3. Nội dung nghiên cứu
2.2.6. Phân tích số liệu
Dựa vào hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR, sự xuất hiện các băng điện di đƣợc ƣớc lƣợng kích thƣớc và thống kê với từng mồi ở từng mẫu nghiên cứu. Sự xuất hiện hay không xuất hiện các băng điện di đƣợc tập hợp để phân tích số liệu theo nguyên tắc: số 1- xuất hiện phân đoạn DNA (băng DNA) và số 0 - không xuất hiện phân đoạn DNA. Các dữ liệu này đƣợc mã hóa thành dữ liệu nhị phân trên phần mềm Excel 2007. Các kết quả sau khi đƣợc mã hóa sẽ đƣợc xử lý trên máy vi tính bằng phần mềm NTSYS pc version 2.0 để xác định quan hệ di truyền của các giống chè ở mức độ phân tử.
Chƣơng 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết DNA tổng số từ lá chè
DNA tổng số là vật liệu khởi đầu cho mọi nghiên cứu ở cấp độ phân tử. Do vậy chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số tƣ̀ lá của 25 mẫu chè theo phƣơng pháp của Samuel (1994), Anwanda và đtg (1997) có cải tiến [18], [21].
Kết quả điện di sản phẩm tách DNA tổng số của 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số trên gel agarose 0.8% của 25 mẫu chè nghiên cứu
(1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Từ hình 3.1 ta thấy: ở cả 25 mẫu chè nghiên cứu đều xuất hiện một băng sáng và tƣơng đối gọn, không bị đứt gãy, rõ ràng nằm gần giếng điện di. Do đó sản phẩm DNA tổng số thu đƣợc có thể sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Để xác định nồng độ và độ tinh sạch của dung dịch DNA tách chiết phục vụ các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành đo độ hấp thụ của DNA theo phƣơng pháp đã đƣợc trình bày ở mục 2.2.4. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
Bảng 3.1. Phổ hấp thụ DNA tổng số ở bƣớc sóng 260nm và 280nm của 25 mẫu chè Mẫu OD260 (nm) OD280 (nm) Tỷ số OD260/OD280 1 0,08 0,047 1,7 2 0,16 0,084 1,9 3 0,085 0,045 1,8 4 0,13 0,068 1,9 5 0,12 0,06 2 6 0,17 0,094 1,8 7 0,087 0,048 1,8 8 0,07 0,035 2 9 0,1 0,05 2 10 0,11 0,066 1,7 11 0,09 0,05 1,8 12 0,13 0,065 2 13 0,1 0,05 2 14 0,06 0,032 1,9 15 0,13 0,07 1,8 16 0,09 0,049 1,8 17 0,16 0,09 1,9 18 0,12 0,06 2 19 0,05 0,026 1,9 20 0,12 0,068 1,8 21 0,095 0,054 1,8 22 0,12 0,062 1,9 23 0,11 0,061 1,8 24 0,15 0,075 2 25 0,09 0,05 1,8
Từ bảng 3.1, ta thấy tỷ số OD260/OD280 dao động trong khoảng 1,7 - 2,0; chứng tỏ mẫu DNA tổng số tách chiết đƣợc của các mẫu chè nghiên cứu tƣơng đối sạch đảm bảo để tiến hành phản ứng PCR - SSR.
Sau khi tách chiết DNA tổng số chúng tôi đã tiến hành pha loãng hàm lƣợng DNA về hàm lƣợng 90 ng/µl để phục vụ cho nghiên cứu đa hình DNA.
3.2. Phân tích chỉ thị SSR ở các mẫu chè nghiên cứu
Sau khi tách chiết DNA tổng số có hàm lƣợng cao và chất lƣợng tốt, chúng tôi tiến hành các phản ứng PCR - SSR với 9 cặp mồi đặc hiệu, đó là các mồi YS98, YS28, YS27, YS64, YS83, YTS104, YS3, YS19, YS46 để phân tích chỉ thị SSR ở 25 mẫu chè nghiên cứu.
Sản phẩm PCR - SSR với các mồi khác nhau đƣợc điện di trên gel agarose 3% để phân tích tính đa hình DNA của 25 mẫu chè nghiên cứu. Kết quả phân tích sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi thu đƣợc (bảng 3.2) cho thấy, số lƣợng các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản với mỗi cặp mồi dao động từ 22 đến 45 phân đoạn. Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản dao động trong khoảng từ 120 bp đến 600 bp.
Khi điện di sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi ở các mẫu số M11 và M12 có số phân đoạn nhiều nhất là 12 phân đoạn và các mẫu M21 và M23 có số phân đoạn ít nhất là 7 phân đoạn đƣợc nhân bản.
Bảng 3.2. Tổng số phân đoạn DNA của sản phẩm PCR - SSR với 9 cặp mồi
Mồi
Mẫu YS98 YS28 YS27 YS64 YS83 YTS104 YS19 YS46 YS3 Tổng
M1 2 1 1 1 1 1 0 1 1 9 M2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M3 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M4 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M5 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M6 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M7 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M8 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M9 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M10 2 1 2 1 1 1 1 1 1 11 M11 2 1 2 2 1 1 1 1 1 12 M12 2 1 2 2 1 1 1 1 1 12 M13 2 1 1 2 1 1 1 1 1 11 M14 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 M16 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M17 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M18 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M19 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 M20 2 1 1 1 1 1 1 2 1 11 M21 1 1 1 1 1 1 0 0 1 7 M22 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 M23 1 1 1 1 1 1 0 0 1 7 M24 1 1 1 1 1 1 1 2 1 10 M25 2 1 1 1 1 1 1 1 1 10 Tổng 45 25 31 28 25 14 22 27 25 254
Tính đa hình thể hiện ở sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn khi so sánh giữa các mẫu chè nghiên cứu với nhau trong cùng 1 mồi. Điều này đƣợc tổng kết và thể hiện qua tỷ lệ phân đoạn đa hình ở mỗi mồi nghiên cứu trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Số phân đoạn DNA xuất hiện và số phân đoạn DNA đa hình đối với mỗi mồi
STT Mồi Số phân đoạn
DNA Số phân đoạn DNA đa hình Tỷ lệ phân đoạn đa hình (%) 1 YS98 3 2 66,67 2 YS28 4 4 100 3 YS27 4 4 100 4 YS64 4 4 100 5 YS83 3 3 100 6 YTS104 5 5 100 7 YS19 4 4 100 8 YS46 4 4 100 9 YS3 3 3 100 Tổng 34 33 97,06
Qua phân tích bảng 3.3 nhận thấy, tổng số phân đoạn DNA của 25 mẫu chè nghiên cứu khi phân tích chỉ thị SSR là 34 phân đoạn đƣợc nhân bản, trong đó có 33 phân đoạn cho tính đa hình (chiếm 97,06%) và không đa hình là 1 phân đoạn (chiếm 2,94%). Kích thƣớc các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản trong khoảng từ 120bp đến 600 bp. Số lƣợng các phân đoạn tƣơng ứng với mỗi mồi nằm trong khoảng 3 đến 5 phân đoạn, trong đó mồi nhân bản đƣợc ít phân đoạn DNA nhất là các cặp mồi YS98, YS83, YS3 (3 phân đoạn), và mồi nhân đƣợc nhiều phân đoạn DNA nhất là mồi YTS104 (5 phân đoạn).
Bảng 3.3 cũng cho thấy, cả 9 mồi SSR mà chúng tôi đã sử dụng trong nghiên cứu đều biểu hiện tính đa hình. Tuy nhiên, mức độ đa hình giữa các mồi là khác nhau. Mức độ đa hình của mỗi mồi nghiên cứu dao động từ 66,67% đến 100%. Trong đó m ồi biểu hiện tính đa hình thấp nhất là mồi YS98 (66,67%), còn lại các mồi biểu hiện tính đa hình cao là các mồi YS83, YS3, YS46, YS19, YS27, YTS104, YS28, YS64 (100%).
