3. Nội dung nghiên cứu
3.3. Mối quan hệ di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu dựa trên phân
Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện các phân đoạn DNA của các mẫu khi điện di sản phẩm PCR - SSR, chúng tôi xác định hệ số đa dạng di truyền của các mẫu chè nghiên cứu ở mức độ phân tử. Các số liệu đƣợc tính toán và phân tích theo chƣơng trình NTSYSpc version 2.0 với quy ƣớc các phân đoạn DNA xuất hiện = 1; không xuất hiện = 0). Nhằm xác định khoảng cách di truyền giữa các mẫu chè nghiên cứu thông qua hệ số tƣơng đồng di truyền và biểu đồ hình cây.
Kết quả thống kê số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản khi điện di với các mồi đƣợc trình bảy ở bảng phần phụ lục.
Bảng 3.4. Bảng hệ số tƣơng đồng di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu Mẫu M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M1 1.00 M2 0.97 1.00 M3 0.85 0.82 1.00 M4 0.85 0.82 0.88 1.00 M5 0.76 0.73 0.85 0.85 1.00 M6 0.76 0.73 0.79 0.79 0.88 1.00 M7 0.88 0.85 0.73 0.73 0.64 0.70 1.00 M8 0.76 0.73 0.61 0.73 0.64 0.76 0.76 1.00 M9 0.61 0.58 0.52 0.58 0.55 0.61 0.55 0.67 1.00 M10 0.76 0.73 0.67 0.67 0.58 0.58 0.76 0.70 0.73 1.00 M11 0.73 0.70 0.64 0.64 0.55 0.55 0.73 0.67 0.70 0.97 1.00 M12 0.61 0.58 0.58 0.47 0.50 0.61 0.61 0.61 0.82 0.79 0.82 1.00 M13 0.58 0.55 0.73 0.73 0.70 0.64 0.52 0.58 0.73 0.76 0.79 0.73 1.00 M14 0.73 0.70 0.88 0.88 0.85 0.79 0.67 0.67 0.58 0.61 0.58 0.52 0.79 1.00 M15 0.76 0.73 0.67 0.79 0.70 0.64 0.70 0.82 0.67 0.70 0.67 0.55 0.64 0.73 1.00 M16 0.79 0.76 0.64 0.76 0.67 0.73 0.73 0.91 0.70 0.67 0.64 0.58 0.61 0.70 0.91 1.00 M17 0.82 0.79 0.67 0.67 0.64 0.64 0.76 0.76 0.55 0.64 0.61 0.55 0.47 0.67 0.76 0.85 1.00 M18 0.61 0.58 0.58 0.58 0.55 0.55 0.61 0.67 0.64 0.50 0.47 0.52 0.50 0.58 0.67 0.64 0.55 1.00 M19 0.58 0.55 0.55 0.55 0.52 0.58 0.52 0.58 0.85 0.70 0.67 0.73 0.70 0.55 0.58 0.61 0.52 0.73 1.00 M20 0.76 0.73 0.67 0.67 0.64 0.52 0.70 0.58 0.67 0.88 0.85 0.67 0.70 0.61 0.64 0.61 0.70 0.44 0.64 1.00 M21 0.76 0.73 0.61 0.61 0.52 0.52 0.70 0.64 0.61 0.70 0.67 0.61 0.52 0.55 0.70 0.67 0.70 0.55 0.58 0.76 1.00 M22 0.76 0.73 0.67 0.67 0.58 0.52 0.70 0.58 0.67 0.88 0.85 0.67 0.70 0.61 0.64 0.61 0.64 0.44 0.64 0.94 0.82 1.00 M23 0.76 0.73 0.61 0.61 0.52 0.52 0.70 0.70 0.79 0.88 0.85 0.79 0.70 0.55 0.76 0.73 0.70 0.61 0.76 0.82 0.82 0.82 1.00 M24 0.61 0.58 0.70 0.58 0.73 0.61 0.55 0.44 0.64 0.73 0.70 0.70 0.73 0.64 0.55 0.47 0.55 0.47 0.67 0.85 0.67 0.79 0.73 1.00 M25 0.61 0.58 0.64 0.52 0.61 0.67 0.55 0.55 0.82 0.73 0.70 0.88 0.73 0.58 0.55 0.58 0.55 0.58 0.79 0.67 0.61 0.67 0.79 0.82 1.00
Hệ số tƣơng đồng di truyền phản ánh quan hệ di truyền của các mẫu chè nghiên cứu với nhau. Hai mẫu chè càng gần nhau về mặt di truyền thì hệ số tƣơng đồng giữa chúng càng lớn và ngƣợc lại hai mẫu chè có hệ số tƣơng đồng di truyền thấp thì mối quan hệ di truyền của chúng càng xa nhau.
