Đa dạng di truyền một số chủng virus gây bệnh tai xanh prrsv ở việt nam dựa vào trình tự gen mã hóa protein màng m

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ THU HẰNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH (PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA PROTEIN MÀNG (M) LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC MAI THỊ THU HẰNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH (PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN MÃ HĨA PROTEIN MÀNG (M) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học Mã số : 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học TS Nguyễn Tường Vân Thái Nguyên - 2013 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ÐẦU Tính cấp thiết dề tài Hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), gọi bệnh “tai xanh” (Blue Ear), bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, lây lan nhanh nguy tử vong cao [43] Bệnh có lịch sử dịch tễ học phức tạp khó kiểm sốt điều kiện chăn nuôi lợn công nghiệp thông thường Vì bệnh gây tổn thất vô lớn công nghiệp ni lợn khơng giới mà cịn Việt Nam Bệnh phát lần vào năm 1987 Mỹ gọi với nhiều tên gọi khác “bệnh thần bí lợn”, “bệnh tai xanh lợn”, “hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn” [6] Ở Châu Âu nhiều vùng ghi nhận dịch bệnh Đức (năm 1990), Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991), Pháp (1992) Năm 1998, bệnh phát nước châu Á như: Hàn Quốc, Nhật Bản [45] Từ năm 2006 đến năm 2010, khu vực nước Châu Á Trung Quốc, Việt Nam, Philippines Thái Lan, Lào, Campuchia liên tiếp bị đợt dịch PRRS hoành hành với chủng PRRSV độc lực cao Cho đến PRRS trở thành dịch bệnh lưu hành nhiều châu lục giới bệnh gây tổn thất nặng nề kinh tế cho ngành chăn ni nhiều quốc gia PRRS loại virus có vỏ bọc bên ngồi, có cấu trúc hệ gen ARN sợi đơn dương, có tính thích ứng nhân lên cao đại thực bào, đặc biệt đại thực bào phế nang hoạt động phổi [32] Trong thể lợn bệnh, phá hủy đại thực bào làm giảm số lượng chức năng, dẫn đến suy giảm miễn dich, qua khỏi khó lấy lại cân miễn dịch [25] Bộ gen PRRSV dài khoảng 15 kb bao gồm tám (ORF) bao gồm ORF1a, 1b, 2,3,4,5,6, -7 , ORF 1a ORF 1b gen mã hóa RNA polymerase, GP 2-3-4 gen mã hóa protein chức năng, GP5 (hay E) glycoprotein vỏ ngoài, M protein màng N protein cấu trúc nucleocapsid [40] Do đa dạng biến đổi thơng tin di truyền nên việc tìm virus ổn định có tính đại diện nhằm sản xuất vaccine khó khăn Ở Việt Nam cuối tháng 2/2007, bệnh xảy đàn lợn tỉnh Hải Dương sau lan tỉnh miền Trung, miền Nam đến bệnh diễn biến phức tạp gây thiệt hại vô to lớn kinh tế cho người chăn nuôi Hiện nay, thị trường Việt Nam có hai loại vaccine chống virus PRRS phổ biến bao gồm vaccine bất hoạt vaccine nhược độc, giá thành cao, hiệu đạt 40% có khả điều trị triệu chứng lâm sàng mà không bảo vệ động vật miễn nhiễm với virus, đồng thời đòi hỏi nghiêm ngặt khâu bảo quản vận chuyển [22] Do yêu cầu cấp thiết đặt phải phân lập chủng virus lưu hành Việt Nam, phân tích kháng nguyên quan trọng để tạo sở cho việc sản xuất vaccine Từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài: “Đa dạng di truyền số dòng virus gây bệnh lợn tai xanh (PRRSV) Việt Nam dựa vào trình tự gen mã hóa cho protein màng (M)” Trong khuôn khổ luận văn, đặc điểm di truyền phân tử số chủng PRRSV phân lập Việt Nam năm 2010 so sánh với chủng khác Việt Nam giới dựa trình tự gen mã hóa cho protein M (ở gọi gen M) – protein cấu trúc quan trọng PRRSV Kết nghiên cứu phục vụ cho việc chẩn đoán chủng gây bệnh phát triển vaccine Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Ðối tuợng phạm vi nghiên cứu dề tài Các bệnh phẩm dùng nghiên cứu niêm mạc hầu họng - khí - phế quản chứa virus PRRS thu thập từ lợn mắc bệnh tai xanh tỉnh Việt Nam ( Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền giang) trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp Phạm vi nghiên cứu đề tài giải trình tự gen M, phân tích thành phần chuỗi nucleotide amino acid gen M, nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phả hệ chủng thu nhận với chủng Việt Nam giới dã đăng ký Ngân hàng gen phát chủng Việt Nam Bố cục luận án Luận án gồm 54 trang, phần Mở đầu trang; Tổng quan tài liệu 18 trang; Vật liệu phương pháp nghiên cứu trang; Kết bàn luận 15 trang; Kết luận kiến nghị trang; Tài liệu tham khảo trang; Phụ lục trang Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh giới Việt Nam 1.1.1 Tình hình bệnh lợn tai xanh giới 1.1.2 Tình hình bệnh lợn tai xanh Việt Nam 1.