Nghiên cứu trình tự gen mã hóa enzyme polyphenol odidase ở một số giống chè đặc sản trồng ở thái nguyên

i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM HỒNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE Ở MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - NĂM 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM HỒNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE Ở MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS HOÀNG THỊ THU YẾN THÁI NGUYÊN - NĂM 2014 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CAM ĐOAN Tơi cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả Phạm Hồng Điệp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ biết ơn sâu sắc tới TS Hoàng Thị Thu Yến - Giảng viên Khoa Khoa học Sự sống - Trường Đại học Khoa học, giáo viên hướng dẫn tơi tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm quý báu suốt thời gian qua để tơi hồn thành luận văn Tơi xin cảm ơn cán Phịng thí nghiệm Khoa Khoa học Sự sống Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện Khoa học sống Đại học Thái Nguyên, Viện nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi q trình thực luận văn Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới hộ gia đình thuộc vùng chè Tân Cương - Thành phố Thái Nguyên giúp đỡ thời gian thu thập mẫu vật nghiên cứu làm luận văn Cuối cùng, xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè, đồng nghiệp nhóm nghiên cứu di truyền phân tử ủng hộ, động viên suốt thời gian qua Thái Nguyên, tháng năm 2014 Tác giả Phạm Hồng Điệp Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii NHỮNG TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SƠ LƢỢC VỀ CÂY CHÈ 1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển chè 1.1.2 Đặc điểm sinh học chè 1.1.3 Giá trị chè 1.1.4 Tình hình sản xuất chè giới Việt Nam 10 1.1.5 Tình hình chế biến chè Việt Nam 12 1.1.6 Đặc điểm số giống chè trồng Thái Nguyên 14 1.2 KHÁI QUÁT VỀ POLYPHENOL OXIDASE……………………… 17 1.2.1 Vai trò Polyphenol oxidase (PPO)………………………………… 17 1.2.2 PPO chè………………………………………………………………… 19 1.2.3 Tình hình nghiên cứu PPO chè giới Việt Nam………… 19 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 VẬT LIỆU 22 2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 22 2.1.2 Hóa chất thiết bị 23 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.2.1 Phương pháp tách chiết DNA tổng số 23 2.2.2 Phương pháp điện di gel agarose 25 2.2.3 Phương pháp nhân gen PCR 25 2.2.4 Phương pháp tinh sản phẩm PCR 27 2.2.5 Tách dịng gen mã hóa PPO……………….……………… 28 2.2.6 Phương pháp xác định trình tự nucleotide 32 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 TÁCH DNA TỔNG SỐ TỔNG SỐ TỪ CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU 33 3.2 NHÂN GEN PPO Ở CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU 34 3.3 TÁCH DÒNG GEN PPO TỪ CÁC GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU 35 3.4 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN PPO TỪ GIỐNG NGHIÊN CỨU 3.5 PHÂN TÍCH, SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN PPO GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU…………………………………………………………… 37 40 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………… 