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng PCR - SSR trên gel agarose 3% của một số mồi đặc trƣng ở 25 mẫu chè nghiên cứu đƣợc thể hiện trên các hình 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8.
Mồi YS28
Theo nghiên cứu đã công bố của Sharma và đtg (2009), cặp mồi YS28 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (TG)12(GA)13 và có kích thƣớc trong khoảng 170 - 200 bp. Trong khi đó, với các mẫu chè chúng tôi đã thu thập đƣợc tại tỉnh Thái Nguyên để nghiên cứu thì các phân đoạn DNA thu đƣợc lại dao động trong khoảng từ 290 - 320 bp. Nhƣ vậy, kết quả nghiên cứu của chúng tôi khác so với kết quả mà Sharma và đtg đã công bố [33].
Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm SSR của 25 mẫu chè với mồi YS28
(M: Marker 100 bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Kết quả điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè nghiên cứu với mồi YS28 (hình 3.2) cho thấy các băng có kích thƣớc ƣớc tính dao động trong khoảng 290 đến 320 bp. Với mồi YS28 xuất hiện các phân đoạn DNA
ở 4 kích thƣớc khác nhau (290 bp, 300 bp, 310 bp, 320 bp). Đặc biệt ở kích thƣớc 290 bp chỉ có hai mẫu xuất hiện băng DNA là mẫu số 18 (giống chè LDP2) và mẫu số 19 (giống chè Trung Du). Ở vị trí phân đoạn có kích thƣớc 320 bp chỉ có ở 4/25 mẫu nghiên cứu, đó là các mẫu M3, M4, M13 và M14, số mẫu xuất hiện nhiều nhất là ở vị trí có kích thƣớc 300 bp với 15/25 mẫu nghiên cứu.
Nhƣ vậy, từ kết quả trên ta thấy với cặp mồi YS28 tính đa hình đƣợc thể hiện rõ rệt.
Mồi YS64
Hình 3.3. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS64
(M: Marker 100bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Theo kết quả đã công bố của Ma và đtg (2010), cặp mồi YS64 (mang mã số GE651667) khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (TTGTT)5 và kích thƣớc dao động trong khoảng 260 - 275 bp [25].
Với kết quả thể hiện trong hình 3.3 ta thấy, sản phẩm nhân gen với mồi YS64xuất hiện các phân đoạn DNA với kích thƣớc dao động từ 240 - 310 bp và số phân đoạn DNA xuất hiện ở các mẫu nghiên cứu dao động từ 1 - 2 phân đoạn.
Đối với mồi YS64 cũng thể hiện tính đa hình rõ rệt. Biểu hiện là tất cá các vị trí băng xuất hiện đều có tính đa hình. Đặc biệt tại kích thƣớc 270 bp chỉ có hai mẫu xuất hiện phân đoạn DNA là mẫu số 18 và mẫu số 19. Có 3 mẫu là M11, M12, M13 xuất hiện băng ở vị trí kích thƣớc cao nhất khoảng 310 bp còn
các mẫu còn lại không xuất hiện. Tiếp theo là ở vị trí có kích thƣớc 280 bp, số mẫu xuất hiện các phân đoạn DNA nhiều nhất (với 14/25 mẫu nghiên cứu).
Mồi YS27
Với cặp mồi YS27 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (GA)20 với kích thƣớc dao động trong khoảng 80 - 110 bp theo công bố của Sharma và đtg (2009).
