Phƣơng pháp nghiên cứu

3. Nội dung nghiên cứu

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu lá chè

Các mẫu lá chè tƣơi với phần búp non có 1 - 2 lá bánh tẻ (một tôm hai lá) đƣợc thu hái trực tiếp ngay tại các địa điểm lấy mẫu. Các mẫu lá chè đƣợc rửa sạch, và tiến hành tách chiết DNA tổng số ngay.

2.2.2. Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số đƣợc tách chiết từ lá chè theo phƣơng pháp của Samuel Sun (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21].

Lá chè tƣơi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay, quy trình tách chiết DNA tổng số bao gồm các bƣớc cơ bản sau:

Lá chè tƣơi thu về rửa sạch sau đó tiến hành tách chiết ngay.

- Nghiền 0,2 g lá chè trong cối chày sứ (cối chày sứ vô trùng giữ ở tủ - 20 0C) với nitơ lỏng cho đến khi thành dạng bột mịn. Bổ sung vào mẫu đệm rửa có thành phần (Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 5 mM, pH 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350 mM; H2O). Chia ra các ống eppendorf 1,5 ml. Li tâm 12000 vòng/phút, 15 phút, 40C, thu cặn. Bƣớc này lặp lại 2 lần.

- Bổ sung 800 l đệm chiết có thành phần Tris - HCl 100 mM, pH = 8,0; EDTA 20 mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4 M; H2O, lắc đều và giữ ở 650

C trong thời gian 30 phút đến 1 tiếng, 5 phút lắc đều 1 lần.

- Giữ mẫu ở nhiệt độ phòng khoảng 10 phút, rồi bổ sung 800 l Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) vào mẫu, lắc đều trong thời gian 10 phút.

- Ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C. - Dùng pipet chuyển dịch nổi sang ống eppendorf 2 ml.

- Bổ sung một thể tích tƣơng đƣơng isopropanol (lạnh) và đảo nhẹ, giữ mẫu trong đá 10 phút.

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C.

- Loại dịch nổi, rửa DNA bằng cách thêm 500 l cồn 80%, ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 4 phút ở 40C (bƣớc này thực hiện 2 lần), sau đó nhẹ nhàng loại bỏ ethanol (tránh để các cuộn DNA rơi ra ngoài).

- Làm khô DNA bằng quạt gió, máy hút chân không, rồi hòa tan trong 200 l H2O khử ion.

- Sau khi DNA đƣợc hòa tan hoàn toàn thì bổ sung 3 l Rnase (10mg/ml). Giữ sản phẩm ở 370C trong 2 giờ.

- Cho vào 200 l Chloroform : isoamyl alcohol (24:1), đảo nhẹ (hỗn hợp đƣợc phân thành 2 lớp, lớp trên có chứa DNA), ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ở 40

- Chuyển pha trên sang ống eppendorf mới và bổ sung 20 l CH3COONa 3M, tủa bằng cồn để trong đá 30 phút.

- Ly tâm 14000 vòng/phút trong thời gian 10-15 phút ở 40C.

- Đổ phần dịch nổi, rửa DNA bằng 400 l ethanol 80% hai lần. Sau mỗi lần rửa ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 6 phút, sau đó loại bỏ ethanol nhẹ nhàng.

- Làm khô DNA bằng quạt gió, bổ sung 50 l H2O vào sản phẩm để hòa tan DNA và giữ ở 40

C.

- Điện di kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.

2.2.3. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose

Nguyên tắc của phƣơng pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của axit nucleic. Axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của dòng điện một chiều chúng sẽ di chuyển từ cực âm về cực dƣơng trong điện trƣờng.

Quy trình điện di nhƣ sau:

- Chuẩn bị gel agarose: Hòa 0,8g agarose trong 100 ml dung dịch đệm TAE 1X, đun sôi cho agarose tan hoàn toàn bằng lò vi sóng. Để nhiệt độ hạ xuống còn khoảng 50 - 600C, đổ dung dịch agarose vào khuôn điện di đã gài sẵn răng lƣợc thích hợp. Sau 30 - 60 phút, khi gel đã đông, đặt gel vào hộp điện di. Đổ đệm TAE 1X ngập cách mặt gel 1 - 2 mm.

