Sử dụng chỉ thị phân tử rapd pcr để đánh giá tính đa dạng di truyền ở một số loài cây dược liệu bản địa ở việt nam

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G I A H À NỘI TRƯỜNG ĐẠI HOC K H O A HỌC T ự N H I Ẻ N _* * * * * _ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG AZOTOBACTER ĐỂ ú n g d ụ n g t r o n g n ô n g n g h i ệ p M ã số QT - - Chủ trì đê tài' TS Ngô Tự Thành Các cán tham gia: Ths Vũ Thị Minh Đức CN Hoàng Thị Lan Anh Ths Nguyễn Thu Hà TS Nguyễn Ngọc Quyên H n ội, 2003 BÁO CÁO TÓM TẮT a Tên đề tài Phân lập tuyển chọn chảng Azotobacter để ứng dụng nông nghiệp Mã sổ : QT - 02 - 17 b Chủ trì đề tài: TS Ngô Tư Thành c Các cán tham gia: - Ths Vũ Thị Minh Đức, khoa Sinh học, ĐHKHT N CN Hoàng Thị Lan Anh, Khoa Sinh học, ĐHKHTN Ths Nguyễn Thu Hà, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp, Văn Điển, Thanh Trì, Hà nội - TS Nguyễn Ngọc Quyên, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Vãn Điển, Thanh Trì, Hà nội d Muc tiêu nịi dung nghiên cứu: Phân lâp tuyển chọn chủng Azotobacter có số hoat tính sinh h ọc q nhằm sứ dụng việc sản xuất phàn VI sinh vật e Các kết đat được: - Từ 50 mẫu đất canh tác thu thàp địa phương phàn lập đươc 18 chúng Azotobacter Tuy không phái tất mảu đất có mãt loai vi khuẩn Chúng chi phàn lập đươc Azotobacter từ mảu đất có pH khoảng 5.15 đến 7,15 Những mẫu đất có pH thấp khơng phàn lâp loai vi khuấn Việc hong khô đất [àm tãng tính chon lọc phàn làp Azotobacter phần loai trừ đưoc Azomonas loại vi khuán siống Azotobacter không tạo thành bào nang - Trong số chủng phân lâp chon 03 chủng (ký hiệu 86.2, 76.6 20.2) có hoat tính khử axetvlen - etylen (acetylene reduction assav - A R a ) 181.58 ; 141.9 : 167,55 nM CnHVml/h Cả chúng hình thành axit indol axetic (indole - 3- acetic acid - IAA) mòt hocmon sinh trướng thưc vật thuộc nhóm auxm, VỚI hàm lượng 7,57 ; 9,50 ; 5,73 ug/ml dịch ni cấy Cả hai hoạt tính ARA IAA chùng nàỵ đểu cao hoat tính biểu hiên chùng Azotobacter chroococcum A T I nhâp nòi dùng để sản xuất phân vi sinh vật - Chúng 86.2 có khả phàn giải chất diêt cị 2,4D Tuy hoat tính chưa cao đăc điểm đáng ý - Các thừ nghiệm sinh hoc cho thấv chủng phân lâp kích thích sư nảy mầm hat ngô tẻ p l l lên 5,71% Đăc biệt với ngị lai ĐK888 (loai hat khó nảy mám) dich nuôi VI khuẩn làm tăng ti [ệ náy mầm từ 8.57 - 14,29% so với đối chứng ngãm ủ bang nước - Các cơng thức bón thèm chúng 86.2 ; 76.6 ; 20.2 qui mô châu vai cu xuân hè thu cho suất rau cao công thức đối chứng Hơn chất lương rau trắng thí nghiêm đươc cải thien; hàm [ương đường tổng số, vitamin c đểu cao đối chứng Hàm lương NO',' giám rõ rèt rau lơ thí nshiem - Chung tỏi cho rãng chuna Azotobacter chúnp phân lâp [uyển chon đéu đươc sư duns đế sản xuát phàn bón vi sinh vật cán trực tiếp đánh iá quv mò ruòng f - Bài báo: 01 Đào tạo: 01 Cử nhân Tinh hình kinh phí đé tài Tổng số kinh phí phân bổ: 8.000.000 đ (Tám triệu đổng) Đã chi khoản sau: • • Quản lí phí Điện nước 320.000đ lổO.OOOđ • T h khốn chu n m n 4.800.000đ • - Vật tư 2.720.000 đ 8.000.000đ Cộng Đã toán xong n ãm 2002 X ác nhân B C N khoa (Kí ghi rõ họ tên) Chủ trì đề tài (Kí ghi rõ họ tên) ^ Cơ quan chủ trì đề tài PHO HiỀu TRUỎNG / \ rL y %' LIST OF THE SCIENTIFIC PR OJECT IN THE YEAR 2002 OF UNU LEVER Branch: Biology Pro je c t: Screening Azotobacter for agriculture purposes Numerical code: QT - 02 - 17 Supervising agency: VNU Responsible agency: Hanoi University of Science Combined agency: M ain responsible person: Dr Ngo Tu Thanh Combined responsible: - MS Vu Thi Minh Due, Hanoi University of Science - BS