Qua kết quả điện di sản phẩm PCR - SSR của mồi YS27 thể hiện ở hình 3.4 ta thấy xuất hiện tổng số 31 phân đoạn DNA, có kích thƣớc dao động từ 130 - 180 bp, và số phân đoạn DNA xuất hiện ở các mẫu nghiên cứu dao động từ 1 đến 2 phân đoạn. Trong đó, phân đoạn đƣợc nhân bản ở kích thƣớc 130 bp chỉ xuất hiện duy nhất ở mẫu số M21(Trung du - xã Minh Lập) còn tất cả các mẫu khác thì không. Đặc biệt tính đa hình của cặp mồi này còn thể hiện ở các kích thƣớc 150 bp và 180 bp xuất hiện ở 3 mẫu là M6, M7, M8; kích thƣớc 140 bp và 180 bp cũng xuất hiện ở 3 mẫu là M10, M11, M12.
Từ trên ta nhận thấy ở mồi YS27 cũng đã thể hiện tính đa hình cao với các mẫu chè nghiên cứu.
Hình 3.4. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS27
Mồi YS98
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS98
(M: Marker 100bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Theo kết quả công bố của Sharma và đtg (2009) thì cặp mồi YS98 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (TTGTG)8 và kích thƣớc các phân đoạn DNA dao động trong khoảng 280 - 380 bp.
Sản phẩm nhân gen các đoạn có trình tự lặp lại ở 25 mẫu chè nghiên cứu với cặp mồi Y98 có chiều dài ƣớc tính 240 - 600 bp, số phân đoạn DNA xuất hiện ở các mẫu nghiên cứu dao động từ 1 - 2 phân đoạn. Tại kích thƣớc khoảng 240 bp tất cả các mẫu đều xuất hiện băng DNA.
Nhƣ vậy cặp với mồi Y98, trong 3 kích thƣớc mà phân đoạn DNA xuất hiện thì có 1 kích thƣớc không thể hiện tính đa hình (240 bp) và có 2 kích thƣớc thể hiện tính đa hình (590 bp và 600 bp).
Mồi YS83
Hình 3.6. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR - SSR của 25 mẫu chè với mồi YS83
Với kết quả thể hiện trong hình 3.6 ta thấy: sản phẩm nhân lên với mồi YS83 xuất hiện tất cả 25 băng DNA có kích thƣớc dao động từ 290 - 320 bp, có tất cả 3 vị trí thể hiện tính đa hình của cặp mồi này (290bp, 300bp, 320 bp). Trong đó, ở kích thƣớc 290 bp chỉ xuất hiện ở mẫu số 9, 18, 19. Ở vị trí kích thƣớc 300 bp có nhiều mẫu xuất hiện phân đoạn DNA có kích thƣớc này nhất ( cụ thể là có tới 14/25 mẫu) các mẫu còn lại không xuất hiện. Nhƣ vậy mồi YS83 cũng thể hiện tính đa hình cao.
Cặp mồi YS83 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại là (TGG)9 và các phân đoạn đƣợc nhân lên có kích thƣớc dao động trong khoảng 250 - 600 bp [44]. Kích thƣớc các phân đoạn DNA thu đƣợc ở các mẫu chè chúng tôi nghiên cứu (290 - 320 bp) phù hợp với nghiên cứu của tác giả Sharma và đtg (2009).
Mồi YTS104
Cặp mồi YTS104 (mã số GE650224) khuếch đại đoạn gen có trình tự lặp lai đơn giản là (TC)10 và có kích thƣớc dao động trong khoảng 285 - 300 bp [25].
Hình 3.7. Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YTS104
(M: Marker 100 bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Từ kết quả thu đƣợc ở hình 3.7 ta thấy:
Các phân đoạn DNA xuất hiện dao động trong khoảng 280 - 320 bp, trong đó phân đoạn DNA có kích thƣớc 280 bp chỉ xuất hiện ở mẫu M7 mà không xuất hiện ở tất cả các mẫu còn lại. Phân đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 290 bp xuất hiện ở 2 mẫu M14 (LDP2 - Sông Cầu) và M17
(Kim Tuyên - Tân Cƣơng). Ở vị trí phân đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 310 bp xuất hiện ở các mẫu M1 (Keo Am Tích - Sông Cầu) đến M6 (LDP1 - Sông Cầu), còn lại các mẫu khác không thấy xuất hiện. Có 4 mẫu M20, M21, M22, M24 xuất hiện phân đoạn DNA có kích thƣớc 320 bp và còn lại 21/25 mẫu nghiên cứu không thấy xuất hiện phân đoạn ở kích thƣớc này.