- Lấy khoảng 5 µl mẫu DNA tách đƣợc trộn lẫn với 2µl dye 6X, tra vào giếng nhỏ trên bản gel.

- Tiến hành điện di trong dung dịch TAE 1X với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110V, thời gian 30 phút. DNA di chuyển từ cực âm đến cực dƣơng, quan sát sự di chuyển bằng màu xanh của bromophenol blue.

- Nhuộm gel bằng EtBr: bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml trong 10 phút, sau đó nhẹ nhàng rửa sạch gel bằng nƣớc.

- Quan sát và chụp ảnh: gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng tử ngoại có bƣớc sóng 254 nm trên máy soi DNA. Quan sát thấy DNA hiện lên dƣới dạng các vạch sáng. Ảnh điện di đƣợc chụp bằng máy chụp ảnh.

2.2.4. Phương pháp xác định hàm lượng và kiểm tra độ tinh sạch DNA tổng số

Tiến hành định lƣợng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tách chiết đƣợc bằng cách đo quang phổ hấp thụ.

Nguyên tắc: dựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260 nm của các base purin và pyrimidin. Giá trị mật độ quang của bƣớc sóng 260 nm (OD260) của các mẫu cho phép xác định hàm lƣợng axit nucleic trong mẫu dựa vào mối tƣơng quan: một đơn vị OD260 tƣơng ứng với nồng độ 50 ng/µl cho dung dịch chứa DNA sợi đôi.

Nồng độ DNA (ng/µl) = OD260 x 50 x hệ số pha loãng

Để kiểm tra độ tinh sạch của mẫu DNA tách chiết đƣợc, chúng tôi tiến hành đo thêm giá trị mật độ quang ở bƣớc sóng 280 nm.

Độ tinh sạch DNA = OD260/OD280.

Trong đó: OD260 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 260 nm, OD280 là chỉ số đo đƣợc ở bƣớc sóng 280 nm.

Dung dịch axit nucleic đƣợc coi là sạch khi tỉ số OD260/OD280 dao động trong khoảng 1,8 - 2,0.

2.2.5. Phương pháp PCR - SSR

Dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR do Karry Mullis và đtg (1985) phát minh, chỉ thị SSR đã đƣợc phát triển và ứng dụng trong chọn giống mang lại những kết quả đáng tin cậy và có giá trị. Các đoạn mồi SSR đƣợc thiết kế dựa trên vùng trình tự sƣờn có tính bảo thủ cao của các đoạn lặp, do đó sản phẩm nhân gen của phản ứng SSR - PCR đặc hiệu và ổn định hơn các chỉ thị ADN ngẫu nhiên. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành phản ứng PCR - SSR với 9 cặp mồi đƣợc thiết kế đặc hiệu cho từng trình tự SSR, dựa trên cơ sở các nghiên cứu đã công bố của Sharma và đtg (2009) [33]; Ma

và đtg (2010) [25] về nhận dạng đặc tính và nguồn gốc của chè (Camellia

sinensis) bằng chỉ thị SSR.

Sử dụng 9 mồi SSR đƣợc tổng hợp tại hãng QIAGEN, thông tin về trình tự các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày trong bảng 2.3.

Bảng 2.3. Danh sách 9 cặp mồi SSR đƣợc sử dụng trong nghiên cứu

TT Tên mồi Trình tự mồi (5’ - 3’) Motif lặp

1 YS3 R: GAAGCAAACCACTGAGGTGA F: GCGTATGGAAAAGCTGAGAA (TC)10 2 YS27 F: GGGGATAGTACAAACACACAAC R: GCTCCTCTTTCTTCACCACTT (GA)20 3 YS46 F: GGGTTCAGTCGCAGCAAA R: GAGGAGTTCTTCTTGCGTCT (TC)13 4 YS28 F: GTCCCCATTGCTCTTAGTTT R: GACAATCATTGCCACCACAT (TG)12(GA)13 5 YS83 F: GAGGATTTGGGTTTGTGAAC R: TCATTCTCTCTGGCATCACC (TGG)9 6 YS98 F: AGCCCAACTCCTCCTGAC R: AGCAGCCTCATTCGGAC (TTGTG)8 7 YS64 F: AGTTGGCTGAATCAGTCCCTT R: GCTTAAATCACAATTCAAAGC (TTGTT)5 8 YTS104 F: AGTGAATATCCGTGGACAGC R: ATGATAGCAAATCTCCAAAC (TC)10 9 YS119 F: CACAAATAATCCACTCTTCC R: ACTATGATCGTAACGCACAG (AG)10

Phản ứng PCR - SSR ở 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thƣ̣c hiện với thành phần đƣợc thể hiện ở bảng 2.4 với tổng thể tích mỗi phản ứng PCR là 12,5 µl và chu trình nhiệt trong bảng 2.5.