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh tích 1.2.1 Triệu chứng lâm sàng 1.2.2 Bệnh tích 1.3 Nguyên nhân gây bệnh phân loại 1.4 Giới thiệu virus PRRS 1.4.1 Hình thái cấu trúc virus PRRS 1.4.2 Khả gây bệnh sức đề kháng 1.5 Các đường lây nhiễm 1.5.1 Sự lây truyền dọc 1.5.2 Sự lây truyền ngang 1.6 Đa dạng di truyền virus PRRS 1.7 Giới thiệu gen M 1.7.1 Chức 1.7.2 Cấu trúc gen M virus PRRSV 1.7.3 Vai trò tạo đáp ứng miễn dịch 1.8 Tầm quan trọng việc nghiên cứu tìm hiểu gen M 1.8.1.Ý nghĩa việc nghiên cứu gen M 1.8.2 Triển vọng sử dụng gen M tái tổ hợp sản xuất vaccine Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ CHƢƠNG ÐỐI TUỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Ðối tuợng Gen M chủng virus cúm PRRS gây bệnh lợn tai xanh Việt Nam đại diện số địa phương thu nhận từ năm 2010 Các mẫu bệnh phẩm gồm chủng thu nhận Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền giang 2.2 Nội dung Tiến hành tách chiết RNA tổng số virus Thiết kế mồi để thực phản ứng PCR để thu nhận gen mã hóa cho protein màng (M) Giải trình tự gen tiến hành phân tích số liệu, so sánh tương đồng nucleotide amino acid để đánh giá đa dạng di truyền chủng PRRS Việt Nam giới dựa trình tự gen mã hóa cho protein M 2.3 Vật liệu - Mẫu bệnh phẩm trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương cung cấp - Chủng E coli DH5α, vector nhân dòng pBT phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học cung cấp - Cặp mồi F-M, R-M để nhân dịng gen mã hóa protein màng M virus PRRS phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học cung cấp 2.4 Hóa chất Các hóa chất sử dụng duợc cung cấp hãng có uy tín giới:Qiagen,Invitrogen, Fermentas 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.5.1 Phương pháp thiết kế mồi cho phản ứng nhân dòng Các cặp mồi thiết kế với mục đích nhân dịng gen mã hóa protein màng M virus PRRS thiết kế dựa phân tích trình tự tất chủng PRRSV có Ngân hàng gen 2.5.2.Tách chiết RNA tổng số virus Sử dụng kit Trizol Regents (của hãng Invitrogen ) để tách chiết RNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm theo dẫn nhà sản xuất 2.5.3.Tổng hợp cDNA phản ứng PCR RNA tổng số sử dụng để tổng hợp sợi DNA bổ sung (cDNA) thứ cDNA từ phản ứng phiên mã ngược sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen M với cặp mồi đặc hiệu M-F M-R Sản phẩm PCR điện di gel agarose 1% tinh theo kit thơi gel theo quy trình GeneJET™Gel Extraction Kit (Fermantas) 2.5.4.Phương pháp tách dòng gen Sản phẩm PCR sau tinh gắn vào vector tách dòng pBT biến nạp vào tế bào khả biến E coli DH5-α 2.5.5 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Sau ni khuẩn biến nạp môi trường chọn lọc Để chắn vector biến nạp vào tế bào vi khuẩn, tiến hành chọn khuẩn lạc trắng để kiểm tra phản ứng PCR, sử dụng trực tiếp tế bào vi khuẩn làm khuôn mẫu (hay cịn gọi colony-PCR) 2.5.6 Tách chiết plasmid Quy trình tách plasmid thực theo kit tinh plasmid ”Plasmid Extraction Kit” hãng QIAGEN 2.3.7 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp Để kiểm tra plasmid tái tổ hợp sử dụng phương pháp enzym giới hạn Trên vector pBT có hai điểm cắt enzym BamHI hai đầu điểm gắn gen BamHI lựa chọn để kiểm tra có mặt gen vector nhân dịng 2.6 Phƣơng pháp xác định trình tự xử lý số liệu Sử dụng chương trình Neighbor Joining Alignment phần mềm Mega 3.1 [37], chương trình Multiple Sequence Aligment phần mềm DNAMAN 4.1.5 (Lynnon BioSoft) để