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh Bp Cặp base Base pair cDNA cDNA Complementary DNA CTAB CTAB Cetyltrimethylammonium Bromid DNA Axit Deoxynucleic Deoxyribonucleic Acid dNTP dNTP Deoxynucleoside triphosphate Đtg đồng tác giả et al EDTA EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EtBr EtBr Ethidium Bromide FAO Tổ chức nông lương giới Food and Agriculture Organization Gb Gb Giga bazơ IPTG Cơ chất Iso - Propyl – Thiogalactoside Kb Kb Kilo bazơ LB Môi trường LB Luria Bertani PCR PPO RAPD RNase Phản ứng chuỗi trùng hợp Polyphenol oxidase DNA đa hình khuếch đại ngẫu nhiên Enzyme phân hủy RNA Số hóa Trung tâm Học liệu Polymerase Chain Reaction Polyphenol oxidase Random Amplify Polymorphism DNA Ribonuclease http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii RNA Axit Ribonucleic Ribonucleic Acid SDS SDS Natri Dodexyl Sulfat TAE TAE Tris Acetate EDTA Taq Vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Sản lượng chè số nước giới 10 1.2 Diện tích, sản lượng, xuất chè Việt Nam 11 1.3 Các loại sản phẩm phương pháp chế biến chè 12 1.4 Cơ cấu giống chè tỉnh Thái Nguyên giai đoạn 2001- 2010 14 2.1 Danh mục thiết bị sử dụng 23 2.2 Trình tự cặp mồi nhân gen PPO mẫu chè nghiên cứu 26 2.3 Thành phần phản ứng PCR nhân gen PPO 26 2.4 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR 26 2.5 2.6 Thành phần phản ứng ghép nối gen PPO vào vector pTZ57R/T Thành phần phản ứng cắt enzyme giới hạn SacI XhoI 29 31 Hệ số tương đồng di truyền giống chè nghiên cứu so 3.1 với trình tự cơng bố dựa trình tự nucleotide gen 42 PPO Hệ số tương đồng di truyền giống chè nghiên cứu so với 3.2 trình tự cơng bố dựa trình tự amino acid suy diễn 42 từ gen PPO Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ x DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Tên hình Trang Gen PPO mơ hình đoạn gen PPO tiến hành nghiên cứu phân tích hoạt tính 20 2.1 Vector pTZ57R/T 28 3.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu chè nghiên cứu 33 3.2 Hình ảnh điện di kết PCR khuếch đại gen PPO 34 3.3 3.4 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt sản phẩm PCR DNA plasmid So sánh trình tự nucleotide gen mã hóa PPO từ giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1 36 37 So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen PPO 3.5 giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1 với 41 trình tự cơng bố 3.6 Mối quan hệ trình tự gen PPO giống chè nghiên cứu chè Trung Quốc cơng bố Số hóa Trung tâm Học liệu 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 36 Các đoạn gen sau tinh kiểm tra điện di gel agarose 0,8% để kiểm tra chất lượng xác định sơ hàm lượng DNA tinh Kết điện di kiểm tra sản phẩm tinh cho thấy có băng vạch có kích thước tương ứng với sản phẩm PCR thu Từ sản phẩm PCR thu được, tiến hành ghép nối vào vector pTZ57R/T.Hỗn hợp phản ứng ghép nối biến nạp vào tế bào khả biến chủng E.coli DH5α cách sốc nhiệt 42 oC phút Sau biến nạp, cấy trải môi trường LB đặc (pepton, cao nấm men, NaCl, agar) có bổ sung thêm kháng sinh Ampicilin (50 µl/ml), IPTG (0,1 mM) X – gal (40 mg/ml) kết xuất khuẩn lạc xanh trắng 37 oC Sau nuôi, DNA plasmid tách chiết theo quy trình bước mục 2.5.2.3 