Bảng 2.4. Thành phần của phản ứng PCR - SSR Thành phần phản ứng Thể tích (l ) PCR Master mix 6,25 Primer F (10 mM) 0,5 Primer R (10 mM) 0,5 DNA mẫu 90 ng 1 H2O 4,25 Tổng 12,5

Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR - SSR

Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0

C) Thời gian Số chu kỳ

1 Biến tính 94 3 phút 1

2 Biến tính 94 1 phút

32

3 Gắn mồi 48 45 giây

4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút

5 Hoàn tất chuỗi 72 10 phút 1

6 Kết thúc phản ứng 4 ∞

Sau khi phản ƣ́ng PCR kết thúc , lấy 8 l sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 3%trong đệm TAE 1X

2.2.6. Phân tích số liệu

Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR, sự xuất hiện các băng điện di đƣợc ƣớc lƣợng kích thƣớc và thống kê với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di đƣợc tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: số 1- xuất hiện phân đoạn DNA (băng DNA) và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA. Các dữ liệu này đƣợc mã hóa thành dữ liệu nhị phân trên phần mềm Excel 2007. Các kết quả sau khi đƣợc mã hóa sẽ đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng phần mềm NTSYS pc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống chè ở mức độ phân tử.

Chƣơng 3

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá chè

DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Do vậy chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số tƣ̀ lá của 25 mẫu chè theo phƣơng pháp của Samuel (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21].

Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8% của 25 mẫu chè nghiên cứu

(1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)

Từ hình 3.1 ta thấy: ở cả 25 mẫu chè nghiên cứu đều xuất hiện một băng sáng và tƣơng đối gọn, không bị đứt gãy, rõ ràng nằm gần giếng điện di. Do đó sản phẩm DNA tổng số thu đƣợc có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA tách chiết phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ của DNA theo phƣơng pháp đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.4. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.

Bảng 3.1. Phổ hấp thụ DNA tổng số ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của 25 mẫu chè Mẫu OD260 (nm) OD280 (nm) Tỷ số OD260/OD280 1 0,08 0,047 1,7 2 0,16 0,084 1,9 3 0,085 0,045 1,8 4 0,13 0,068 1,9 5 0,12 0,06 2 6 0,17 0,094 1,8 7 0,087 0,048 1,8 8 0,07 0,035 2 9 0,1 0,05 2 10 0,11 0,066 1,7 11 0,09 0,05 1,8 12 0,13 0,065 2 13 0,1 0,05 2 14 0,06 0,032 1,9 15 0,13 0,07 1,8 16 0,09 0,049 1,8 17 0,16 0,09 1,9 18 0,12 0,06 2 19 0,05 0,026 1,9 20 0,12 0,068 1,8 21 0,095 0,054 1,8 22 0,12 0,062 1,9 23 0,11 0,061 1,8 24 0,15 0,075 2 25 0,09 0,05 1,8

Từ bảng 3.1, ta thấy tỷ số OD260/OD280 dao động trong khoảng 1,7 - 2,0; chứng tỏ mẫu DNA tổng số tách chiết đƣợc của các mẫu chè nghiên cứu tƣơng đối sạch đảm bảo để tiến hành phản ứng PCR - SSR.

Sau khi tách chiết DNA tổng số chúng tôi đã tiến hành pha loãng hàm lƣợng DNA về hàm lƣợng 90 ng/µl để phục vụ cho nghiên cứu đa hình DNA.

3.2. Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu

Sau khi tách chiết DNA tổng số có hàm lƣợng cao và chất lƣợng tốt, chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR - SSR với 9 cặp mồi đặc hiệu, đó là các mồi YS98, YS28, YS27, YS64, YS83, YTS104, YS3, YS19, YS46 để phân tích chỉ thị SSR ở 25 mẫu chè nghiên cứu.