Hoang Thi Lan Anh, Hanoi University of Science - MS Nguyen Thu Ha, Vietnam Agricultural Science (VASI) - Dr Nguyen Ngoe Quyen, VASI Implem enting period: from 2002 to 2003 10 T h e tar get of project: Screening Azotobacter for agriculture purposes 11 Abstract of the content and the result: - Result of Science and Technology: From 50 soil samples, 18 Azotobacter strains were isolated All of them were isolated from soil samples having pH values from 5.15 to 7.75 In the soils having lower pH Azotobacter was not found Drying soil samples seemed to be a sood improvement of the isolation: perhaps the selectivity of the soil was increased, a benificial result to Azotobacter while Azotomonas was killed because of lacking in cysts Among the isolated strains, strains (N° 86.2, 76.6 and 20.2) were selected because of their good properties: having activity of acetylene reduction assay (ARA) and activity of producing indol - acetic acid (IAA) - a plant hormone of auxin group The first activity of these strains was of 181.58 141.90 and 167.55 nM C2H / ml/ h, respectively The second one was of 7.57, 9.50 and 5.73 ug/ ml respsectively Both activities ARA and IAA of these strains were greater than those of Azotobacter chroococcum AT 19 - a imported strain used in microbial inoculant production The strain 86.2 was able to decompose the herbicide 2.4 dichlorophenoxy acetate (2.4D) It is interesting, although its activity was not very high The bio - assay showed that the culture supernatant liquor of all isolated strains stimulated the germination of maize grains The grain germination proportion of the maize race PI was increased by 5.71%, and of the maize hybrid race DK888 (difficult to be germinated) - by 8.57 - 14.29% in comparison with the control (grains incubated with water) On pot - scale, in both harvests (spring and summer), in all the soil formulae for inoculation with above strains, the celery cabbage (Brassica chinensis) productivity was higher than that of control without inoculation The quality of this vegetable was clearly improved: the contents of total susar and vitamin c were higher than those of control, while the NO-,' amount was decreased With the above properties, all the selected strains were considered suitable for production of microbial inoculant It IS necessary to evaluate the effectiveness of these strains on vegetable yields on field - scale Result o f training: 01 Bachelor Degree To contruct the material and technical bases Practical application possibility Publication: 01 paper (printing) Danh mục chữ viết tắt - ARA : A cetylene reduction assay - AND : A xit dezoxiribonucleic - CHQ : Chlorohydroxyquinol - 2,4D : D i c h l o r o p h e n o x y a c e t i c ac id - DHQ : Dihydroxyquinol - IA A : Indol ace tic acid - N - aza : Nitrogenaza - TCP : 2,4,6 Tnchlorophenol MỤC LỤC Trang Lời mở đ ầ u 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Đặc điểm chi họ Azotobacteraceae 1.1.1 Một số đăc điểm chi Azotobacter 1.1.2 Một số đặc điểm chi A zom onas 1.2 Sự phân bố Azotobacter tronơ loai đất 1.3 Chế phấm phân bón sinh học chứa Azotobacter hiêu trổng trọt nghiên cứu ban đầu 1.4 Khả nâng hình thành axit indol axetic (IAA) 1.5 Độc tính 2,4D nãns phân siãi số hợp chất có chứa nhàn thơm cùa Azotobacter 1.5.1 Đôc tính 2.4D 1.5.2 Khả nãne phàn giải hợp chất có chứa vịng thơm cùa Azotobacter 8 Vật liệu phương pháp 10 2.1 Vật l i ệ u 10 2.1.1 Mẫu đất vi sinh vật 10 2.1.2 Các hoá chất chất thử 10 2.1.3 Các máy m ó c 10 2.1.4 Các mòi trường 11 2.2 Phương pháp 11 Phàn ỉâp A zotobacter 