kiểm tra kết gel agarose 0,8% Từ plasmid thu được, để khẳng định plasmid có mang đoạn gen sản phẩm PCR hay không, tiến hành phân tích plasmid enzyme giới hạn Hai enzyme lựa chọn SacI XhoI để phân tích dựa sở vector pZT57R/T có vị trí nhận biết enzyme giới hạn SacI, phân tích đồ giới hạn gen mã hóa PPO chương trình Bioedit, chúng tơi thấy gen khơng có vị trí nhận biết enzyme SacI Khi thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân gen mã hóa PPO, ngồi phần đặc hiệu mồi chúng tơi bổ sung thêm trình tự nhận biết enzyme giới hạn XhoI (6 nucleotide) vào trình tự mồi ngược Kết phân tích plasmid tái tổ hợp SacI XhoI thể hình 3.3 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 37 Hình 3.3 Hình ảnh điện di kiểm tra có mặt sản phẩm PCR DNA plasmid (Marker 1kb, 1, 3: dòng plasmid mang sản phẩm PCR tương ứng với giống chè Trung Du, Keo Am Tích, LDP1) Kêt trình 3.3 cho thấy, dòng plasmid mang sản phẩm PCR khuếch đại gen PPO từ giống nghiên cứu Trung Du Keo Am Tích, LDP1 thu băng DNA giống nhay: đoạn lớn có kích thước tương ứng với vector pTZ 57R/T (~ 2,8 kb) đoạn nhỏ có kích thước khoảng 1,8 kb tương ứng với sản phẩm PCR Như vậy, khẳng định dịng plasmid đoạn gen mã hóa PPO 3.4 PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GEN PPO CỦA GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU Từ dịng plasmid tái tổ hợp thu được, chúng tơi tiến hành tinh nhằm mục đích xác định trình tự gen PPO Trình tự gen mã hóa PPO từ giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1 gắn với vector pZT57R/T xác định Sau phân tích trình tự, chúng tơi thấy Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 38 sản phẩm PCR phân lập trình tự ORF hồn chỉnh mã hóa PPO Gen có kích thước 1,8 kb, mã hóa 599 amino acid mã kết thúc TAA Kết giống với kích thước gen PPO mẫu chè nghiên cứu công bố [19] [28] Kết so sánh trình tự gen PPO giống chè nghiên cứu thể hình 3.4 10 20 30 40 50 60 70 80 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | ATGGCTTCCATTCTCCCTCCAACCACCACCAAGACTACCACCACCTCCTCCACCCTCTCTTCTTATCCCATTTTCCAGAA T .A A A TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 90 100 110 120 130 140 150 160 | | | | | | | | | | | | | | | | CACCTCTAAAATTCCCACAATTAGAAAGCATAACCATCCCTTCAAAGTGTCATGCAGCAAAGCCAAAGATAGTGACCCAA T T .T .T .T 170 180 190 200 210 220 230 240 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | ACCTTACTCCCCCCTCCCAAAATACACAAACCTCCCAAGGGAAGTTTGATAGGAGAAACATGCTCATTGGCTTAGGAGGC T T TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 250 260 270 280 290 300 310 320 | | | | | | | | | | | | | | | | CTCTACGGAGCAGCCGGCCTCACCGACACTGACCCACCAGCCTTGGCCGCTCCGATCACCACCCCGGATTTATCCAAATG G G G G TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | CGGGGCGGCGGACTTACCCGCGGATGCAAAACCGACCAACTGTTGTCCTCCAAAAACCAACAAAATCATCGAATTCAAGC 410 420 430 440 450 460 470 480 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | TCCCTCATCCCTCCAACACTTTACGAGTCCGACCCGCGGCCCATTTAGCCGACGAAAAATACATAGCCAAGTTTTCTAAA C T C T 490 500 510 520 530 540 550 560 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GCCCTCCAACTCATGAAATCGCTCCCCGATGACGACCCACGAAGCTTCAAGCAACAATCCAATATTCACTGCGCTTATTG .T 570 580 590 600 610 620 630 640 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | CGAAGGCGCTTATCACCAAGTCGGTTTTCCAAGCACAGAGCTCCAAGTTCACAACTCATGGCTCTTCTTTCCCTCCCATA .A T .A T 650 660 Số hóa Trung tâm Học liệu 670 680 690 700 710 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 39 720 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GATTCTATCTCTACTTCTTCGAAAAGATTTTGGGAATGCTGCTCGATGATCCAGCGTTTGCAATTCCTTTTTGGAATTGG .G 730 740 750 760 770 780 790 800 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GATACTCCGGCGGGCATGAAAATACCCGCCATGTATGCGGACATAAATTCGCCACTCTATAACCGTCTCCGTGACGCCAA T .T 810 820 830 840 850 860 870 880 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | ACACCAGCCACCGACATTAATTGACCTTGACTACAATTTGACTGATCCAAAAAATGTCGATGAGGAGAAGCAGAAGTTGA G G 890 900 910 920 930 940 950 960 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GAAATCTAACTATAATGTACCGACAAGTGGTGTCGGGTGGGAAAACGCCTCGGCTTTTCCTTGGAAGCTCGTACCGTGCG G G 970 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GGAGATGACCCGGACCCAGGTGCCGGGTCCCTGGAGAACATCCCGCATGGTCCGGTTCACATATGGTGCGGGGACCGCAC 1050 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | CCAGCCGAATCTAGAAGACATGGGGAACTTCTACTCTGCGGGACGAGATCCGATCTTTTACGGTCATCACGCGAACGTCG C .C TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 | | | | | | | | | | | | | | | | ATCGGATCTGGACGGTGTGGAAGACATTAGAAGGAAAACGAAACGATTTCAAGGATCCGGATTGGTTGAATTCAGAGTTC G .T 1210 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | ACCTTTTACGACGAAAATGCTCAGCTTGTGACTGTAAAAGTAAAAGAGAGTTTGGATCATCGAAAACTCGGCTACGTCTA C TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 1290 1300 1310 1320 1330 1340 1350 1360 | | | | | | | | | | | | | | | | CCAAGACGTGGAAATTCCATGGCTAAACACTCGACCCAGTCCTCGTATTTCGAATTCTTTTCGAAAAATAAAGAACAAGG A T T .G 1370 1380 1390 1400 1410 1420 1430 1440 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | CCGGGAGAGCAATGGCGACAGAGACACTGGATTCTGCTGCCATTGTATTCCCAAGAAAGCTTGATGAGGTGGTGAAGGTG T T G A Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 40 1450 1460 1470 1480 1490 1500 1510 1520 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GTGGTGAAGCGGCCGACGAAGTCGAGGAGTGAGAGAGAGAAGGAAGAAGAGGAGGAGGTGGTGGTAGTGGAGGGGATAGA G T 1530 1540 1550 1560 1570 1580 1590 1600 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | GGTGGAGAGAGATGTGTCTGTGAAGTTTGATGTGTTTATTAACGACGAAGACGAGGCGGCGAGTGGGCCGGAGAAGACAG A T A 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | AGTTCGCCGGAAGCTTTGTGAATGTGCCGCGTAAACATAAGCATGACAAGAAGATAAGGACTGGGTTGACATTGGGGATA .C GG G 1690 1700 1710 1720 1730 1740 1750 1760 TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 | | | | | | | | | | | | | | | | ACTGAGCTATTGGAGGACTTGGAAGCTGAAGATGATGAGAGCGTGCTGGTGACTTTGGTCCCTAGATATGGGTCTGATGC A TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 1770 1780 1790 1800 | | | | | | | | TGTCACTATTGGTAGTGTCAAGATTGAGTTTGATTCTTAA .G .G Hình 3.4 So sánh trình tự nucleotide giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1 Trên hình 3.4 cho thấy, gen PPO giống chè Trung Du có 25 32 vị trí nucleotide sai khác tương ứng với giống LDP1 Keo Am Tích, có 21 vị trí sai khác nucleotide giống chè LDP1 Keo Am Tích Kết so sánh trình tự gen mã hóa PPO giống chè nghiên cứu trình tự nucleotide gen PPO