Bảng 3.4 thể hiện hệ số tƣơng đồng di truyền của từng cặp mẫu chè nghiên cứu. Từ kết quả trên ta thấy, hệ số di truyền giữa 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thu thập từ 3 địa điểm khác nhau dao động trong khoảng từ 0,44 đến 0,97. Trong đó, hai giống M1 (chè Keo Am Tích - C.ty chè Sông Cầu) và M2 (chè Hùng Đỉnh Bạch - C.ty chè Sông Cầu), mẫu M10 (chè Bát Tiên - Công ty chè Sông Cầu) và M11 (Yakatamidozi - Công ty chè Sông Cầu) có hệ số tƣơng đồng lớn nhất là 0,97; còn các cặp giống M18 (chè LDP2 - Xã Tân Cƣơng) và M20 (chè Trung Du - xã Tân Cƣơng), mẫu M18 (chè LDP2 - Xã Tân Cƣơng) và M22 (chè Kim Tuyên - Xã Trại Cài), mẫu M8 (chè Yabukita - Công ty chè Sông Cầu) và M24 (chè LDP1 - Xã Trại Cài) có hệ số tƣơng đồng thấp nhất là 0,44.
Sau khi phân tích hệ số đồng dạng, chúng tôi tiến hành xây dựng sơ đồ hình cây thể hiện ở hình 3.9 để chỉ ra sự sai khác di truyền của các mẫu chè nghiên cứu. Mức độ khác nhau đƣợc biểu hiện bằng hệ số sai khác giữa các mẫu chè nghiên cứu. Các mẫu nghiên cứu có hệ số di truyền cao đƣợc xếp vào một nhóm và giữa các nhóm lại có liên kết với nhau.
Hình 3.9. Sơ đồ quan hệ di truyền của 25 mẫu chè nghiên cứu
Biểu đồ hình cây (hình 3.9) tạo đƣợc khi phân tích 25 mẫu chè nghiên cứu với 9 cặp mồi SSR chia làm 2 nhóm chính:
Nhóm I: gồm 1 mẫu chè là M18 (chè LDP2 - xã Tân Cƣơng) và mẫu
nghiên cứu này có hệ số di truyền sai khác so với các mẫu khác trong nghiên cứu thuộc nhóm II là 0,43 (1 - 0,57).
Nhóm II:bao gồm 24 mẫu chè còn lại và tiếp tục phân thành 2 nhánh phụ:
+ Nhánh phụ I: bao gồm 12 mẫu chè là M9, M10, M11, M12, M13 (thu thập tại Công ty chè Sông Cầu), M19, M20 (thu thập tại Xã Tân Cƣơng), M21, M22, M23, M24, M25 (thu thập tại Xã Trại Cài). Các mẫu thuộc nhánh này có hệ số di truyền sai khác so với các mẫu thuộc nhánh phụ II là 0,18 (1 - 0,82). Trong nhánh phụ này lại chia thành 2 cụm (cụm 1 và cụm 2):
Cụm 1: gồm 5 mẫu là M9, M19, M12, M25, M13. Hệ số di truyền sai khác của các mẫu này so với các mẫu chè ở cụm 2 là 0,18 (1 - 0,82).
Cụm 2: gồm 7 mẫu là M10, M11, M20, M22, M23, M24, M21. Trong đó, cặp mẫu M10 và M11 (thu thập tại Công ty chè Sông Cầu) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao nhất là 0,97. Tiếp theo là cặp mẫu M20 (thu thập tại Xã
Tân Cƣơng) và M22 (thu thập tại Xã Trại Cài) có hệ số tƣơng đồng di truyền cao thứ hai là 0,94.