thu nhận, xử lý, phân tích chuỗi nucleotide, amino acid đặc điểm sinh học, sinh học phân tử xây dựng mối quan hệ phả hệ xác định nguồn gốc chủng lồi Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1.Phân lập gen M 3.1 Phân lập gen M Năm mẫu bệnh phẩm PRRS thu thập Quảng Ninh, Bạc Liêu, Nghệ An, Tiền Giang, Hưng Yên nuôi cấy tế bào thận khỉ Marc145 sử dụng để tách chiết ARN tổng số Sau tiến hành tách chiết ARN tổng số cách sử dụng kit Trizol Regents tổng hợp cDNA, sau gen M nhân lên kỹ thuật PCR nhờ cặp mồi F-M, R-M 600bp Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm RT- PCR nhân đoạn gen M (1 : 10-QuNi ; : 10-BaLi ; :10-NgAn ; :10-TiGi ;5 : 10-HuY) Kết nhân gen kiểm tra điện di gel agarose 0.8% thấy vạch nhất, có kích thước khoảng 600 bp tương đương với kích thước gen M theo lý thuyết Như vậy, bước đầu sơ kết luận: nhân gen M cặp mồi dùng để nhân gen M từ khuôn cDNA sợi đơn đặc hiệu Sản phẩm PCR thơi gel dịng hóa vào vector pBT tạo thành vector tái tổ hợp pBT-M Vector tái tổ hợp pBT-M nhân E.coli 600bp Hình 3.2 Ảnh điện di sản phẩm clony – PCR từ E.coli để kiểm tra dòng khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp pBT-M (1-3 :10-QuNi ; 4-6 : 10-BaLi ; 7-9 :10-NgAn ; 10-13 :10-TiGi ;14-16 : 10-HuY) Hình ảnh 3.2 ảnh điện di sản phẩm colony-PCR từ E.coli để kiểm tra 16 dòng khuẩn lạc trắng.Kết có 15 giếng ( Giếng số 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ) xuất băng có kích thước khoảng Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 600bp tương đương với kích thước gen M theo lý thuyết Như ta kết luận có 15 dòng mang vector tái tổ hợp pBT- M 2700bp 600bp Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm cắt enzyme giới hạn BamHI (1 : 10-QuNi ; : 10-BaLi ; :10-NgAn ; :10-TiGi ;5 : 10-HuY) Tiến hành tách plasmid cắt enzyme giới hạn BamHI điện di cho thấy sản phẩm cắt plasmid enzyme giới hạn BamHI có phân đoạn kích thước khoảng 2700bp tương ứng với kích thước vector pBT 620 bp tương ứng với kích thước gen M Điều khẳng định gen M dịng hóa thành cơng vào vector nhân dịng pBT Các plasmid tái tổ hợp pBT-M-10NgAn, pBT-M-10TiGi, pBT-M-10BaLi, pBT-M-10HuY, pBT-M10QiNi đọc trình tự để phân tích đa dạng di truyền gen M 3.2 Phân tích quan hệ di truyền dịng virus PRRS Khi có trình tự nucleotid chuỗi gen M, tiến hành so sánh chuỗi trình tự nucleotid vừa giải duợc với chuỗi trình tự nucleotid chủng virut PRRS Ngân hàng liệu gen 3.2.1 Phân tích quan hệ di truyền dịng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự DNA gen M Hình 3.4 Phân tích chủng loại dựa vào đa hình trình tự DNA gen M mẫu virus 38 chủng tham khảo Chú thích : 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu ( Hình 2.1);*) 07 QN 2007: chủng virus có độc tính cao Quảng Nam [30] ; **) JXA1: chủng virus có độc tính cao Trung Quốc [55] 2001-2012 sau tên chủng virus: năm thu mẫu (Bảng 1) EU genotype: chủng châu Âu; NA genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2: nhóm phụ chủng virus Bắc Mỹ Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 38 trình tự gen M gồm trình tự nghiên cứu 33 trình tự cơng bố chia thành nhóm lớn phát sinh chủng loại: nhánh (type 1) gồm đại diện châu Âu; nhánh gồm đại diện Trung Quốc, Việt Nam, Hoa Kỳ,Hàn Quốc, Thái Lan… (type 2) Sự sai khác type với độ tin cậy tuyệt đối (giá trị bootstrap 100%) Các dòng virus PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Tiền Giang, Bạc Liêu, Nghệ An thuộc type Type chia thành nhóm phụ riêng biệt : Nhóm phụ 1- Subgroup (Sg1) Nhóm phụ 2- Subgroup (Sg2) Subgroup (Sg1): Bao gồm dòng PRRS-M phân lập nghiên cứu 10-QuNi, 10-HuY, 10TiGi 10-BaLi nhánh với chủng virus có độc tính cao (High Pathogenic PRRSV : HP-PRRSV) JXA1 Trung Quốc 07QN Quảng Nam, Việt Nam, chủng công bố Trung Quốc, Lào… từ năm 2001-2012 Subgroup (Sg2) : gồm chủng 10-NgAn chủng PRRSV gốc VR-2332 chủng vaccine RespPRRS MLV 3.2.2 Phân tích quan hệ di truyền dịng virus PRRS dựa vào đa hình trình tự amino acid