có hệ số tương đồng di truyền cao khoảng từ 98,3-98,8%, tương đồng trình tự amino acid từ 96,3 - 97,6% 3.5 PHÂN TÍCH, SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN PPO CỦA GIỐNG CHÈ NGHIÊN CỨU VỚI CÁC TRÌNH TỰ ĐÃ CƠNG BỐ Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 41 Để khẳng định sai khác trình tự nucleotide amino acid PPO giống chè nghiên cứu có đặc tính đa hình hình hay đặc trưng cho giống, tiếp tục so sánh trình tự nucleotide amino acid PPO với trình tự cơng bố Genbank (mã số DQ513313, EF623826, EF635860, EU787433, EF650017, EF650016, JX465712, CQ192142 FJ210643) Khi so sánh trình tự nucleotide gen PPO từ giống chè nghiên cứu với trình tự công bố cho thấy gen PPO bảo thủ chè Hệ số tương đồng di truyền giống chè dao động từ 98,1-100% (Bảng 3.1) Giống chè Trung Du Việt Nam so với giống chè có mã số EF650017 có hệ số tương đồng di truyền thấp 98,1, hai giống chè Trung quốc với mã số JX465712 EU787422 có trình tự nucleotide gen PPO hồn toàn giống (tương đồng 100%) Điểm đáng lưu ý là, gen PPO giống chè Trung Du có 16 vị trí; chè Keo Am Tích vị trí, chè LDP1 có vị trí nucleotide sai khác mà vị trí giống tất giống chè Trung Quốc giống chè Việt Nam Hình 3.5: So sánh trình tự amino acid suy diễn PPO từ giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1 với trình tự cơng bố TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | MASILPPTTTKTTTTSSTLSSYPIFQNTSKIPTIRKHNHPFKVSCSKAKDSDPNLTPPSQNTQTSQGKFDRRNMLIGLGGLYGAAGLTDTDPPALAAPIT K I S.N .L V .Y K S.N .L V .Y K S.N .L V .Y K S.N .L V .V .Y K S.N .L V .V .Y K S.N .L V .V .Y K S.N .L V .V .K S.N .L V .Y K S.N .L V .V .Y S K S.N .L V .Y K S.N .L V TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TPDLSKCGAADLPADAKPTNCCPPKTNKIIEFKLPHPSNTLRVRPAAHLADEKYIAKFSKALQLMKSLPDDDPRSFKQQSNIHCAYCEGAYHQVGFPSTE A P I A P I A P I A P I A P I A P I H A P I A P I Q .V A P I A P I Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 FJ210643 A P I TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | LQVHNSWLFFPSHRFYLYFFEKILGMLLDDPAFAIPFWNWDTPAGMKIPAMYADINSPLYNRLRDAKHQPPTLIDLDYNLTDPKNVDEEKQKLRNLTIMY F S D F S .F S .F S .F S .F S .F S .F S .F S .F S .F .P S TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | RQVVSGGKTPRLFLGSSYRAGDDPDPGAGSLENIPHGPVHIWCGDRTQPNLEDMGNFYSAGRDPIFYGHHANVDRIWTVWKTLEGKRNDFKDPDWLNSEF A .G L V G L G S.C G S.C G S.C G S.C A .G S.C V G L C G S TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 410 420 430 440 450 460 470 480 490 500 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TFYDENAQLVTVKVKESLDHRKLGYVYQDVEIPWLNTRPSPRISNSFRKIKNKAGRAMATETLDSAAIVFPRKLDEVVKVVVKRPTKSRSEREKEEEEEV K .F .I G .F S I G I .F .I G A P F .I A .IF .I A F .I A F .I V F R - A F .I F .I G A S F .I TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 DQ513313 EF650017 EF623826 EF635860 EU787433 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 510 520 530 540 550 560 570 580 590 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | VVVEGIEVERDVSVKFDVFINDEDEAASGPEKTEFAGSFVNVPRKHKHDKKIRTGLTLGITELLEDLEAEDDESVLVTLVPRYGSDAVTIGSVKIEFDS .M .V R N G R G M S.R G M C S.R G M S.R G M S.R G M S.R G R N G M S.R G M S.R G M S.R G Bảng 3.1: Hệ số tƣơng đồng di truyền