11 2.2 Cách đo pH cua mẫu đất 11 2.2.3 Xác định đãc điểm tễ bào Azotobacter 11 2.2.4 Khả nãng cô' định ni tơ 12 2.2.5 Xác định I A A 12 2.2.6 Khả phân giải 2.4D 12 2.2.7 Tác động dịch nuôi vi sinh vật tới nảy mầm hạt ngô 13 2.2.8 Thí nghiệm qui mô chậu vại với rau cải trắng 14 2.2.9 Cách làm tiêu để quan sát hình dạng tế bào Azotobacter kính hiển vi điện tử quét 14 Kết thảo luận 15 3.1 Phân lập Azotobacter spp Từ mảu đất cópH khác 16 3.2 Một số đặc tính sinh học cùa chúng Azotobacter sứ dụng nghiên cứu 16 3.3 Phản ứn khử axetylen - etylen 19 3.4 Sự chuyển hoá trytophan thành IAA chủng Azotobacter 19 3.5 Sự phân giải 2,4D 20 3.6 Ảnh hưởng dịch nuỏi đến sư nảy mầm hat ngô 26 3.7 Năng suất chất lương rau cải trắng bón thèm Azotobacter 27 Kết [ u n 29 Tài liệu tham khảo .30 LỜI M Ở ĐẨU Khai chác sử dụng VI sinh vàt có ích phuc vu cho nơng nghièp hướng đai góp phần tãng nâng suất câv trồng làm giảm ô nhiẻm môi trường Azotobacter vi khuẩn hiếu khí, sống tự đất có khả nãng cố định mtơ phân tử Khả biết tới từ lâu Chế phấm sinh học có chứa Azotobacter đặt tên Azotobacterin mang lại thay đổi tỉch cưc nãng suất chất lượng cày trồnơ Trước đâv, người ta lầm tường hiệu mà chế phám mang lại cố định mtơ cùa vi khuẩn Tuy nhiên, thưc tế cho thấy q trình cố định nitơ không diễn môi trườns có chứa amon dù mơt lượng nhỏ Có lẽ hiệu mà chế phẩm Azotobacterin mang lại Azủtobacter tiềm tàng khả khác Các nghiên cứu sau khảng đinh: hiệu tốt cùa việc xứ lý hạt VỚI dịch huyền phù Azotobacter trước gieo trổng phần lớn Azotobacter có nãng tổng hợp chất kích thích sinh trường thực vật (axit indol axetic, axit eibberellic), vitamin (Bl B2 nicotinic, piridoxyl ), khả nâng tiết axit amin mỏi trường [7], Những nãng xem đặc tính tốt cần khai thác Gần đâv, mỏt số nhà khoa hoc nghiên cứu tháo luận khả nãns phàn siải số hợp chất vòng thơm (những chất độc người môi trường) cùa VI khuẩn Đâỵ đăc tính q cịn biết tới VI vậy, viêc phàn lâp tuyển chọn chủng Azotobacter có đặc tính q, ổn định sứ dung để sản xuất chế phẩm vi sinh dùnơ cho nỏns nghiệp cần thiết, bời lẽ chế phẩm nàv góp phần giải quvết vấn đề vể ô nhiễm môi trườns cũns đảm bảo sư an toàn thưc phám NỘI DUNG CHÍNH TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chi họ Azotobacteraceae Beijerinck người phàn lập mị tả hai lồi Azotobacter A.chroococcum sống đất A agiiis sống nước Sau lồi A vmelandỉi, A beijerinckii, A niasignis, A macrocytogenes A paspali tìm ra, mơ tả, định tên Trong khoá phân loại, họ Azotobacteraceae chia thành hai chi Azotobacter Azomonas khác khả nãng hình thành bào nang chu trình sống [18] 1.1.1.M ột sô' đặc điểm chi Azotobacter Các lồi chi có tế bào dạng hình trứng lớn, đường kính khoảng 1,5 2.0um Có tính đa hình, từ hình que tới dang hình cầu (coccoid) Tế bào đứng đơn độc từn2 cãp hoăc cum Azotobacter khơng có khả nâng hình thành bào tứ nhưnơ tế bào chuyến thành dang bào nans (cỵst) Thuộc nhóm hố dưỡng hữu cơ, sử dung nhiều loai đường, rươu axit hữu làm nguồn cacbon Hiếu khí nhưns cũnơ sinh trưởng nồna độ oxi thấp Có nâng cố đinh nitơ khịng cộnơ sinh 10 mg nitơ khí đươc cố đinh lg cacbonhỵdrat (thường glucoza) tiêu thu Các ion molvpđen cần cho trình cố định nitơ nhưns thay vanadium Khơns có khả nănơ phân giải protein Có thể sừ dụng nitrat muối amon môt số axit amin làm nguồn nitơ Phản ứn catalaza dươna tính pH thích hơp để sinh trường với có mãt nitơ hợp chất nằm phạm vi 4.8 - 8,5 pH tối thích cho sinh trường cố định mtơ khốna 7,0 -7,5 Aiotobacter có mãt trona đất nước Chi có mỏt loài liên kết với rễ cỏ ,4 paspali Trong mỏi trường khơnơ có nitơ nguồn cácbon glucoza tế bào non cúa tất cá loài đéu có hình dạng giống nhau: dạng que ngăn với hai đáu tròn, tr an s thái già tế bào thường có hình enlíp hình SƠ1 VỚI hat dư trữ ưa thuốc nhuộm Sudan metachromatic Khác VỚI hình dạng đãc trưng cùa lồi chi Azotobacter tế bào ,4 paspali luòn dang sợi dài cịn non Trên mơi trườnợ thach - pepton nước chiết nấm men hình dang tế bào tất ca loài tronơ chi đểu trớ nẽn dị dang Bào nang đươc hình thành trona óng ơiốnơ già với đường nguồn cácbon iMột số loài chi hình thành bào nang tế bào trẽn mỏi trường có chứa butan - - ol nguồn chất hữu có tác dung kích thích vièc hình thành nang Tất thành viên cua chi Azotobacter đêu vi 86.2 Đối chứng AT 19 Hình Anh hương cứa Aiotobcicter lên nảy mầm cúa hat ngò lai ĐK 888 3.7 Năng suất chất lượng rau cải tráng đươc bón thèm Azotobacter sp Thi nghiệm tiến hành qui mô châu vại tai Viên khoa hoc kĩ tht nịn° nghiệp Việt Nam Ngồi phàn NPK, mỏi chậu đươc bón thèm 10’ CFU Azotobacter sp Sau 45 ngày, nãng suất chất lương rau trâng dươc kiếm tra Kết nêu bảng hình Bảng Năng suất rau cải tráng bón thèm Azotobacter sp rI Vụ đông xuân Sỏ' lá/chậu Chúngo tươi thân Iuỹ chất (g/chậu) khơ (%) Số Cao Khối lương Tích Iuv lá/chàu tươi thân chát khò (cm) (2/chậu) (%) rr 1i : Khối lương Tích Vu hè thu 108.3 5.81 23.3 126.7 6.33 35.3 22.4 110.0 6.25 5.98 33,0 22.6 120.0 6.02 6.32 33.7 23.6 108.7 6.55 Đối chứng 49,0 90.2 5.86 33.3 86.2 53,7 121.9 6.63 34.7 76.1 49,0 141.5 6,33 20.2 49.7 110.0 AT 19 50.3 121.9 hai vụ đông xuân hè thư, cơng thức bón chùng 86.2 76.1 '’0.'’ cho nãng suất cao cõng thức đối chứng (khỏng bón A z o to b a a e r ) v~à tương đương với cơng thức bón chúng AT 19 (chủng đố! chứng) Chất lương rau cải trắng bón thêm Azotobacter sp trình bày bản° Bảng Chát lượng rau cài tráng bón thèm Azotobacter sp Vụ đông xuân Vu hè thu ■ Chủng Đường tổng Vitamin c (mg/100g) c N 3- Đường Vitamin (mg/kg) tổng số (mg/lOOs) số(%) NO,- i (ms/ks) ^ (%) Đối chứng 0,92 70,37 2,745 0,96 62.91 2.270 86.2 1,04 78,17 2,095 1,36 64,52 1.908 76.1 1,16 72.47 2,106 1.28 69.50 1.741 20.2 1.02 70.64 2,609 1.24 63.45 2.332 AT 19 1,06 72,65 2,132 1.20 62.24 1.784 Ị Theo kết phân tích Trung tâm kiểm tra tiêu chuấn hoá chất lương nỏnơ sản thuộc Viên sau thu hoạch, chất lượng rau còng thưc bon 86.2 76.1 20.2 tốt Đặc biêt hàm lượng nitrat cồng thức bón chùng 86.: 76.1 thấp rau đối chứng Hình Thí nghiêm ảnh hướng rau cai trảng cua Azorobacter KẾT LUẬN , Viéc hong khị đ í t lạm tăng tính chon loc phán lap A:o,oba a er Loa, V, khuẩn phát hiên mẫu đất có pH từ 15 đến 75 Ba chùng Azotobac.er kí h.ệu 86.2, 76.1, 20.2 sinh rtịng ,6t trén mơi rng nhàn tạo có hoạt tính ARA cao t a so vó, chúng đối chứng ,4 chroococcum a t 19 từ 17,0 - 56,78 nM C, H4/mI/h Sinh tổng hợp ỈAA cùa ba chúng cao hon chủng nhập nội A.chroococcum AT 19 từ 0,44 đến 2.37 ug/ml Chủng 86.2 có khả phàn giải chất diệt cỏ 2.4D Hoai tính chưa cao điểm đáng ý Cả chủng thí nghiêm đểu kích thích nảy mầm cua hạt ngơ lai ĐK.888 nợỏ tẻ p.ll làm tãng nãng suất cải thiện chất lương rau cài tráng Có thể sử dung chúng để sản xuất phàn bón vi sinh vàt sau đươc đánh giá hoạt tính qui mơ lớn 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Vu Hai, Trân QÚI Hiên (2001), Nghê làm vườn, tái lần thứ Nxb Giáo dục, tr 82 - 85 Trần Quang Hùng (1991), Thuốc trừ dịch hai bào vệ cày [rồng Cue trổng trọt bảo vệ thưc vật, Bộ Nông nghiêp CNTP tr 128 - 142 Vũ Văn Vụ, Hoàng Đức Cư, Vũ Thanh Tàm Trần Vãn Lài (1997), Sinh ly học thực vật, Nxb Nông nghiẻp, Hà Nôi Tiếng Anh Cox c (1999), "2.4D: Toxicology” J pesticide reform / spriniỊ, 19 pp - 19 Diab A Gounain M Y (1984) "Distribution of Azotobacter, Actinomvcetes Cellulose - degrading Acid - p r o d u c i n g and Phosphate dissolvinơ bacteria in desert and salt march soil of Kuwaite” Zbl Mikrobiol, 139, pp 425 -4 3 Essavvy El A A Saved El M Mohamed Y A H Shanshourv El A (1984) “Effect of combined nitrogen in the production of plant growth regulation bv Azotobacter chroococcum" Zbl Mikrobiolo 139 pp 327 - 333 Gonzles Lopez J Salmerson V Monero J Cormenaza - Kamoz A (1983), “ Amino acids and vitamins produced by Azotobaaer vinelandii ATCC 12837 in c h e m i c a l l y - d e f i n e d m e d i a a n d d i a l v c s e d soil m e d i a " Soil Biol Biochem 15, pp 711 - 713 Ishizawa s Suzuki T Ararag A (1975) "Effect of soil on Nitrogen fixation bv A - o to b a c te r vin e la m lu " N itro gen fix a tio n a n d S it r o o e n cycle 12 pp 61 -67 30 Klaasen c D., Watkins III J B (1999) Casarett and Doull's toxicology - the basic science o f p 01,Sion 5Ih Me Graw - Hill pp 561 - 564 10 Latus M., Seitz H J., Eberspacher J V., Lingen R (1995), "Purification and Characterization of Hvdroxvquinol 1.2 - dioxvgenase from Azotobacter sp Strain GP , Appl, Environ Microbiol., 61 pp 2453 - 2460 11 Lee M., Breckenndge c Knowles R (1970), ‘‘Effect of some culture conditions on the production of indol - - acetic acid and sibberellin - like substance by Azotobacter vinelandii" Can J M i c r o b i o l 16 pp 1325 - - 1330 12 Li D Y Eberspacher J Wagner B Kuntzer J Linsens F (1991) " Degradation of 2,4,6 - trichlorophenol bv Azotobacter sp Strain GP 1" Appl Environ Microbiol., 57, pp 1920 - 1928 13 Mishustin E N., Shilnikova V K (1969) “Free - living nitrogen - fixing bacteria of the senus Azotobacter" Soil Biology, UNESCO, pp.72 - 124 14 Misra s Kaushink B D (1989) Growth promoting subtances o f Cyanobacteria II Detections o f amino acids, sugars and auxins Proc Indian nant Sci Acad 55 pp -4-99 - 504 15 Rudnick p Meletzus D Green A He Kennedy c (1997), "Regulation of nitrogen fixation by ammonium in diazotrophic species of proteobactena" Soil biol Biochem., 29 pp 831-841 16 Sharma p K Chahal V p s ( 1985) ''The effect of amino group acceptors on the production of indolyl acetic acid from tryptophan by Azotobaaer", Microbiol 55 pp 1041 - 1043 17 Subba Rao N s (1980) “Azotobacier inoculant", Bioffertihzers in Agricultures 2,h Oxford and TBH publishing Co pp 77-79 18 Tchan Y T Peter D (1984) "Genus A z o t o b a c t e r B e r o e y 's manual o f systematic Bacteriology Williams Wilkins - Baltimore - London, pp 221 - 231 31 đ i h ọc q u ố c g ia h n ộ i TRUỒNG ĐẠI 1IỌC KHOA HỌC T ự N H IÊ N KHOA SINH HỌC Ilơ àn g T h ị Lan A nil PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG AZOTOBACTER CĨ ĐẶC TÍNH SINH HỌC Q KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ ĐẠI HỌC CHÍNH QUY Ngành: Cõng ngliệ sinh học Cán hướng dần: T S N g ô T ự T h n h 1là Nội - 00 v tạp chí DI TRUYỀN HỌC & ÚNG DỰNG g e n e t ic s a n d a p p l ic a t io n s ISSN : 0866-8566 144 Xuân Thuỷ, Hà Nội Tel: 7540602, 7680747; Fax: 7540602 E-mail : Luong@hn.vnn.vn GIẤY BIÊN N H Ậ N Nhận ông fail) /V ổ Ố _ T-HAN H C quan : /T /W / ^ _ 7t e -far '/D W T^c SỐ tiền : ' ' r- „ \ ơ< m u'*: Aỹã., đ G ỹ ef***- ) Bằllg chữ : (A /o f v ề khoản : L ệ f & 'étèý &T' &>&■' r '/ỉìc ~f/r4ý ỉ ?