gen M Hình 3.5 Phân tích chủng loại dựa vào đa hình trình tự amino acid gen M mẫu virus 38 chủng tham khảo Chú thích: 1-5 ký hiệu nơi thu mẫu (Hình 2.1) *) 07 QN 2007: chủng virus có độc tính cao Quảng Nam [30], **) JXA1: chủng virus có độc tính cao Trung Quốc [55].2001-2012 sau tên chủng virus: năm thu mẫu Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ (Bảng 2.1) EU genotype: chủng châu âu; NA genotype: chủng Bắc Mỹ; Sg1; Sg2: nhóm phụ chủng virus Bắc Mỹ Kết phân tích MEGA 3.1 cho thấy 38 trình tự amino acid ( trình tự nghiên cứu 33 trình tự chủng mẫu tham khảo chia thành nhánh chủng Châu Âu Bắc Mỹ Độ sai khác tin cậy di truyền nhóm 100% Cả chủng nghiên cứu thuộc type (Bắc Mỹ) giá trị bootstrap 91-99% - Nhóm (Type 1): Gồm đại diện Châu Âu (type 1) HKEU 16, BJEU06, Lelystad, 01CB1, SD01-08 Euro PRRSV đại diện nước Trung Quốc, Hà Lan, Thái Lan Hoa Kỳ - Nhóm ( Type2): Các chủng PRRS phân lập từ Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Tiền Giang, Bạc Liêu thuộc nhánh Type chia thành Subgroup riêng biệt Subgroup (Sg1) và Subgroup (Sg2) (giá trị bootstrap 91-99%) Subgroup (Sg1): Bao gồm chủng nghiên cứu (10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi 10-BaLi) 25 chủng tham khảo Trong có số chủng có độc lực cao chủng 07 phân lập Quảng Nam- Việt Nam 2007, chủng JXA1 chủng virus có độc tính cao Trung Quốc [55] Subgroup 2(Sg2): Bao gồm chủng VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ, RespPRRS Repro: chủng vaccine Chủng 10-NgAn có quan hệ gần gũi với chủng nhiên có sai khác đáng kể Cần có thêm nghiên cứu thêm chủng để có nhứng kết luận xác chủng Như vậy, số dòng PRRSV-M phân lập được, dòng Quảng Ninh , Bạc Liêu, Hưng Yên, Tiền Giang có độ tương đồng DNA axit amin cao có quan hệ di truyền gần gũi với Chủng 10 –NgAn lại có khác biệt quan hệ di truyền với dòng nghiên cứu Theo Feng đồng tác giả (2008) [30], chủng Quảng Nam (2007) chủng Trung Quốc (2006) có quan hệ di truyền gần gũi với Sự vận chuyển thịt lợn sống hai nước tỉnh nước nguyên nhân dẫn đến bùng phát chủng virus PRRS có độ tương đồng cao [33].Kết phân tích đồn chun gia tổ chức Nơng lương giới (FAO) cho thấy 99% chủng lưu hành Việt Nam tương đồng với chủng virus lưu hành Trung Quốc [29] Các chủng PRRSV có đa dạng di truyền cao tốc độ tiến hóa nhanh [17] Do thời gian ngắn nhiều chủng xuất với độc tính cao gây vụ dịch nghiêm trọng [30] Các chủng PRRSV xuất Type2 có lẽ bắt nguồn từ chủng gốc với đại diện VR2332 áp lực chọn lọc [23] Độc tính khác cộng thêm đa dạng di truyền cao chủng PRRSV hạn chế hiệu phòng trị bệnh vaccine [31] Các chủng phân tử xuất thời điểm khác có cấu trúc phân tử khác thể số gen toàn hệ gen [26], [27] 3.3 Phân tích mức tƣơng đồng trình tự DNA amino acid Kết phân tích Mega 3.1 cho thấy chủng virus PRRS phân lập chia thành chia thành nhánh chủng Châu Âu Bắc Mỹ Độ sai khác tin cậy di truyền nhóm 100% Cả Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 10 chủng nghiên cứu thuộc type (Bắc Mỹ) Chi tiết hệ số tương đồng trình tự DNA amino acid chủng nhóm phụ thể sau: 3.3.1 Kết so sánh trình tự đại diện nhóm Bảng 3.1 So sánh mức tương đồng (%) trình tự DNA trình tự amino acid (in đậm) số chủng đại diện Sg1 JXA1 JXA1 07BJ 07HEBTJ 100 100 100 07HEN 07NM 07QN 10TiGi 10QuNi 10HuY 10BaLi 100 100 100 98.9 98.9 99.4 100 100 100 100 98.9 98.9 99.4 100 100 100 100 98.9 98.9 99.4 100 100 100 98.9 98.9 99.4 100 100 98.9 98.9 99.4 100 98.9 98.9 99.4 100 98.9 99.4 98.9 98.3 98.9 07BJ 100 07HEBTJ 100 100 07HEN 100 100 100 07NM 100 100 100 100 07QN 100 100 100 100 100 10-TiGi 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 10-QuNi 99.0 99.0 99.0 99.0 99.0 99.0 98.9 10-HuY 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.2 98.9 10-BaLi 99.2 99.2 99.2 99.2 99.2 99.2 98.7 98.3 99.4 98.7 Chú thích: Nhóm phụ bao gồm:10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi: mẫu nghiên cứu này; JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ: chủng