giống chè nghiên cứu so với trình tự cơng bố dựa trình tự nucleotide gen PPO TRUNGDU TRUNGDU KEOAMTICH LDP1 1,000 0,982 0,986 KEOAMTICH LDP1 DQ513313 1,000 DQ513313 EF623826 EF635860 EU787433 EF650017 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 0,983 0,982 0,982 0,982 0,981 0,983 0,982 0,982 0,982 0,987 0,988 0,987 0,987 0,987 0,986 0,988 0,987 0,987 0,987 1,000 0,990 0,989 0,989 0,990 0,988 0,987 0,990 0,990 0,990 1,000 0,992 0,992 0,992 0,991 0,985 0,992 0,999 0,992 1,000 0,998 0,999 0,997 0,984 0,999 0,991 0,995 EF623826 EF635860 EU787433 EF650017 EF650016 JX465712 GQ129142 FJ210643 Số hóa Trung tâm Học liệu 1,000 0,999 0,997 0,984 0,999 0,991 0,995 1,000 0,998 0,985 1.000 0,992 0,995 1,000 0,983 0,998 0,990 0,993 1,000 0,985 0,985 0,985 1,000 0,992 0,995 1,000 0,992 1,000 http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 Tương tự so sánh trình tự nucleotide, kết so sánh trình tự amino acid PPO bảo thủ chè, hệ số tương đồng di truyền giống chè dao động từ 95,9-100% (Bảng 3.1) Trình tự amino acid suy diễn PPO từ ố ồng Việt Nam nghiên cứu có độ tương đồng từ 95,9-98,4% so với trình tự cơng bố Trong đó, giống chè Trung Du Việt Nam có hệ số tương đồng di truyền thấp so với giống chè với mã số trình tự EF650017 (95,9%) Bảng 3.2: Hệ số tƣơng đồng di truyền giống chè nghiên cứu so với trình tự cơng bố dựa trình tự amino acid suy diễn từ gen PPO Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 Để phân tích tương đồng di truyền dựa trình tự amino acid PPO kiểm tra sai khác trình tự nucleotide dẫn đến sai khác trình tự amino acid liên quan đến vùng chức PPO, tiến hành xây dựng phân loại di truyền so sánh trình tự amino acid suy diễn PPO giống chè Trung Du, Keo Am Tích LDP1với trình tự cơng bố ngân hàng gen giới Kết thể hình 3.6 Hình 3.6: Mối quan hệ trình tự gen PPO giống chè nghiên cứu chè Trung Quốc công bố Mối quan hệ trình tự gen PPO giống chè nghiên cứu chè Trung Quốc công bố thể sơ đồ hình 3.5 Cây phân loại chia làm nhánh chính; nhánh có giống chè Trung Du; nhánh chia làm nhóm phụ: nhóm phụ gồm có giống Keo Am Tích giống chè có mã số EF650016; nhóm phụ gồm có giống LDP1 mẫu chè Trung Quốc lại Kết phù hợp với nguồn gốc giống nghiên cứu này, giống Keo Am Tích giống nhập nội từ Trung Quốc, giống LDP1 giống lai giống chè nhập từ Trung Quốc Ấn Độ (www.nomafsi.com.vn) Trong đó, Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 chè Trung Du giống hố trung du phía Bắc Việt Nam, trồng từ hạt Trên hình 3.6 cho thấy trình tự amino acid PPO giống chè LDP1 có vị trí sai khác so với giống chè trồng Việt Nam (Trung Du, Keo Am Tích) Trung Quốc (EU787433, EF650016, EF650017, EF623826, EF635860, DQ513313, JX465712): 398L S, 452S N, 461G E, 474I L Tương tự, giống chè Keo Am Tích có vị trí sai khác: 33I T, 295D N, 436K N, 489G R, 526V A; điều đặc biệt chè Trung Du có 13 vị trí sai khác: 26K Q, 40S P, 42N K, 60L Q, 99V Y, 101A T, 136P H, 140I T, 212F H, 242S T, 440F S, 557R T, 590G S) Protein PPO có trình tự peptide tín hiệu đến lục lạp có chiều dài 96 amino acid, hầu hết giống chè Trung Quốc LDP1, trình tự peptide giống nhau, giống chè Keo Am Tích có vị trí (33I T) giống chè Trung Du có vị trí (26K Q, 40S P, 42N