Điều đó chứng tỏ mồi YTS104 thể hiện tính đa hình cao ở các mẫu chè nghiên cứu và kết quả của chúng tôi thu đƣợc khá giống với kết quả đã đƣợc công bố [33].
Mồi YS3
Cặp mồi YS3 khuyếch đại đoạn gen có trình tự lặp lai đơn giản là (TC)10
và có kích thƣớc dao động trong khoảng 160 - 220 bp [33].
Hình 3.8. Điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3
(M: Marker 100 bp, 1 - 25: Các mẫu nghiên cứu theo thứ tự tại bảng 2.1)
Kết quả điện di sản phẩm PCR - SSR với mồi YS3 của 25 mẫu chè nghiên cứu, kích thƣớc của các phân đoạn dao động trong khoảng từ 120 - 160 bp, có 3 vị trí kích thƣớc phân đoạn DNA đƣợc nhân lên. Đặc biệt, ở vị trí phân đoạn có kích thƣớc 160 bp chỉ xuất hiện duy nhất ở mẫu M21 (Trung Du - xã Minh Lập) trong tổng số 25 mẫu chè nghiên cứu, mà không xuất hiện ở tất cả các mẫu còn lại. Phân đoạn có kích thƣớc 120 bp xuất hiện ở hầu hết các mẫu từ mẫu M1 đến mẫu M8 và từ mẫu M14 đến M18, các mẫu còn lại không thấy xuất hiện phân đoạn DNA đƣợc nhân bản này. Ở vị trí khoảng
140 bp có 11/25 mẫu nghiên cứu xuất hiện phân đoạn DNA có kích thƣớc này, cụ thể là các mẫu M9, M10, M11, M12, M13, M19, M20, M22, M23, M24, M25, còn các mẫu còn lại không thấy xuất hiện.
Nhƣ vậy, với cặp mồi YS3 có 3 kích thƣớc phân đoạn DNA đƣợc nhân lên (120bp, 140bp và 160 bp) đều thể hiện tính đa hình ở cả 3 vị trí kích thƣớc này. Kết quả chúng tôi thu đƣợc ở hình 3.8 cho thấy kích thƣớc của các phân đoạn DNA hoàn toàn giống so với kết quả đã đƣợc công bố bởi Sharma và đtg năm 2009 [33].
Mồi YS19
Cặp mồi YS19 (mã số GH733768) khuếch đại đoạn gen có trình tự lặp lại đơn giản là (AG)10 và có kích thƣớc dao động trong khoảng 400 - 410 bp [47].
Kết quả điện di sản phẩm PCR - SSR với cặp mồi YS19 khuếch đại phân đoạn DNA có kích thƣớc dao động trong khoảng từ 370 bp - 400 bp. Trong đó, ở các mẫu M1, M21, M23 không thấy xuất hiện phân đoạn nào tại tất cả các vị trí kích thƣớc mà các phân đoạn DNA đƣợc nhân bản. Đặc biệt, ở vị trí kích thƣớc khoảng 370 bp, có duy nhất 1/25 mẫu xuất hiện băng DNA tại vị trí này là mẫu M2 (Hùng Đỉnh Bạch - Sông Cầu), các mẫu còn lại không thấy xuất hiện. Chỉ có 2 mẫu trong tổng số 25 mẫu nghiên cứu xuất hiện băng tại vị trí kích thƣớc 380bp là M7 và M18, các mẫu còn lại không xuất hiện. Ở vị trí 390 bp có 8 mẫu xuất hiện phân đoạn DNA đƣợc nhân bản gồm M6, M8, M9,