HP-PRRSV tham khảo Số gạch chân: biến thiên % mức tương đồng - Mức độ đồng nucleotide tương đồng amino acid đại diện nhóm phụ trình bày Bảng 3.1 Kết cho thấy, qua so sánh 525 nucleotide ( tương ứng với 174 amino acid) chủng nghiên cứu có tỷ lệ tương đồng cao nucleotide ( 98,3- 99,2%) tương đồng amino acid (98,3 - 99,4%) - Mức tương đồng trình tự DNA chung 99,71% mẫu so với chủng tham khảo 99-99,4% Mức tương đồng trình tự amino axit chung 99,71%, mẫu nghiên cứu so với chủng tham khảo: 98,9-100% 3.3.2 Kết so sánh trình tự đại diện Nhóm Phụ (Sg2) Bảng 3.2 So sánh mức tương đồng (%) trình tự DNA trình tự amino acid (in đậm) số chủng đại diện Nhóm phụ (Sg2) 10-NgAn 10-NgAn RespPRRS Repro 97.7 VR-2332 93.9 RespPRRS Repro 94.1 Số hóa trung tâm học liệu VR-2332 RespPRRS MLV 97.7 97.7 98.9 98.9 99.4 http://lrc.tnu.edu.vn/ 100.0 11 RespPRRS MLV 94.1 99.4 100.0 Chú thích: Nhóm phụ 2bao gồm: 10-NgAn: 01 mẫu nghiên cứu này; VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV: chủng vaccine - Mức độ đồng nucleotide tương đồng amio acid đại diện nhóm phụ trình bày Bảng 3.2 Kết cho thấy, mức tương đồng trình tự DNA chung 98,38%, mẫu 10-NgAn so với chủng tham khảo đạt từ 93,9 - 94,1% - Mức tương đồng trình tự amino axit chung 99,14%, mẫu 10-NgAn so với chủng tham khảo 97,7% 3.3.3 Kết so sánh trình tự đại điện nhóm phụ (Sg1 Sg2) Bảng 3.3 So sánh mức tương đồng (%) trình tự DNA trình tự amino acid (in đậm) số chủng đại diện Nhóm phụ (Sg1) với nhóm phụ (Sg2) 07QN JXA1 07QN JXA1 10TiGi 100 100.0 10BaLi 10HuY 10QuNi RespPRRS Repro VR2332 10NgAn 98.9 100.0 99.4 98.9 97.1 97.1 97.1 98.9 100.0 99.4 98.9 97.1 97.1 97.1 98.9 98.3 97.7 96.0 96.0 96.0 94.4 98.9 97.1 97.1 97.1 98.3 96.6 96.6 96.6 96.0 96.0 96.0 98.9 97.7 10-TiGi 99.4 99.4 10-BaLi 99.2 99.2 98.7 10-HuY 99.4 99.4 99.2 98.7 10-QuNi 99.0 99.0 98.9 98.3 98.9 RespPRRS Repro 95.2 95.2 94.7 95.2 95.0 94.3 VR-2332 95.0 95.0 94.5 95.0 94.9 94.1 99.4 10-NgAn 92.2 92.2 91.6 92.6 92.0 91.2 94.1 97.7 93.9 Chú thích: 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi: mẫu thuộc Sg1 nghiên cứu này; JXA1, 07QN: chủng HP-PRRSV tham khảo Sg1 10-NgAn: 02 mẫu thuộc Sg2 nghiên cứu này; VR-2332 chủng gốc Bắc Mỹ, RespPRRS Repro: chủng vaccine Dựa vào bảng 3.3 ta thấy mức tương đồng trình tự DNA chung nhóm phụ Sg1 (10-QuNi, 10HuY, 10-TiGi, 10-BaLi, JXA1, 07QN ) Sg2 (VR-2332, RespPRRS Repro.) 97,74%, trình tự đại điện nhóm phụ 91,2- 95,2% mức tương đồng trình tự amino acid chung 98,72%, trình tự đại điện nhóm phụ: 96,0 - 97,1% 3.4 So sánh thành phần nucleotide amino acid chủng PRRSV nghiên cứu với số chủng giới Để nghiên cứu cụ thể mức độ biến đổi thành phần nucleotide gen M thành phần amino acid gen mã hóa chủng nghiên cứu chúng tơi tiến hành lựa chọn số chủng PRRSV đăng ký ngân hàng gen, bao gồm : chủng HP-PRRSV có độc tính cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ nhóm phụ chủng gốc Nam Mỹ VR-2332, chủng vaccine RespPRRS Repro RespPRRS MLV 3.4.1 Dựa thành phần nucleotide Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 12 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 ATGGGGTCGT A CTCTAGACGA T T T CT T CT T CT T * * GCGTTTTCCA T T T CTTCTGCAAT TC TC TC TC ** TTACCTACAC GATAGCACAG C G G G G * GCCAGTGATG A A.A 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 GGTGCTTTTG A TAAAGGTAAG A G G G G * 10-QuNi CTGAATTGTG 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 TCGCGGCCGA .A.A CTGCTAGGGC T T.G TTCTGCACCT C .T CTTTTACCTT C C C CGGGTACATG ACATTCGTGC C T C T C T C 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 GTCGCGCTCA .G CTATGGGAGC AGTGGTTGCA A A A A A A A A A A A AGCCATAGAA ACCTGGAAAT TCATCACCCC T T T T T T T T 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 CACAAATAGG C.A T .A T .A T .A * GAGTGTACTC Số hóa trung tâm học liệu CTCCACAGAA .C A A .G.A .G.A * ATATATGCTC C C C C * TTTGATCTTT .C C C C * ATTTTGAGAG C C C C C C C C C C C .C C .C C .C C * CTTCTTTGGG C C C C C * CAGATGCCGT 