K, 60L Q) amino acid sai khác so với trình tự cịn lại PPO enzyme chứa Cu, có vùng trình tự amino acid liên kết với Cu, là: Vùng (vị trí 183–240), Vùng (vị trí 336–378 vùng (vị trí 531– 567) Trong đó, vùng bảo thủ vùng chức liên kết với Cu Vùng (183–240) vùng (531–567) có trình tự amino acid tương đối bảo thủ chè, giống chè Trung Du có vị trí amino acid bị thay đổi (212F H, 557R T) Sự sai khác có ảnh hưởng đến hoạt tính PPO cần phải có nghiên cứu sâu Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Đã nhân, tách dịng xác định thành cơng trình tự gen mã hóa PPO giống chè nghiên cứu vector pZT57R/T Gen PPO có kích thước 1,8kb Gen PPO giống chè nghiên cứu có tính bảo thủ cao, có hệ số tương đồng trình tự nucloeitde từ 98,3-98,8%, tương đồng trình tự amino acid từ 96,3-97,6% PPO giống chè nghiên cứu so sánh với trình tự cơng bố có hệ số tương đồng trình tự nucloeitde từ 98,1-100% tương đồng trình tự amino acid từ 95,9-100% Các domain chứng PPO chè tương đối bảo thủ Quan hệ di truyền giống chè gen PPO chia làm nhánh chính: nhánh có giống chè Trung Du; nhánh chia làm nhóm phụ: nhóm phụ gồm có giống Keo Am Tích giống chè có mã số EF650016; nhóm phụ gồm có giống LDP1 mẫu chè Trung Quốc cịn lại Kiến nghị Cần nghiên cứu hoạt tính chứng PPO phịng thí nghiệm làm sở để nghiên cứu ứng dụng chế biến sản phẩm chè Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT , 2005 , Hoàng Văn Chung, 2012 “Nghiên cứu tuyển chọn đầu dòng số biện pháp kỹ thuật nhân giống, trồng chè Shan vùng núi cao tỉnh Bắc Kạn”, Luận án tiến sỹ Khoa học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Đại học Thái Nguyên , 2004 – , NXB Chu Thúc Đạt, 2003 "Đánh giá tiềm phát triển chè nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển, suất chất lượng số giống chè Thái Nguyên'', Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Lê Tất Khương, 1997.“Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng, phát triển số giống chè biện pháp kĩ thuật nâng cao suất chất lượng chè vụ Đông – Xuân Bắc Thái”, Luận án PTS Khoa học Nông nghiệp , 1997 , ,1999 , 1999 Đỗ Ngọc Quỹ , 1991 Sự thành lập hoạt động trạm nghiên cứu nông nghiệp Phú Hộ 1918 – 1945, Viện nghiên cứu chè , 2008 , tr: – 66 , 2000 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 12 Đ , 2000 Giáo trình 13 Lê Ngọc Tú, Hóa sinh cơng nghiệp, 1995 NXB khoa học kỹ thuật Hà Nội TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI 14 Dikshirt H K., Jhang T., Kondal N K., Bansal K C., Chandra N., Tickoo J N., Ksharma T R 2006 “Genetic differentiantion of Vigna specie by RAPD, URP and SSR marker”, Biology Plantarum journal, pp: 451 – 457 15 Espín J C., García-Ruiz P A., Tudela J V R., García-Cánovas F 1998.“Monophenolase and diphenolase reaction mechanisms of apple and pear polyphenol oxidases”, J Agric Food Chem, 46, pp: 2968 – 2975 16 FAO, 1993.