+ Nhánh phụ II: gồm 12 mẫu còn lại và chia thành 2 cụm (cụm 1’ và cụm 2’):
- Cụm 1’: gồm 7 mẫu chè là M1, M2, M7, M8 (thu thập tại Công ty chè Sông Cầu), M16, M15, M17 (thu thập tại Xã Tân Cƣơng). Hệ số di truyền sai khác của cụm này so với các mẫu chè ở cụm 2’ là 0,08 (1 - 0,92). Điều đáng chú ý ở cụm này có cặp mẫu M1 và M2 có hệ số di truyền tƣơng đồng cao nhất là 0,97.
- Cụm 2’: gồm 5 mẫu là M3, M4, M14, M5, M6 (thu thập tại Công ty chè Sông Cầu), các mẫu này có hệ số tƣơng đồng di truyền là 0,88.
Từ kết quả phân nhóm trên, chúng tôi nhận thấy tính đa hình của 25 mẫu chè nghiên cứu trong phạm vi phân tích 9 cặp mồi SSR bằng phản ứng PCR - SSR đã chứng minh cho sự khác nhau trong cấu trúc DNA giữa các mẫu chè nghiên cứu.
Qua việc phân tích biểu đồ quan hệ di truyền và bảng hệ số tƣơng đồng di truyền có thể thấy giữa các giống chè mức độ đa dạng di truyền cao thể hiện ở mức độ sai khác di truyền dao động từ 0,03 đến 0,43 chứng minh đƣợc sự sai khác trong cấu trúc gen của các mẫu chè nghiên cứu.
Trong 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thu từ 3 địa điểm trồng chè khác nhau (xã Tân Cƣơng, xã Trại Cài, Công ty chè Sông Cầu). Tuy nhiên, các mẫu chè từ cùng một giống nhƣng thu thập từ 3 địa điểm khác nhau thì có sự sai khác về hệ số di truyền. Do đó, để tìm đƣợc chỉ thị SSR đặc trƣng cho các giống chè thì cần nghiên cứu ở nhiều mẫu và nhiều mồi hơn.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận
1. Đã tách chiết đƣợc DNA tổng số của 25 mẫu chè nghiên cứu thu thập tại tỉnh Thái Nguyên. Qua kiểm tra cho thấy, các mẫu DNA tổng số tách chiết đƣợc đều có chất lƣợng tốt, đảm bảo có thể dùng trong các thí nghiệm tiếp theo.
2. Với 9 cặp mồi bằng việc thực hiện kỹ thuật PCR - SSR đã nhân bản đƣợc 254 phân đoạn DNA từ hệ gen của 25 mẫu chè nghiên cứu. Trong số 9 cặp mồi đƣợc sử dụng đều thể hiện tính đa hình. Xây dựng đƣợc cây sơ đồ quan hệ di truyền cho thấy 25 mẫu chè nghiên cứu chia thành 2 nhóm chính, hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 2 nhóm là 57% .
2. Kiến nghị
Cần kết hợp chỉ thị SSR với các chỉ thị phân tử nhƣ RFLP, AFLP, RAPD và chỉ thị hình thái… để phân tích đa dạng di truyền của các mẫu chè nhằm đạt độ tin cậy cao hơn, mở rộng nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các giống địa phƣơng nhằm phục vụ công tác bảo tồn nguồn gen cây chè.
CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
Hoàng Thị Thu Yến, Lê Quang Thƣơng, Dƣơng Thị Nhung, Hà Thị Loan (2014), "Nghiên cứu chỉ thị phân tử SSR ở một số giống/dòng chè trồng tại Thái Nguyên", Tạp chí khoa học & công nghệ Thái Nguyên, tập 120, số 06,
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp.
2. Đƣờng Hồng Dật (2004), Cây chè các biện pháp nâng cao năng suất và
chất lượng sản phẩm, NXB Lao động - Xã hội, tr:5-53.
3. Chu Thúc Đạt (2003), Đánh giá tiềm năng phát triển chè và nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển, năng suất và chất lượng của một số giống chè mới ở Thái Nguyên, Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp.
4. Trịnh Đình Đạt (2007), Công nghệ sinh học - tập 4, NXB Giáo dục. 5. Hiệp hội chè Việt Nam (2011), “Báo cáo Tổng kết công tác năm 2010 và
phương hướng công tác năm 2011”.
6. Nguyễn Thị Thu Hƣơng, Nguyễn Thị Thu Phƣơng, Hoàng Văn Chung, Hoàng Thị Thu Yến (2010), “Bƣớc đầu nghiên cứu đa dạng di truyền ở một số dòng chè Shan (Camellia sinensis var. Assamica (Mast) Pierre sec. Phamh) bằng kỹ thuật RAPD”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Thái Nguyên, 65, tr:149-157.
7. Lê Tất Khƣơng (1997), Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển của một số giống chè mới và biện pháp kĩ thuật nâng cao năng suất chất lượng chè vụ Đông - Xuân ở Bắc Thái, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp.
8. Lê Tất Khƣơng, Hoàng Văn Chung, Đỗ Ngọc Oanh (1999), Giáo trình cây chè, NXB Nông nghiệp.
9. Nguyễn Hữu La, Lê Trần Bình (2004), “Nghiên cứu đa dạng di truyền một số dòng chè Shan ở Phú Hộ bằng chỉ thị RAPD”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 10, tr:31-33.
10. Nguyễn Hữu La (1998), “Thu thập, bảo quản, đánh giá tập đoàn giống
chè ở Phú Hộ”, Tuyển tập các công trình nghiên cứu về chè 1988 - 1997,
11. Trần Đình Long , Mai Hoàng Thạch , Hoàng Tuyết Minh (1997), Chọn giống cây trồng, Giáo trình cao học Nông Nghiệp, NXB Nông nghiệp.
12. Lã Tuấn Nghĩa, Vũ Đức Quang, Trần Duy Quý (2004), Cơ sở lý thuyết và ứng dụng công nghệ gen trong chọn tạo giống cây trồng, NXB Nông nghiệp.
13. Đỗ Ngọc Quý , Đỗ Thị Ngọc Oanh (2008), Kỹ thuật trồng và chế biến chè năng suất cao - chất lượng tốt, NXB Nông nghiệp, tr:7-66.
14. Đỗ Ngọc Quý, Lê Thất Khƣơng (2000), Giáo trình cây chè sản xuất, chế
biến và tiêu thụ, NXB Nông nghiệp.
15. Vũ Thị Quý (2013), “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học và biện pháp
kỹ thuật canh tác cho một số giống chè nhập nội tại Thái Nguyên”, Luận
án Tiến sĩ nông nghiệp, tr:70-71.
16. Trần Đức Trung (2009), “Nghiên cứu sự đa dạng di truyền các giống/
dòng chè (Camellina sinensis(L.)O. Kuntze) ở Việt Nam bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử microsatellite(SSR)”, Luận văn Thạc sĩ, Trƣờng
Đại học Bách khoa Hà Nội.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
17. Chen L., Yamaguchi S. (2005), “RAPD markers for discriminating tea germplasms at the inter-specific level in China”, Plant Breeding, 124,
pp:404-409.
18. Dikshirt H.K., Jhang T., Kondal N.K., Bansal K.C., Chandra N., Tickoo J.N., Ksharma T.R. (2006), “Genetic differentiantion of Vigna specie by
RAPD, URP and SSR marker”, Biology Plantarum journal, pp:451-457. 19. Holton T.A. (2001), “Plant genotyping by analysis of microsatellite”,
Plant Genotyping: the DNA fingerprinting of plant, CAB International. 20. Innis M.A., Gelfand D.H., Sninsky J.J., White T.J. (1990) ,“PCR
protocol: Aguile to methods and ampilication”. Academic Press, pp:482. 21. Jeffrey A., Thompson, Nelson R.L. (1998), “Identification of diverse
22. Kondo K. (1979), “Cytological studies in cultivated species of camellia”,
Japan J. Breed, 29(3), pp:205-210.
23. Lee S., Kim J., Sano J. (2003), “Phylogenetic relationships among tea cultivars based on AFLP analysis”, Journal of Faculty of Agriculture, Kyushu University, 47(2), pp:289-299.
24. Legesse B.W., Myburg A.A., Pixley K.V., Botha A.M. (2007), “Genetic diversity of African maize inbred lines revealed by SSR markers”,
Hereditas, 144(1), pp:10-17.
25. Ma J.Q., Zhou Y.H., Ma C.L., Yao M.Z., Jin J.Q., Wang X.C., Chen L. (2010)“ identification and characterization of 74 novel polymorphic EST - SSR markers in the tea plant, Camellia sinensis (Theaceae)”, American
Journal of Botany: 97(12), pp:153-156.