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 150 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 250 300 300 300 300 300 300 300 300 300 http://lrc.tnu.edu.vn/ 13 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 .G G G G T T T T T 300 300 300 300 300 TTGTGCTTGC C TAGGCCGCAA .G GTACATTCTG A GCCCCTGCCC 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 AAGTGCCGCG G A A A A * 10-QuNi TCGTCCGGCG 10_HuY C 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 GGCTTTCATC C.G CGATTGCGGG C C C C C C C C C C C C C AAATGATAAC G ACCACGTCGA T T T T * CACGCATTTG TCCCGGCTCC T ACTACGGTCA C A ACGGCACATT GGTGCCCGGG .A 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 450 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 * 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 CTGAAAAGCC T T T T T T T T T T T.A T.A T.A TCGTGTTGGG TGGCAGAAAA GCTGTTAAGC A A A A AGGGAGTGGT .A 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 500 AAACCTTGTT C C C C C * AAATATGCCA AATAA Hình 3.6 (Tiếp theo) 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 Số hóa trung tâm học liệu 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 400 525 525 525 525 525 525 525 525 525 525 525 525 525 525 http://lrc.tnu.edu.vn/ 14 Hình 3.6 So sánh trình tự DNA gen M mẫu nghiên cứu 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi với chủng HP-PRRSV có độc tính cao nhóm phụ trình tự mẫu 10-NgAn với các chủng gốc Nam Mỹ VR2332, chủng vắc xin RespPRRS Repro, RespPRRS MLV Trong đó: *) đánh dấu điểm đột biến đặc trưng để phân biệt nhóm phụ nhóm PRRSV Bắc Mỹ Kết cho thấy: - Gen M chủng nghiên cứu có độ dài 525 bp , tương đồng với chủng so sánh thuộc type ( Bắc Mỹ) - Gen M chủng 10-QuNi có sai khác nucleotide vị trí 192 (T↔C), vị trí 289 (C↔T), 380 (G↔C) , 451 (C↔ T) so sánh với trình tự tương ứng với chủng 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi, JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ, 10-NgAn, vị trí 243 (T↔ C) so với chủng 10-HuY, 10-NgAn Khi so sánh với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV thuộc dòng Bắc Mỹ chủng 10-QuNi có đến 29 nucleotide sai khác vị trí : 12, 13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 192, 196, 201, 209, 234, 243, 252, 289, 348, 360, 380, 451, 453, 489, 510 - Gen M chủng 10-HuY có sai khác nucleotide vị trí 242 (T↔C), 401 (T↔C) 234 (A↔G) so sánh với trình tự tương ứng với chủng JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ Có 20 sai khác vị trí : 12, 13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 234, 252, 348, 453, 489, 510 so sánh với trình tự tương ứng với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV - Gen M chủng 10-TiGi so sánh với trình tự tương ứng với chủng JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ có sai khác nucleotide vị trí 220, 234 383 (A↔G) Khi so sánh với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV chủng 10-TiGi có 24 nucleotide sai khác vị trí : 12, 13, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 196, 201, 209, 243, 252, 348, 360, 453, 489, 510 - Chủng 10-BaLi có sai khác nucleotide vị trí 13 (C↔T), 86 (G↔A), 132 510 (T↔C) Có 23 sai khác nucleotide vị trí : 12, 18, 27, 28, 39, 48, 69, 99, 108, 150, 165, 183, 188, 196, 201, 209, 243, 252, 348, 360, 453, 489, 510 - Chủng 10-NgAn có tới 41 sai khác vị trí 9, 13, 18, 27, , 28, 33 , 42, 39, 47, 51, 75 ,77, 99 ,105, 108 ,112, 114 , 121 ,124 , 126, 138, 150, 183, 196, 207, 209, 243, 252, 307, 320, 321, 347, 351, 360, 417, 423, 426, 444, 489, 492, 510 so sánh với trình tự tương ứng với chủng JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ Đối với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV có tới 28 vị trí sai khác 9, 12, 33, 42, 51, 69, 75, 77, 105, 112, 114, 121, 124, 126, 138, 165, 173, 178, 207,307, 320, 321, 351, 417, 423, 426, 492 Như chủng 10-QuNi có mức độ đồng với chủng 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi cao, chủng gần gũi với