp đơn giản - SRS (Simple Repetitive Sequences), đoạn lặp trình tự đơn giản - SSR (Simple Sequence Repeats) hay đoạn lặp nối tiếp đơn giản - STR (Simple Tandem Repeat), trong số này, SSR là danh pháp đƣợc sử dụng phổ biến nhất [10].

Vi vệ tinh - SSR có số lƣợng motif rất phong phú, phân tán đều khắp hệ gen và có mức độ đa hình rất cao. Theo Jurka và Pethiyagoda (1995), với bốn loại base nitơ A-T-G-C, số lƣợng các motif SSR trên cấu trúc sợi đôi DNA có thể lên đến 501 loại khác nhau, từ motif có một nucleotide (monomeric) đến motif có sáu nucleotide (hexameric). Motif phổ biến nhất ở hệ gen thực vật là (A)n, (AT)n, (GA)n và (GAA)n. Bên cạnh đa dạng về số lƣợng, sự sắp xếp các motif trong đoạn trình tự lặp cũng góp phần làm phong phú SSR trong hệ gen. Dựa trên mức độ hoàn chỉnh của các motif lặp lại, đã phân chia các SSR thành ba nhóm khác nhau, bao gồm: (i) SSR lặp lại hoàn chỉnh (perfect repeats), có chứa một motif lặp lại liên tục không bị ngắt quãng; (ii) SSR lặp lại không hoàn chỉnh (imperfect repeat), chuỗi motif lặp lại bị gián đoạn bởi một hay một vài base không thuộc cấu trúc motif; (iii) SSR lặp lại phức hợp (compound repeat), là sự kết hợp xen kẽ có hoặc không có quy luật của hơn hai motif khác nhau [42].

Trƣớc đây, DNA lặp đƣợc coi là “ADN tạp” bởi chức năng của chúng chƣa đƣợc tìm ra [42]. Ngày nay, mặc dù vai trò của DNA lặp đối với hệ gen vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ nhƣng chúng đã trở thành công cụ quan trọng trong nghiên cứu di truyền, đặc biệt là các chỉ thị SSR dựa trên DNA vi vệ tinh. Các DNA vi vệ tinh có số lƣợng rất lớn, phân bố khắp mọi nơi trên hệ

gen với tần suất xuất hiện cao (mỗi 21,2 kb ở thực vật hai lá mầm và mỗi 64,6 kb ở thực vật một lá mầm) nên số lƣợng chỉ thị SSR rất phong phú [32]. Bên cạnh đó, các đoạn mồi SSR đƣợc thiết kế dựa trên vùng trình tự sƣờn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR-PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị DNA ngẫu nhiên. Đặc biệt, chỉ thị SSR di truyền đồng trội, có khả năng phân biệt đƣợc cá thể đồng hợp tử/ dị hợp tử và có mức độ đa dạng alen cao ở mỗi locus. Chính nhờ những ƣu điểm đó mà SSR là loại chỉ thị DNA hiệu quả và đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong các nghiên cứu chọn giống cây trồng.

Hình 1.2. Đa hình DNA SSR giữa 2 cá thể có motif (AT)n

Tuy nhiên, khác với các chỉ thị ngẫu nhiên (RAPD) hay chỉ thị dựa trên các vị trí giới hạn (RFLP, AFLP), chỉ thị SSR đƣợc phát triển dựa trên trình tự DNA đã biết trƣớc của đối tƣợng nghiên cứu. Quy trình phát triển chỉ thị SSR gồm hai giai đoạn chính là xác định các trình tự lặp trên hệ gen và thiết kế mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự đó; đây là quy trình phức tạp, đòi hỏi áp dụng nhiều kỹ thuật - phƣơng pháp khác nhau và đặc biệt có chi phí rất cao [10], [32], [39]. Đây chính là rào cản lớn nhất cho việc áp dụng chỉ thị SSR trong nghiên cứu chọn giống các loại cây trồng.

Chƣơng 2

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu

2.1.1. Nguyên liệu

Lá của 25 mẫu chè đặc sản đang đƣợc trồng tại Thái Nguyên đƣợc thu hái làm nguyên liệu nghiên cứu. Danh sách tên và địa điểm lấy mẫu của các mẫu lá chè nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2.1.