/^C r/-c r ĩ /■**•rf* rtc * c c ĩữ r > í c / c / l u y r ts ta ’/oẨ > dTcfef~ JỊ Hà Nội, ngày^ế tháng CỔnăm 200l§ Tổng bỉơn tập đ c t i n h s i n h h o c c ủ a m ộ t s ố c h ù n g A ZO T O B A C TE R NGỎ T ự TH À N H , v ũ THỊ MINH ĐỦC _ Trường Đại hoc Khoa hoe T nhiên Hà Nội NGU YỄN THƯ HÀ, N G U Y Ễ N N GỌ C Q U Y Ê N Wện Khoa học K ĩ thuật N ông nghiẻp Việt N am ' C^ a V1^C xư ^ ^at kàn§ huyển Azotobacter trước gieo ưổng dã đươc gh1 nhận tư lảu [ ] uơ ui la Azoỉobacter có khả nâng cố dịnh rntơ, tiết vào mỏi ưường vitamin, áxỉt amin nh chất kích thích sinh trường thưc vật (axit mdol axetic, gibberelic) [5 8], oan y m sô tạc gia [4, 6] phàn lâp, tinh c h ế mỏ rả mỏt số dâc tính cùa enzim cừ Azotobacter sp GD1.CÓ khả phán giải 2,4, - tnchlorophenol (một hơp chất đỏc, gày kích thích, tác nhân gày ung ^ ư, nguy hiem đỏi VỚI mỏi trường sống) Nghièn cứu nhầm vào dầc tính sinh học cua số chung A zo to b a cter phàn Iâp, có so sánh VĨI A chroococcum A T I nhập nội L VẬT L I Ê U V À P H Ư Ơ N G P H Á P Vi sinh v ật: A zo to b a cter chroococcum A TI9 nhàp nội đươc sừ dung làm chùng đối chứng Các chùng A iotobacter phân lặp từ đất cua vùng chuyên canh rau màu trẽn mỏi trường Burk Việc phán lâp dược tiến hành vơi hai lô đất: lô đươc giữ nguyên độ ấm ban đẩu lỏ đươc hong khỏ nhiét phịng rịi nghiển mịn Xác đinh k h ả n â n g cỏ đ in h nitơ Khả nâng đươc xác đinh cách đo hoat tính nitrogenza theo phương pháp khử axetvlen, máy sác ký khí PYE U N IC A M series 204 chromatograp (Anh) Xác đinh axit indol-3- axetic (IAA) Tiến hành theo chí dẫn [7] Chùng dươc cấy vào bình nón chứa 50 ml mịi trường Burk có chứa tryptophan 0,1%, ni máy lắc 200 vịng/phút 30°c ngày Li tầm loai bo tế bào Láy ml dich thèm vào óng nghiêm chứa sẩn 8ml thuốc thử Salkowstd cải tiến, lác Đé nhièt đỏ phịng 30 phút So mầu bước sóng 530 nm Hàm Iưcmg IAA đươc tính tốn dưa theo dồ thị chuàn Xác định k h n n g p h n giải 2,4 dichlorop henox vacetate (2,4D) Trước cấy vi khuấn, 200 mg 2,4D đươc thèm vào lít mổi trường vỏ trùng có hàm lương glucoza mức 0, 5, 10, 15, 20 2/1ít Ni Iãc 200 vịng/phuĩ nơày Li tàm lanh 6500 vòng/phút 15 phút Dịch lọc qua phiến loc khuân 0,2 U m vò trùnơ dê loai hết tẻ bào cịn sót lai Đo phổ hấp phụ trèn thiết bị từ ngoai - Ịcha biến - hổng ngoai gán ( u v - VIS - NIR - Scanning spectrophotometer v 3101 PC) (Shimadzu - Jp) Đỏi chứng dịch ni VI khn khỏng bị sung 2.4D dịch mồi trườnơ có bổ sung 2,4D Ịchỏng cáy vi lchuàn Hàm lương 2,4D đươc tính theo đổ thị chuấn xác định máy bước sóng 283 nm [1J Xác định ả n h h n g c ù a dịch nuòi Azotobacter spp tới sư m âm hat ngò Hat giốnơ ngổ tẻ p l l ngỏ lai ĐK.888 đươc khư trùng bảng HgCl2 0, 1^0 phút Rừa lai bans nước cat vỏ trùng nhiểu lần Ngầm hạt nươc cất vỏ trùng tư dến Sau dó u hạc VỚI dich vi sinh vật li tâm loại bò tẽ bào (pha loãng ty lẻ 5%) ^0 c Thí nghièm q u v m ị c h u vai với rau cải trân g Thí nghiêm tiến hành vụ đông xuân hè thu Mỗi châu chứa 7kg đất Nén phàn bón 40 N* 80 p - 40 K i ổ C ịn thức thí nghiêm đươc bón thèm 10 tế bào A zotobacter /châu Thí nghiệm đươc lap lai lán Sau 45 ngày trổng, thu hoach v d n h giá theo chi tièu: số lá/châu, khói lương tươi thân chiều cao cày, % vàt chảt khị Hàm lương vitamin c đường tổng sơ hàm lưcmg N ỏ dược xac đinh Trung tam kiếm tra tiêu chuan hoá chát lương nỏng sản thuộc Viên sau thu hoạch II KẾT QUÀ VẢ THAO LUẬN 1* Phàn làp A zo to b a c te r spp từ cac m àu dàt Từ 13/38 m au dal hong khó 6/ l í mảu đâl j i ữ nguyên đô im dã phá h,ẽ„ , có M I cua o b a a er T uy nhién chim? thu nhãn từ dã t h ò tòn ta, tò .rong đ.