“Selected indicator of food and Agricultural development in Asia – Pacific region”, 1982 – 1992, Bangkok 17 Hunt M D., Eannetta N T., Yu H., Newmann S M., Steffens J C.; 1993 “cDNA cloning and expression of potato polyphenol oxidase”, Plant Mol Biol, 21, pp: 59 – 68 18 Jain J.C., Takeo T 2007 A review of the enzymes of tea and their roles in tea making Food Biochem 8: 243 - 279 19 Liu J W., Huang Y Y., Ding Y., Liu D., Xiao X D and Ni D J.; 2010 “Prokaryotic expression and purification of Camellia sinensis polyphenol oxidase”, J Sci Food Agric, 90, pp: 2490 -2494 20 Newmann S M., Eannetta N T., Yu H., Prince J P., De Vicente C M., Tanksley S D., Steffens J C., 1993 “Organization of the tomato polyphenol oxidase gene family”, Plant Mol Biol, 21, pp: 1035 – 1051 21 Peñalver M J., Fenoll L G., Rodríguez-López J N., García-Ruiz P A., García-Molina F., Varón R., García-Cánovas F., Tudela J., 2005 “Reaction Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 mechanism to explain the high kinetic auto-activation of tyrosinase”, J Mol Catal B Enzym, 33, pp: 35 – 42 22 Peter W T, lan B Dry, and Simon P Robinson, 1995 “Polyphenol oxidase in potato”, Plant Physiol,109, pp: 525-531 23 Stephen T S N., 1990 “Influence of polyphenol Oxidase Activity and polyphenol Content of Tea Shoot on Quality of black tea”, J Sci food Agric, 51, pp: 57-69 24 Queiroz C., Mendes L., Maria L., Fialho E and Valente M., 2008 “Polyphenol Oxidase: Characteristics and Mechanisms of Browning Control”, Food Reviews International, 24, pp: 361 - 375 25 Ruhiye Y., Maurice R M., 2003 “Physicochemical properties and function of plant polyphenol oxidase: A review, Insititute of Food and Agricultural Sciences Food Science and Human Nutrition Department University of Florida PO Box 110720 Gainesville”, FL 32611 – 0720, pp: 361 – 422 26 Shi C Y., Yang W., Wei C H., Yu W., Zhang Z Z., Jiang C J., Sun J., Li Y Y, Chen Q., Xia T., Wan X C., 2011 “Deep sequencing of the Camellia sinensistranscriptome revealed candidate genes for major metabolic pathways of tea-specific compounds”, Genomics, 12, pp: 1471 – 2164 27 Ümit U M., Selin N., Yabacı A S., “Extraction, partial purification and characterisation of polyphenol oxidase from tea leaf (Camellia sinensis)”, , 36, pp: 137 - 144, 2011 28 Wu Y L., Pan L P., Yu S L., Li H H., 2010 “Cloning, microbial expression and structure–activity relationship of polyphenol oxidases from Camellia sinensis”, Journal of Biotechnology, 145, pp: 66 – 72 Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 TÀI LIỆU INTERNET 29 Các thành phần hóa học chè www.academia.edu/3887758/TONG_QUAN_TRA_XANH 30 Giá trị chè http://bannhanong.vietnetnam.net 31 Lịch sử chè www.Wikipedia the free encyclopedia The history of tea 32 Đặc điểm số giống chè trồng Việt Nam http://www.nomafsi.com.vn Số hóa Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ... hành nghiên cứu 3.2 NHÂN GEN PPO Ở CÁC MẪU CHÈ NGHIÊN CỨU Gen mã hóa PPO cho có trình tự mã hóa có kích thước 1,8 kb Trình tự gen mã hóa PPO phân lập từ mRNA genome chè công bố Genbank với mã số. .. HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC PHẠM HỒNG ĐIỆP NGHIÊN CỨU TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA ENZYME POLYPHENOL OXIDASE Ở MỘT SỐ GIỐNG CHÈ ĐẶC SẢN TRỒNG Ở THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã. .. xác định trình tự gen mã hóa polyphenol oxidase giống chè Trung Du, Keo Am Tích, LDP1 - So sánh trình tự gen mã hóa polyphenol oxidase mẫu nghiên cứu với trình tự cơng bố ngân hàng gen Số hóa Trung