chủng độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ Tuy nhiên so sánh với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV nhũng đại diện đặc trưng vùng Bắc Mỹ có mức tương đồng thấp Đối với chủng 10-NgAn có sai khác rõ rệt với chủng so sánh, cần có thêm nghiên cứu chủng để có nhứng kết luận xác chủng 3.4.2 Dựa trình tự amino acid Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 15 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 MGSSLDDFCN DSTAPQKVLL AFSITYTPVM IYALKVSRGR 40 40 40 40 40 40 40 40 H H H H * 10-QuNi LLGLLHLLIF 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 E E I 40 40 40 40 40 40 LNCAFTFGYM VALTMGAVVA .A 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 80 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 LLWGVYSAIE TWKFITPRCR S S S S S S S S S S S S S TFVHFESTNR Q K A Q K A Q K A Q K * * LCLLGRKYIL R APAHHVESAA 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 120 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 GFHPIAGNDN A AS A A A A A A A A R A A A HAFVVRRPGS A TTVNGTLVPG LKSLVLGGRK 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 160 10-QuNi 10_HuY 10-TiGi 10-BaLi JXA1_2006 07QN_2007 O7NM_2007 O7HEN_2007 O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 AVKQGVVNLV KYAK Hình 3.7 (Tiếp theo) O7BJ_2007 O7HEBTJ_2007 10-NgAn VR2332_1993 RespPRRS/Repro_1999 RespPRRSMLV_2005 174 174 174 174 174 174 174 174 174 174 174 174 174 174 Hình 3.7.So sánh trình tự amino acid gen M mẫu nghiên cứu 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi với chủng HP-PRRSV có độc tính cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ Sgza trình tự Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 16 mẫu 10-NgAn với các chủng gốc Nam Mỹ VR-2332, chủng vaccine RespPRRS Repro, RespPRRS MLV Trong đó:*) đánh dấu điểm đột biến đặc trưng để phân biệt nhóm phụ nhóm PRRSV Bắc Mỹ Từ kết so sánh thành phần nucleotide, tiến hành so sánh thành phần amino acid tương ứng đoạn gen quy định mã hóa Kết so sánh trình tự amino acid trình bày hình 3.8 cho thấy: - Chuỗi gen M chủng nghiên cứu có độ dài 174 amino acid giống độ dài trình tự polypeptide chủng so sánh - Chủng 10-QiNi có khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng chủng có độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ vị trí: 97 (S↔P), 127 (A↔G), 134 (A↔V) Đối với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV có khác biệt vị trí: 10 (N↔H); 63 (V↔A); 66 (E↔Q); 70 (R↔K); 97 (S↔P); 127 (A↔G) - Chủng 10-HuY 10-BaLi, 10-TiGi có khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng chủng gốc Bắc Mỹ (VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV) vị trí : 10 (N↔H); 63 (V↔A); 66 (E↔Q); 70 (R↔K); Riêng chủng 10-HuY có thêm khác biệt vị trí 134 (V↔A) chủng 10-TiGi có thêm khác biệt vị trí 74 (T↔A); 128 (N↔S) Trong khơng có khác biệt trình tự amino acid so với chủng có độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ - Chủng 10-NgAn có khác biệt so với chuỗi polypeptide M tương ứng chủng có độc lực cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ vị trí: 10 (N↔H); 29(V↔I); 66 (E↔Q); 70 (R↔K); 107 (K↔R) Khi so sánh với chủng VR-2332, RespPRRS Repro, RespPRRS MLV chủng 10-NgAn có khác biệt so với chuỗi polypeptide tương ứng vị trí: 63 (A↔V); 117 (K↔R) Như vậy, thành phần amino acid, chuỗi polypeptide gen M chủng 10-HuY ,10-BaLi, 10TiGi có tương đồng cao với trình tự chuỗi tương ứng với chủng độc lực cao cao JXA1, 07QN, 07NM, 07HEN, 07BJ, 07HEBTJ, so với chủng gốc Bắc Mỹ Riêng chủng 10-NgAn có tương đồng trinh tự amino acid cao so với chủng gốc Bắc Mỹ - Như có 17 điểm đột biến đặc trưng trình tự DNA gen M chủng PRRSV gốc (Prototype) chủng có tính độc dược cao (HP-PRRSV) - Có điểm đột biến đặc trưng trình tự Amino acid cuả gen M chủng PRRSV gốc (Prototype) chủng có tính độc dược cao (HP-PRRSV) - Từ kết ta thấy chủng 10-NgAn có khác biệt với chủng 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi, 10-BaLi 