éu k.en nuo, y n h in tao Các \ r u ràn a r,nh nan® thiết dians dàl*bà° quản trcng Ĩn§ nghlẻm hình dẻh' thành ÍT h™ I A L s ^ n g Azoiobacter khỏng bào ỌC, VI c hong khỏ đất nhiẻt đỏ phòng trước phần làp A zotobacier cẩn Việc phản ,tiCỊ\ cho thày Azotobacter thường có mát mảu có đô pH 5.15 - 7,75 lchỏng cac m u co J> t p ơn Theo nghiên cứu trước dâv [9] A zotobacier thường tổn tai đát có pH axit yếu đến kiềm Phản ứng k axetylen - etylen (acetylene reduction assay - ARA) sô chung phàn lập dược, phát hiẻn chùng có hoat tính AR A cao so với chủng đối chứng A.chroococcum AT 19 từ 17,0 - 56,78 nM C H J m l/ h tương ứng với 13.7 45,49% K ết q uả trình bầy bảnơ Khả tổng hợp axit indol - - axetic (IAA) LAA la m ột hocm ịn sinh trường thực vật thuộc nhóm auxin Nguồn nguyên liệu giàu IAA phần non hạt cua cày Một sị vi khn có khả tổng hơp loại auxín Chúng tỏi phát chùng có hoat tính AR A cao nói có khả nãne tổng hợp IAA Đơi chứng chủng chroococcum AT 19 Kết quà trình báy bàng A zo to b a cter sp 86.2 76.6 20.2 A chroococcum AT 19 c v (%) LSDoos Hoat tính ARA (nM C H ^ m l/h ) Tòna hơp IAA ( 1/ g/rnl) 181,58 141.90 167,55 7,57 9.50 5.73 124.8 3.1 9,46 7.13 3.3 1.24 Sư phàn giải 2,4 dichlorophenoxyaxetat (2,4D) D chất trừ có dại có chế tác dung gần giòng hoat động cùa auxin, IAA Dưới tác đ ộ n a 2.4D thực vặt phát triển với tịc nhanh bãt thường bi chết Lơi dung dãc tính kích thích sinh trương thực vật, nhiều người trồng rau phun 2.4D VỚI liều lương tháp khiến rau trớ lên xanh non hấp dẩn người tiêu dùng Tuy nhiên, chất chlorophenoxy khác 2.4D chất dôc đỏi VỢI mắt (nhóm độc 1) độc qua đường rt dang sữa (nhóm dộc 3) Thèm vào thời gian tư phàn huỷ cùa 2,4D kéo dài tới tháng [2 3, 10] Tìm hiểu khả nãnơ phàn giải 2.4D thương phấm cùa chùng Azotobacter sp 86.2 nhàn thâv với D pOOm a/I) nsuổn cacbon nhất, chung sinh [rương yéu Vièc bỏ sung 10, 15 ơớ/l olucoza tã điều kiện tốt cho tế bào phát triển lương :.4 D cịn sót lai tương ứng với lương glucoza bơ sung nói trẽn là- 179.5: 127.7; 145.8: 156.9mg/l Như Vày chùng 86.2 có kha phàn giai yếu 4D CO bo sung jlu c o z a vào mòi trường khả tăng lên đat cực đai nịng glucoza lOg/1 sau đo giảm cacTường giucoza cao Phổ hấp phu 2.4D mảu nuỏi cấy dưoc quét trẽn thiết bị từ ngoại - khả biến - hồng ngoại gần dược rrmh báy hình Hình Lượng 2,4D cịn lại A M ẫu đói chứng B M ẫu bo sung glucoza 5g/I Ảnh h n g c ủ a d ich nuỏi tới Sau ngâm ù với dich 76.6; 20.2 kích thích sư nảy 8.57 - 14,29% sơ với đối chứns chùng 86.2 làm tảng nảy mầm tro n mảu nuổi cấy c Mẫu bỏ sung glucoza I0g/I D Mẫu bỏ sung glucoza 20g/l sư m ầm cùa hat ngị ni cấy pha lỗng 5% chúng tịi nhàn thấy dịch nuồi chùng 86.2; mầm cùa hạt ngỏ (bang 2) VỚI ngỏ lai Đ K 888 tý lệ m ầm tảng từ ngâm ù bâng nước Ty lệ màm ngỏ tẻ p l l tảng 5,71% Đãc biẻt cùa hat ngô lai ĐK 888 lèn 2,86% so VỚI chùng A chroococcum AT 19 (chùng đối chứng) Kết ưình báy bang — p - -Chùng Đối chứng (H.0) 86.2 76.6 ■70 A chroococcư m A T 19 Tv lê nàv mầm ! mc) N ã tẻ p 11 Nsơ lai ĐK 888 94.29 48.57 100 62.36 100 57.14 100 60.00 100 60.00 Nâng suất chất lương rau cải trâng đươc bon Azotobacter SP* uỵ té Thi n g h iệm u ụ c tlin M ó quy mơ chau va,, ligọà, n ín p h in NPK mó, ch iu đưoc bon t o s p S u 45 ngày, nâng suit chá Iưong rau cai ưáng d UOc k,èm ưa K í bào trình b ầy bảng lJ n -3 Nang suếl rau cải trángjthi d „ « bliri thèm _ V U X U A N I - VU HẺ THU Khói Chiều lưọng tươi thàn cao cày (cm) (g/chậu) 108.3 22.5 126.7 23.3 22.4 110.0 22,6 120.0 108,7 23,6 12.9 11,2 26.1 2.1 Khối Chùng Sô lá/chậu lượng tươi thân (g/chặu) Đổi chứng 49,0 53,7 49,0 49,7 50,3 9.5 8.5 86.2 76.6 20.2 AT 19 CV(%) LSD n05 90.2 121,9 141.5 110 J 121.9 21,5 46,2 Tích luỹ chất khị Sỏ lá/chậu (%) 5.86 6,63 6.33 5.98 6.32 33,3 34.7 35,3 33.0 33.7 5.8 