Sản phẩm PCR - SSR với các mồi khác nhau đƣợc điện di trên gel agarose 3% để phân tích tính đa hình DNA của 25 mẫu chè nghiên cứu. Kết quả phân tích sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi thu đƣợc (bảng 3.2) cho thấy, số lƣợng các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 22 đến 45 phân đoạn. Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản dao động trong khoảng từ 120 bp đến 600 bp.

Khi điện di sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi ở các mẫu số M11 và M12 có số phân đoạn nhiều nhất là 12 phân đoạn và các mẫu M21 và M23 có số phân đoạn ít nhất là 7 phân đoạn đƣợc nhân bản.

Bảng 3.2. Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi

Mồi

Mẫu YS98 YS28 YS27 YS64 YS83 YTS104 YS19 YS46 YS3 Tổng

M1 2 1 1 1 1 1 0 1 1 9 M2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M4 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M5 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M6 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M7 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M8 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M9 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M10 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M11 2 1 2 2 1 1 1 1 1 12 M12 2 1 2 2 1 1 1 1 1 12 M13 2 1 1 2 1 1 1 1 1 11 M14 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 M16 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M17 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M18 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 M20 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M21 1 1 1 1 1 1 0 0 1 7 M22 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M23 1 1 1 1 1 1 0 0 1 7 M24 1 1 1 1 1 1 1 2 1 10 M25 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 Tổng 45 25 31 28 25 14 22 27 25 254

Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu chè nghiên cứu với nhau trong cùng 1 mồi. Điều này đƣợc tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu trình bày ở bảng 3.3.

Bảng 3.3. Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi

STT Mồi Số phân đoạn

DNA Số phân đoạn DNA đa hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) 1 YS98 3 2 66,67 2 YS28 4 4 100 3 YS27 4 4 100 4 YS64 4 4 100 5 YS83 3 3 100 6 YTS104 5 5 100 7 YS19 4 4 100 8 YS46 4 4 100 9 YS3 3 3 100 Tổng 34 33 97,06

Qua phân tích bảng 3.3 nhận thấy, tổng số phân đoạn DNA của 25 mẫu chè nghiên cứu khi phân tích chỉ thị SSR là 34 phân đoạn đƣợc nhân bản, trong đó có 33 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 97,06%) và không đa hình là 1 phân đoạn (chiếm 2,94%). Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản trong khoảng từ 120bp đến 600 bp. Số lƣợng các phân đoạn tƣơng ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 3 đến 5 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản đƣợc ít phân đoạn DNA nhất là các cặp mồi YS98, YS83, YS3 (3 phân đoạn), và mồi nhân đƣợc nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi YTS104 (5 phân đoạn).

Bảng 3.3 cũng cho thấy, cả 9 mồi SSR mà chúng tôi đã sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mức độ đa hình của mỗi mồi nghiên cứu dao động từ 66,67% đến 100%. Trong đó m ồi biểu hiện tính đa hình thấp nhất là mồi YS98 (66,67%), còn lại các mồi biểu hiện tính đa hình cao là các mồi YS83, YS3, YS46, YS19, YS27, YTS104, YS28, YS64 (100%).

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR - SSR trên gel agarose 3% của một số mồi đặc trƣng ở 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thể hiện trên các hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8.

Mồi YS28

Theo nghiên cứu đã công bố của Sharma và đtg (2009), cặp mồi YS28 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (TG)12(GA)13 và có kích thƣớc trong khoảng 170 - 200 bp. Trong khi đó, với các mẫu chè chúng tôi đã thu thập đƣợc tại tỉnh Thái Nguyên để nghiên cứu thì các phân đoạn DNA thu đƣợc lại dao động trong khoảng từ 290 - 320 bp. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi khác so với kết quả mà Sharma và đtg đã công bố [33].

Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28

(M: Marker 100 bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)

Kết quả điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS28 (hình 3.2) cho thấy các băng có kích thƣớc ƣớc tính dao động trong khoảng 290 đến 320 bp. Với mồi YS28 xuất hiện các phân đoạn DNA

ở 4 kích thƣớc khác nhau (290 bp, 300 bp, 310 bp, 320 bp). Đặc biệt ở kích