26. Miranda O.K., Rios L.P., Augusto F.G.A., Zagatto Paterniani M.E., de Souza A.P. (2004), “Evaluating genetic relationships between tropical maize inbred lines by means of AFLP profiling”, Hereditas, 140(1),
pp:24-33.
27. Mishra R.K., Mandi S.S. (2004), “Molecular profiling and development of DNA marker associated with drought tolerance in tea clones growing in Darjeeling), Current Science, 87 (1), pp:60-66.
28. Mondal T.K. (2004), “Biotechnological improvement of tea”, ISB new report.
29. Qilun Y., Kecheng Y., Guangtang P., Tingzhao R. (2007), Genetic Diversity of Maize (Zea mays L.) Landraces from Southwest China Based on SSR, Genetic Diversity of Maize (Zea mays S.) Landraces from Southwest China Based on SSR, 34(9), pp:851-860.
30. Raina S.N.V., Kojima T., Ogihara Y., Singh K.P., Devarumath R.M. (2001), “RAPD and SSR figerprints as useful genetic marker for analysis of genetic diversity, varietal identification, and phylogenetic relationships in peanut (Arachis hypogaea L.) cultirs and wild species”,
31. Sain S.M., Priyadarshan, P.M., (2009), Breeding Plantation Tree Crops:
Tropical Species, pp:545-589.
32. Scott K.D. (2001), “Microsatellite derived from ESTs, and their comparison with those derived by other methods”, Plant Genotyping: the
DNA fingerprinting of plant, CAB International.
33. Sharma R.K., Bhardwaj P., Negi R., Mohapatra R., Ahuja P.S (2009), “Identification characterization and utilization of unigene derived microsatellite markers in tea (Camellia sinensis L.)”, BioMed Central,
pp:7-12.
34. Sharopova N., McMullen M.D., Schultz L., Schroeder S., Sanchez- Villeda H., Gardiner J., et al. (2002) “Development and mapping of SSR markers for maize”, Plant Mol Biol. 48(5-6), pp:463-481.
35. Singh D., Ahuja P.S. (2006), “5S rDNA gene diversity in tea (Camellia
sinensis (L.) O. Kuntze) and its use for variety identification”, Genome,
49, pp:91-96.
36. Somasundaram S.T, Kalaiselvam M. (2007), Molecular tool for assessing genetic diversity.
37. Tanaka J., Taniguchi F. (2006), “Estimation of genome size of tea (Camellia sinensis), Camellia (C. japonica), and their interspecific
hybrids by flow cytometry”, Chagyo Kenkyu Hokoku, 101, pp:1-7.
38. Tautz D. (1993), “Notes on the difinition and nomenclature of tandemly repetitive DNA sequences”, DNA fingerprinting: State of science,
Birkhauser, Switzerland, pp:21-28.
39. Trojanowska M.R., Bolibok H. (2004), “Characteris and comparison of three classes of microsatellite-based markers and their application in plants”, Cellular & molecular biology letters, 9, pp:221-238.
40. Ujihara T., Ohta, R., Hayashi, N. et al. (2009), “Identifiaction od Japanese and Chinese green tea cultivars by using simple sequence repeat markers to encourage proper labeling”, Biosci. Biotechnol. Biochem., 73 (1), pp:15-20.
41. Welsh J., McClelland M. (1990), "Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primer", Nucleic Acids Res, 18, pp:7213-7218.
42. Wen S.C., Huan, H.Y. et al. (2008), “RAPD analysis on genetic diversity of typical tea population in Hunan Province, China”, Journal of Agricultural Biotechnology, 5, (1), pp:67-72.
43. William J.G.K, Kubelik A.E., Levak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic merers”, Nucleic Acids Res, 18, pp:6531-6535.
44. Yao M.Z, Chen L., Liang Y.K. (2008), “Genetic diversity among tea cultivars from China, Japan and Kenya revealed by ISSR markers and its implication for parental selection in tea breeding programmes”, Plant Breeding, 127 (2), pp:166-172.
Phụ lục
Bảng 1. Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản khi điện di sản phẩm PCR - SSR
của 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS28
(M1 - M25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
YS28 M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 290bp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 300bp 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 0 310bp 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 320bp 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 0 Tổng 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 YS28 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 290bp 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 300bp 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 310bp 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 320bp 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 Tổng 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Bảng 2. Số phân đoạn DNA đƣợc nhân bản khi điện di sản phẩm PCR - SSR