17 điểm đột biến đặc trưng trình tự DNA chúng điểm đột biến đặc trưng trình tự amino acid chúng Như ta biết, đột biến ectodormain thay đổi vai trò xâm nhập, mục tiêu đáp ứng miễn dịch, vaccine virus Trong nghiên cứu này, đột biến ectodormains trình tự gen M có lẽ phản ánh quan hệ chủng loại chủng PRRSV có độc tính cao (đại diện chủng 07QN JXA1) với chủng PRRSV gốc với đại diện chủng VR2332 Các vị trí đột biến N10H Q16L ectodormain G2-L19 Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ 17 V63A, E66Q R70K ectodormain A63-K70 phản ánh độc tính cao chủng năm 2006-2007 so với với chủng gốc Tuy nhiên, nghiên cứu cụ thể đột biến cần nghiên cứu thêm - Từ 2009, số chủng PRRSV lại xuất với độc tính cao so với chủng năm 20062007, đặc biệt Trung Quốc [14] Việt Nam [9] Tuy nhiên, M gen gen bảo thủ, biến đổi nên chủng loại chủng PRRSV nghiên cứu thấy thuộc nhóm, chủng thuộc nhóm PRRSV 2006-2007 chủng gần với nhóm gốc Cần phải phân tích, so sánh gen có mức đột biến cao GP3, GP5 N để tìm hiểu sâu chủng loại chủng nghiên cứu Sự biến đổi chủng virus PRRS phân lập nghiên cứu giải thích sau: Các chủng 10-Bali, 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi (trong nhóm 1) phát triển chủng VR2332 với đột biến thay amino acid gen M, chủng 10-NgAn có thay trình tự axit amin tổng số 174 aa gen M Một chủng virus PRRS (07QN) phân lập Việt Nam tìm thấy vào năm 2007 phân tích phát sinh lồi với số chủng có độc lực cao Trung Quốc năm 2007 [30] Các chủng 10-Bali, 10-QuNi, 10-HuY, 10-TiGi nghiên cứu nhóm với chủng tìm thấy Việt Nam Trung Quốc năm 2007 điển hình virus PRRS chủng có độc lực cao Các chủng tác nhân gây dịch bệnh tai xanh 21 tỉnh Việt Nam năm 2010, bao gồm tỉnh, nơi cô lập 10-Bali thu thập năm 2010 xác định nghiên cứu Ngồi biến đổi nhanh chóng virus PRRS, phát sinh biến thể độc lực cao chủng nghiên cứu q trình chăn ni lợn Việt Nam, bao gồm vận chuyển lợn sống nước hay quốc gia giết mổ lợn Việt Nam [23] Do đó, chủng virus PRRS khác vận chuyển đến Việt Nam từ nước láng giềng chủng khác lưu hành từ tỉnh sang tỉnh khác nước Số hóa trung tâm học lieäu http://lrc.tnu.edu.vn/ 18 Chƣơng : KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu trình nghiên cứu chúng tơi có số kết luận sau: Đã phân lập giải trình tự thành công gen M chủng virus PRRS nghiên cứu phân lập từ địa phương khác Quảng Ninh, Hưng Yên, Nghệ An, Bạc Liêu, Tiền Giang ký hiệu theo thứ tự 10QiNi, 10-HuY, 10-NgAn, 10-BaLi, 10-TiGi Dựa vào phân tích trình tự nucleotide amino acid gen M mã hóa, subgroup virus PRRS xác định từ dòng virus PRRS phân lập tỉnh Việt Nam với mức sai khác di truyền tin cậy dòng từ 91-99% Kết nghiên cứu lần cơng bố, làm sở để phân tích biến chủng virus PRRS sản xuất vaccine phòng chống dịch bệnh Việt Nam KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu virus PRRS năm gần đây, lưu giữ nguồn gen M chủng phân lập địa phương khác Việt Nam năm giải mã để so sánh phân tích với chủng khác Phân tích số lượng cỡ mẫu nhiều tính ổn định dòng gen nhằm chọn lọc nguồn gen thích hợp làm nguyên liệu cho kiến tạo chế phẩm đặc biệt vaccine Việt Nam Giải mã gen M toàn hệ gen số chủng để phân tích so sánh với chủng khác để có sở liệu đánh giá biến đổi di truyền virus PRRS định hướng tương quan miễn dịch vaccine phòng bệnh Số hóa trung tâm học liệu http://lrc.tnu.edu.vn/ ... KHOA HỌC MAI THỊ THU HẰNG ĐA DẠNG DI TRUYỀN M? ??T SỐ CHỦNG VIRUS GÂY BỆNH LỢN TAI XANH (PRRSV) Ở VIỆT NAM DỰA VÀO TRÌNH TỰ GEN M? ? HĨA PROTEIN M? ?NG (M) Chuyên ngành : Công nghệ sinh học M? ? số : 60.42.02.01... đặc đi? ?m di truyền phân tử số chủng PRRSV phân lập Việt Nam n? ?m 2010 so sánh với chủng khác Việt Nam giới dựa trình tự gen m? ? hóa cho protein M (ở gọi gen M) – protein cấu trúc quan trọng PRRSV. .. vaccine Từ sở lý luận khoa học thực tiễn nói trên, tiến hành đề tài: ? ?Đa dạng di truyền số dòng virus gây bệnh lợn tai xanh (PRRSV) Việt Nam dựa vào trình tự gen m? ? hóa cho protein m? ?ng (M) ” Trong