3.4 Tích luỹ chát khị (%) 5.81 6.33 6.25 6.02 6,55 Kết qua cho thây, ợ cơng thức bón chùng 86.2, 76.6, 20.2, vụ (xuân hè thu) đểu cho nâng suât rau cao công thức đối chứng (khơng bón vi sinh vật) tương đương với cịng thức bón chùng AT 19 (chùng đối chứng) Chất lượng rau cài trắng bón thẻm A zotobacier sp trình bầy bảng v u XU AN CHỬNG Đường tổ n g sỏ (% ) 0.92 1,04 Đói chứng 86.2 76.6 20.2 AT 19 Vitam inC (m g/100g) 70.37 78,17 72,47 70,64 72,65 1.16 1,02 1.06 VU HÈ THƯ Đường tổng sỏ (% ) NO-J (mg/kg) 2.745 2,095 2.106 2.609 2.132 0.96 1,36 1.28 1.24 L.20 V itam inC (mg/lOOg) NO (mg/kg) 62.91 64.52 69,50 63,45 62,24 2.270 1.908 1.741 2.332 1.784 Ị T heo kết phân tích trèn cùa Trung tâm kiêm a tiẻu chuẩn hoá chất lượng nòng sản, Viện sau thu hoạch, chất lượng rau cịng thức bón 86.2, 76.6 20.2 đéu tốt Đặc biệt hàm lương nitrat thấp so với rau đối chứng III KẾT LUẬN T 19/50 m ẫu đất phát thấy có mặt cùa Azotobacter Phần lớn chúng có mặt mẵu dất có p H 5,15 - 7,75 ? Đ ã tuvển chon chùng Azotobacter sp 86.2 76.6, 20.2 sinh trường ổn định, có hoat tính ARA tổng hop IAA cao chùng nhập nội A chroococcum AT 19 Ba chung kích thích mầm cùa hac ngổ lai Đ K 888 ngò cẻ PA tăng nâng suất cải thiện chát lương rau cải trắng Đãc biệt chùng 86.2 có khả phàn giải 2,4D khả nãng tãng cương kĩứ chùng nuôi glucoza nòng đỏ 10g/l so VỚI nòng độ khác TÀI LIÊU THAM KHAO Cason R and R eed L.W 1977: Chemistry of two clay systems and three phenoxy herbicides Proc ! S a r e t t l n i ' D o u i r s ' t o x t o l o g y 1999: T H r i ■S o ' r o p h ^ a c e t i c Environ M icrobiol., s s b p e ? l gr**- ô * # ã ã* Of Alraane I c Ị t ị M y i o S Bmgi a Three Nitr„ g; „ C o n c e n t , o l I V„ro A p p I 59: 2642 - 2647 4' t ar lVL; s®11* * 1' U b e r s p a d i e r ^ -2 ‘ J v Lingen K., 1995:Purirication -uul Characterization of ygenase fr0m A :ul° ^ r Ĩ - Strain G P Appl Environ" Microbiol 61: Lee M., B r e c k e n r i d g e c & Knowles R 1970: Effect of some culture conditions on the producuoM of indole-3-acetic aci and a gibberellin-like substance by Azoiobucter vm elandii, Can.I Microbiol 16: 225- L330 Li D Y., E b e r s p a c h e r J , VVagner B K u n tz e r J & Lingens F 1991: Degradation of 2.4 6trichlorophenol by A zo to b a cter sp.strain G P Appl Environ Microbiol 57: 19^0 - ^19°s 7.Misra s & K a u s h i k B.D., 1989: Proc Indian natn ScL Acad 55: 449 - 504 Subba R ao N.S., 1980: A zotobacter inoculant in: Biofertilizers in Agricultures, 2nd edition, Oxford ẤL 1BH 9.Tchan Y.T & P e t e r D.f 1984: Genus Azoiobacter in: Bergev s manual of Systematic Bacteriology Krieg N.R & Holt H.G (eci), Williams & Wilkins: 220 - 231 10 Trản Q u a n g H u n g , 1991: Thuòc trừ ciich hạI báo vệ cày Cue trọi bảo vệ thực vặt, Bộ Nông nghiệp CNTP: 142 - 128 SUMMARY b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f som e a z o t o b a c t e r s t r \in s N g o T u Ihcinh, V LI Till M in h D ue H a n o i U n iv e r s ity (if S c ie n c e N g u y e n N g o c Q u y c n N g u y e n T h u Ha \ It’tiia}}) A g r ic u ltu r a l S c ie n c e Insfititle From 50 soil s a m p l e s , 18 A z o to h a c te r sliiiins WCI'C isolated All o r th e m WCIC isolated from soil sam p le s having pi I values from \ 15 to 7.75 Ill Ihc soils liavimlower pH, A zo to b a cter was not found Drying soil samples seemed lo lie a good improvement of the isolation: perhaps the selectivity of Ihe soil was increased, a beneficial result to A zoto cler, while Azolonumus was killed because of lacking 111 cysts Among the isolated strains, strains ( N" / T