Bảng 2.1. Danh sách tên và địa điểm thu mẫu của 25 mẫu chè nghiên cứu

TT Ký hiệu Tên giống Địa điểm thu mẫu TT Ký hiệu Tên giống Địa điểm thu mẫu 1 M1 Keo Am Tích C. Ty chè Sông Cầu, Huyện Đồng Hỷ, Thái Nguyên 14 M14 LDP2 C.Ty chè Sông Cầu 2 M2 Hùng Đỉnh Bạch 15 M15 Keo Am Tích Xã Tân Cƣơng, Thái Nguyên 3 M3 Tri 777 16 M16 Hùng Đỉnh Bạch

4 M4 Shan 17 M17 Kim Tuyên

5 M5 Phúc Vân Tiên 18 M18 LDP2

6 M6 LDP1 19 M19 Tri 777

7 M7 Trung Du 20 M20 Trung Du

8 M8 Yabukita 21 M21 Trung Du Xã Minh

Lập, Huyện Đồng Hỷ,

Thái Nguyên

9 M9 Long Vân 22 M22 Kim Tuyên

10 M10 Bát Tiên 23 M23 Bát Tiên

11 M11 Yakatamidozi 24 M24 LDP1

12 M12 Kim Tuyên 25 M25 Tri 777

13 M13 Phú Thọ 10

2.1.2. Hóa chất

Hóa chất: Nitơ lỏng, đệm rửa (Tris HCl 1M; EDTA 0,5M, pH = 8; Sorbitol 2M; NaH2PO4 0,4%; H2O), đệm tách (Tris HCl 1M; NaCl 5M; EDTA; CTAB 4%; H O), cồn 70%, Cloroform : Isoamyl (24:1), Isopropannol 100%.

- Hóa chất điện di DNA (agarose - hãng invitrogen, ethidium bromide) - Bộ kit dùng cho phản ứng PCR của hãng QIAGEN.

- Các hóa chất thông dụng khác nhƣ : Nƣớc khử ion, ethanol...

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị, dụng cụ dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử thuộc Khoa Khoa học Sự sống - Trƣờng Đại học khoa học.

Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị, dụng cụ đƣợc sử dụng

STT Thiết bị Dụng cụ

1 Máy soi gel với tia UV (USA) Bình đá

2 Bể ổn nhiệt (Jeio Tech - Hàn Quốc) Bình tam giác các cỡ 3 Máy đo quang phổ (Thermo electron) Cốc đong, ống đong 4 Bộ nguồn điện di và bể điện di ngang Đầu côn các cỡ

5 Cân điện tử (Satorius - Đức) Găng tay cao su, khẩu trang 6 Lò vi sóng (Sharp, Malaysia) Micropipet: 1 - 5 μl

7 Máy đo pH (Japan) Micropipet: 5 - 10 μl 8 Máy PCR (Singapore) Micropipet: 20 - 100 μl

9 Máy vortex Ống eppendorf các cỡ

10 Nồi hấp khử trùng (Đài Loan) Micropipet: 100 - 1000 μl 11 Tủ lạnh nhiệt độ 40C, - 200C (Italia)

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tƣơi với phần búp non có 1 - 2 lá bánh tẻ (một tôm hai lá) đƣợc thu hái trực tiếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu. Các mẫu lá chè đƣợc rửa sạch, và tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay.

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá chè theo phƣơng pháp của Samuel Sun (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21].

Lá chè tƣơi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trình tách chiết DNA tổng số bao gồm các bƣớc cơ bản sau:

Lá chè tƣơi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay.

- Nghiền 0,2 g lá chè trong cối chày sứ (cối chày sứ vô trùng giữ ở tủ - 20 0C) với nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn. Bổ sung vào mẫu đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350 mM; H2O). Chia ra các ống eppendorf 1,5 ml. Li tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 40C, thu cặn. Bƣớc này lặp lại 2 lần.

- Bổ sung 800 l đệm chiết có thành phần Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 20 mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4 M; H2O, lắc đều và giữ ở 650

C trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng, 5 phút lắc đều 1 lần.

- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, rồi bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút.

- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C. - Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2 ml.

- Bổ sung một thể tích tƣơng đƣơng isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút.

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C.

- Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bƣớc này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài).

- Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, rồi hòa tan trong 200 l H2O khử ion.

- Sau khi DNA đƣợc hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l Rnase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 370C trong 2 giờ.

- Cho vào 200 l Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ (hỗn hợp đƣợc phân thành 2 lớp, lớp trên có chứa DNA), ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 40

- Chuyển pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 20 l CH3COONa 3M, tủa bằng cồn để trong đá 30 phút.

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C.

- Đổ phần dịch nổi, rửa DNA bằng 400 l ethanol 80% hai lần. Sau mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 6 phút, sau đó loại bỏ ethanol nhẹ nhàng.

- Làm khô DNA bằng quạt gió, bổ sung 50 l H2O vào sản phẩm để hòa tan DNA và giữ ở 40

C.

- Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dƣơng trong điện trƣờng.

Quy trình điện di nhƣ sau:

- Chuẩn bị gel agarose: Hòa 0,8g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn bằng lò vi sóng. Để nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 - 2 mm.

- Lấy khoảng 5 µl mẫu DNA tách đƣợc trộn lẫn với 2µl dye 6X, tra vào giếng nhỏ trên bản gel.

- Tiến hành điện di trong dung dịch TAE 1X với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110V, thời gian 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng, quan sát sự di chuyển bằng màu xanh của bromophenol blue.

- Nhuộm gel bằng EtBr: bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml trong 10 phút, sau đó nhẹ nhàng rửa sạch gel bằng nƣớc.

- Quan sát và chụp ảnh: gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng 254 nm trên máy soi DNA. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp bằng máy chụp ảnh.

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số

Tiến hành định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết đƣợc bằng cách đo quang phổ hấp thụ.

Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang của bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu cho phép xác định hàm lƣợng axit nucleic trong mẫu dựa vào mối tƣơng quan: một đơn vị OD260 tƣơng ứng với nồng độ 50 ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi đôi.

Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết đƣợc, chúng tôi tiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 280 nm.

Độ tinh sạch DNA = OD260/OD280.

Trong đó: OD260 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm, OD280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm.

Dung dịch axit nucleic đƣợc coi là sạch khi tỉ số OD260/OD280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0.

2.2.5. Phương pháp PCR - SSR

Dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR do Karry Mullis và đtg (1985) phát minh, chỉ thị SSR đã đƣợc phát triển và ứng dụng trong chọn giống mang lại những kết quả đáng tin cậy và có giá trị. Các đoạn mồi SSR đƣợc thiết kế dựa trên vùng trình tự sƣờn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR - SSR với 9 cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng trình tự SSR, dựa trên cơ sở các nghiên cứu đã công bố của Sharma và đtg (2009) [33]; Ma

và đtg (2010) [25] về nhận dạng đặc tính và nguồn gốc của chè (Camellia

sinensis) bằng chỉ thị SSR.

Sử dụng 9 mồi SSR đƣợc tổng hợp tại hãng QIAGEN, thông tin về trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Danh sách 9 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Motif lặp

1 YS3 R: GAAGCAAACCACTGAGGTGA F: GCGTATGGAAAAGCTGAGAA (TC)10 2 YS27 F: GGGGATAGTACAAACACACAAC R: GCTCCTCTTTCTTCACCACTT (GA)20 3 YS46 F: GGGTTCAGTCGCAGCAAA R: GAGGAGTTCTTCTTGCGTCT (TC)13 4 YS28 F: GTCCCCATTGCTCTTAGTTT R: GACAATCATTGCCACCACAT (TG)12(GA)13 5 YS83 F: GAGGATTTGGGTTTGTGAAC R: TCATTCTCTCTGGCATCACC (TGG)9 6 YS98 F: AGCCCAACTCCTCCTGAC R: AGCAGCCTCATTCGGAC (TTGTG)8 7 YS64 F: AGTTGGCTGAATCAGTCCCTT R: GCTTAAATCACAATTCAAAGC (TTGTT)5 8 YTS104 F: AGTGAATATCCGTGGACAGC R: ATGATAGCAAATCTCCAAAC (TC)10 9 YS119 F: CACAAATAATCCACTCTTCC R: ACTATGATCGTAACGCACAG (AG)10

Phản ứng PCR - SSR ở 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thƣ̣c hiện với thành