Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chi đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch

Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch Nguyễn Thị Thanh Nga Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Di truyền học; Mã số: 60 42 70 Người hướng dẫn: PGS.TS. Đinh Đoàn Long Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Tìm hiểu chi codonopsis; tổng quan về mã vạch AND (DNA barcode); một mã vạch AND được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu; ứng dụng mã vạch AND trên thực vật. Trình bày các phương pháp nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; kiểm tra sản phẩm AND sau tách chiết; phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR; tinh sạch sảm phẩm PCR và giải trình tự; phương pháp phân tích số liệu. Kết quả nghiên cứu: tách chiết AND tổng số; khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR. Keywords. Sinh học; Di truyền học; Đa dạng di truyền; Cây dược liệu; Kỹ thuật AND mã vạch Content MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược. Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị tương đối phổ biến hiện nay. Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chi Codonopsis 1.1.1. Phân loại học Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:  Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)  Giới: Plantae (Thực vật)  Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)  Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)  Lớp: Magnoliopsida (Thực vật hai lá mầm)  Phân lớp: Asteriades  Bộ: Asterales (Bộ Cúc)  Họ: Campanulaceae (Họ Hoa chuông; Cát kiến)  Phân họ: Campanuloideae  Chi: Codonopsis 1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân quấn. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn. Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông. Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc. Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra. Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng Hnh 1. Hnh thái loài Codonopsis pilosula Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có: - Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo. Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm. Lá mọc đối có khi mọc cách hay hơi vòng. Hoa (Hnh 1) mọc đơn độc ở nách lá. Đài 5, Tràng hình chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5. Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ. - Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.) còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày), Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân leo. Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông, đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ. Phiến lá dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm. Hoa (Hnh 2) mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng hoặc hơi vàng, họng có vân tím. Hnh 2. Hoa của loài C. javanica - Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim) lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 – 3 cm, hai mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn, Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong có nếp nhăn ngắn. Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. - Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân lá đều có lông dài, lá hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa. Cánh hoa sâu, dài bằng nửa ống hoa, tràng hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc. - Xuyên đảng sâm (Codonopsis tangshen Oliv); hình thái cơ bản giống loài C. pilosula (Franch) Nannf nhưng lá hình trứng hay hình trứng đuôi nhọn, mặt lá không có lông, chỉ rìa lá có lông nhung. Sau khi ra hoa (Hnh 3) thì có quả đuôi màu trắng tím, trong hoa có sọc nhỏ màu tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại trên, ở chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả chín không nứt. Hnh 3. Hoa Codonopsis tangsheng - Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf) lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép nguyên, hai mặt đều có lông. Hoa (Hnh 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm, màu lam nhạt, trong có thới màu tím đậm. Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth. et Hook. (Hnh 4b) có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hnh 4c) có rễ hình củ tròn, thường được trộn lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc. Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc; còn ở phía Nam, chỉ có ở khu vực Tây nguyên. Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng và Lâm Đồng. Hnh 4. Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis lanceolata, và (c) C. ussuriensis. 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ. Dựa vào chất lượng của rễ sau khi thu hoạch, người ta chia ra làm 5 loại sau: Tây đảng sâm, Đông đảng sâm, Lộ đảng sâm, Điều đảng sâm, Bạch đảng sâm. Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy sucrose, glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin, nhiều loại alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-D-glucopyranoside, ethyl a-D- fructofuranoide, tangshenoside I, choline. Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành phần của chúng có các tác dụng dược lý như sau: tác dụng tăng lực, tác dụng đối với hệ tiêu hóa, tác dụng đối với hệ tim mạch, tác dụng đối với máu và hệ thống tạo máu, đối với điều hòa huyết áp, đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể, đối với hệ thần kinh trung ương, ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn. Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng với nạn tàn phá rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng phân bố tự nhiên của các loài này bị thu hẹp nhanh chóng. 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy đủ và toàn diện. Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa). Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài. Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và được gọi là phương pháp phân loại học phân tử. Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein). Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen. Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài. Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm. Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được. Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau : (i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật; (ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao; (iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài. 1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tnh hnh nghiên cứu 1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do có các tiêu chí: đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ, gen này cho mức độ phân biệt cao. Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào. Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide. Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài. Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau. Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên. Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng ở động vật . 1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật và một số loài tảo, thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch. Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F). Một vùng trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ADN ribosome). Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp. 1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật 1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung Nghiên cứu mã vạch ADN thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng ADN khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn. Các ứng dụng này có thể được chia thành hai loại rộng. Một là để cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp vào quá trình phân loại học: nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài. Ứng dụng thứ hai, là hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được thuộc loài nào. Mã vạch DNA thực vật có khả năng cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại cấp độ loài trong những nhóm có hình thái đơn giản, nhóm có phân bố rất rộng, nhóm có kích thước nhỏ, và / hoặc những nhóm đã được phân loại nhưng không đầy đủ, chưa tương xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ như một số trường hợp không thể dựa trên nguyên tắc phân loại hình thái học để đánh giá, phân loại, hoặc đã được phân loại nhưng chưa thực sự triệt để). 1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy, xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu. Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo. Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do: (i) vật liệu không phân biệt được bằng đăc điểm hình thái (ii) những vật liệu có tên tương tự nhau, và (iii) việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên liệu khác rẻ tiền hơn. Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột. Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến hơn. Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch ADN có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng. Dưới đây trình bày một số mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong các cây dược liệu. Vùng gen ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng xử lý tốt nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae. ITS đã được sử dụng thành công để phân biệt 14 lòai Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao” có nguồn gốc từ H. diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H. corymbosa (L.) Lam. Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R. tanguticum (Maxim. ex Regel) Maxim. ex Balf, R. officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L. với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao. Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị trí địa lý khác nhau. trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và tỷ lệ sai khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL và matK. Vì vậy, trnH - psbA được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó. Nó được dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum odoratissimum (Sm.)Lindl. ex. Hook.f. (Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw. với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ 2% đến 3,1%. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này có chất lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus. Tuy mức độ biến đổi thấp giữa các loài khác nhau nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ, thảo dược dương xỉ "Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai (Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả mạo). Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu thực vật Các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu do Khoa Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược Liệu, Bộ Y tế) cung cấp. Bảng 1. Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu Chi thực vật Nhóm mẫu Địa điểm thu mẫu Kí hiệu mẫu Codonopsis Codonopsis sp. C2 Codonopsis sp. Thị trấn Sa Pa, Lào Cai C4 Đảng Sâm vỏ trắng Thôn I, xã Hòa Bình, TP Kontum C11; C12 Codonopsis sp. Lô trồng T, Đa Sal, Lạc Dương, Lâm Đồng C13; C14; C15 Codonopsis sp. Mọc hoang, Đa Sal, Lạc Dương, Lâm Đồng C16; C17; C18 Đảng Sâm Xã Long Hẹ, Huyện Thuận Châu, Sơn La C20; C21 2.1.2. Hóa chất Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu được đặt từ các hãng uy tín đảm bảo về chất lượng và độ tin cậy như Qiagen, Fermentas, Sigma… 2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Một số thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: cân điện tử Satorius XB 200A (Thụy Sỹ), bể ổn nhiệt, máy đo quang phổ, máy đo ph, máy li tâm, máy PCR. 2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu Hai cặp mồi được sử dụng để nhân bản đoạn hai gen đích là gen ITS và gen matK, trình tự và thông tin về hai cặp mồi được thể hiện ở Bảng 5 Bảng 2. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu Gen đích Tên mồi Trnh tự mồi Nhiệt độ gắn mồi Kích thƣớc P1f 5’-ATT GAA TGG TCC GGT GAA GTG TTC G-3’ 55 o C 900bp ITS P2r 5’-AAT TCC CCG GTT CGC TCG CCG TTA C-3’ matK matK-390f 5’-CGA TCT ATT CAT TCA ATA TTT C-3’ 52 o C 900bp matK-1326r 5’- TCT AGC ACA CGA AAG TCG AAG T-3’ 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số Các mẫu thực vật được tách chiết lấy ADN tổng số bằng quy trình mini-CTAB và kit DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen. 2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết ADN tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TBE 1X, ở hiệu điện thế 90V với marker 1kb. Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được kiểm tra qua phương pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm. Pha loãng dịch chiết 100 lần (5µl mẫu + 450µl DDW), mỗi mẫu đo ba lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả cuối cùng. Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số A 260/280 , thông thường A 260/280 =1,6-2.0 được coi là mẫu tinh sạch, nồng độ ADN của mẫu được tính thông qua giá trị 1,0A 260 =50µg/µl. 2.2.3. Phƣơng pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR 9700. Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen được tóm tắt ở Bảng 6. Thể tích cụ thể của các thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng 7 và Bảng 8. Bảng 3. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 dd H 2 O 12.75 2 Tag buffer 10X 2.5 3 MgCl 2 25mM 2.0 4 DNTPs 10mM 2.5 5 Mồi xuôi 10pmol 1.0 6 Mồi ngược 10pmol 1.0 7 Tag DNA polymerase 1u/µl 0.25 8 ADN khuôn 3 9 Tổng thể tích 25 Bảng 4. Chu trnh nhiệt cho gen ITS Bước Nhiệt độ( o C) Thời gian Chu kỳ Khởi động 94 4p 1 Biến tính 94 40s 35 Gắn mồi 55 1p Kéo dài 72 1p Ổn đinh 72 7p 1 Bảo quản 4 ∞ Bảng 5. Chu trnh nhiệt cho gen matK Bước Nhiệt độ( o C) Thời gian Chu kỳ Khởi động 94 60s 1 Biến tính 94 30s 35 Gắn mồi 52 20s Kéo dài 72 50s Ổn đinh 72 5p 1 Bảo quản 4 ∞ 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trnh tự Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi giải trình tự tại hãng Bioneer tại Hàn Quốc 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu Các chuỗi DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình BioEdit trình (phiên bản 4.1.4). Cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự ADN của vùng gen ITS và gen matK bằng phương pháp tiết kiệm tối đa (MP) và Bayesian trên phần mềm PAUP (version 4.0 beta 10). Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số Chúng tôi đã tách chiết thành công 12 mẫu Codonopsis (xem Bảng 9) Hnh 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 1kb Bảng 6. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu Mẫu A 260/280 [ADN] µg/µl C2 1,50 86,2 C4 1,63 108,9 C11 1,52 85,1 C12 1,61 121,5 C13 2,00 170,6 C14 1,96 98,8 C15 2,00 170,6 C16 2,00 229,0 C17 1,95 191,3 C18 1,9 107 C20 1,85 84,5 C21 1,87 81,0 3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR Kết quả PCR thu được như sau: chúng tôi đã nhân thành công 11/12 mẫu Codonopsis với gen ITS (Hnh 6), 10/12 mẫu Codonopsis với gen matK (Hnh 7). Hnh 6. Ảnh điện di một số sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, M: marker 100bp Hnh 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, M: marker 100bp 3.3. Phân tích kết quả 3.3.1. Phân tích sự đa hnh trnh tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu [...]... có thể giúp nhận di n loài và dưới loài như một mã vạch phân tử, đồng thời công nghệ này có thể được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý Kiến nghị 1 Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc chi Codonopsis để đánh giá toàn di n hơn nữa tính đa dạng và phân bố của chi này ở Việt Nam 2 Nghiên cứu và ứng dụng các mã vạch phân tử này... tính đa dạng và phân bố của chi này ở Việt Nam 2 Nghiên cứu và ứng dụng các mã vạch phân tử này cho các nguồn dược liệu quý khác ở Việt Nam References Tiếng Việt 1 Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học 2 Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Giáo Dục 3 Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương... rRNA của cây Bình vôi”, Tạp chí Công nghệ SInh học, 1, pp 203-209 4 Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật 5 Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học 6 Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội 7 Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết quả sử dụng một số chuỗi... Sa Pa, Lào Cai) 5 Kết quả phân tích trình tự ADN và cây phát sinh chủng loại thu được, có thể kết luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis 6 Nghiên cứu này lần đầu tiên ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam, và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên...3.3.1.1 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên gen ITS Align trình tự ADN vùng gen ITS của 12 mẫu nghiên cứu cùng với 10 trình tự ADN vùng gen ITS của các loài thuộc chi Codonopsis đã được công bố trên GenBank bằng phần mềm Bioedit, cho thấy chi u dài vùng ITS giữa các loài dao động từ 638 đến 650 bp, GC trong vùng này khoảng từ 60,3% đến 62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chi m 17,4% trên toàn... xuất hiện, chi m 7% trên toàn bộ trình tự 2 Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự ADN vùng gen ITS có thể xác định các mẫu nghiên cứu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C javanica và mẫu C4 thuộc loài C tangshen 3 Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo thủ ở loài C javanica và C tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu 4 Xây dựng cây phát... khác là 2,6% 3.3.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại Cây chủng loại phát sinh cho thấy mẫu nghiên cứu là C4 nằm cùng nhánh với C tangshen, với chỉ số bootrap là 65%, còn lại các mẫu đều nằm cùng nhánh với C javanica với chỉ số bootstrap rất cao 100%, điều này phù hợp với kết quả phân tích tính đa dạng trong trình tự vùng gen ITS Hình 8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên... phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony) và Bayesian dựa trên khung đọc riêng rẽ từng gen ITS và matK cho kết quả tương đồng, cho thấy độ đáng tin cậy của cây thu được cũng như của 2 phương pháp MP và Bayesian sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh trong chi Codonopsis Các cây phân loại xây dựng được một lần nữa cho kết luận xác định các mẫu nghiên cứu thuộc hai loài C javanica (đối với... dưới loài KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận chính như sau: 1 Đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chi m 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa. .. (2007), “Kết quả sử dụng một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ cây lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, pp 77-83 Tiếng Anh 8 A., H.R (2005), “Medicinall plants: historical and cross-cultural usage patterns”, AEP, 15, pp 686-699 9 Albach D C., L.H.Q., Zhao N., Jensen S R (2007), “Molecular systematics and phyotchemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)”, Biochem Syst . Đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu Việt Nam thuộc chi Đảng Sâm (Codonopsis sp) bằng kỹ thuật AND mã vạch Nguyễn. đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc