PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Cẩm Dương PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2010 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Cẩm Dương PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đinh Đoàn Long Hà Nội - 2010 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn này, trước tiên tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đinh Đoàn Long, Chủ nhiệm môn Di truyền học, Khoa Sinh học trực tiếp hướng dẫn, bảo công tác nghiên cứu khoa học Đồng thời, muốn trân trọng cảm ơn cán thuộc Khoa tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Bộ Y tế), cung cấp giúp phân loại mẫu thực vật sử dụng nghiên cứu Qua muốn bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới thầy, cô giáo môn Di truyền học, Khoa Sinh học đặc biệt Th.S Trần Thị Thùy Anh tạo điều kiện thuận lợi động viên tơi suốt q trình học tập môn Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban giám độc PTNTĐ Công nghệ Enzyme Protein thuộc Khoa Sinh học tạo điều kiện thuận lợi cho trang thiết bị sở vật chất trình học tập nghiên cứu Đề tài nghiên cứu hỗ trợ phần tài từ đề tài Klept.09.05 thuộc PTNTĐ Cơng nghệ Enzym Protein Cuối xin bày tỏ lịng biết ơn vơ sâu sắc tới bố mẹ, bác đặc biệt anh chị tôi, người hỗ trợ mặt suốt trình học tập Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) Nhân dịp này, trân trọng gửi lời cảm ơn tới anh chị khóa trên, bạn bè thân thiết ln cổ vũ, động viên sát cánh bên tơi suốt q trình học tập vừa qua Hà Nội, tháng 12 năm 2010 Học viên Nguyễn Cẩm Dương DANH MỤC CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid ADNts ADN tổng số Total DNA ARN Axit ribonucleic Ribonucleic acid ASSOCHAM Hiệp hội thương mại công nghiệp Ấn Độ The Associated Chambers of Commerce and Industry of India cs cộng Co-workers CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide bp Cặp bazơ nitơ base pair ddH2O Nước cất khử trùng hai lần Double distilled water DDT Thuốc trừ sâu dichloro-diphenyltrichloroethane Dichloro-Diphenyl-Trichloroethane dNTP Deoxyribonucleotit triphosphat Deoxyribonucleotide triphosphate EDTA Ethylene diamine tetraacetat Ethylene diamine tetraacetate HPLC Sắc ký lỏng cao áp High pressure liquid chromatography IUCN Liên minh bảo tồn thiên nhiên giới International Union for Conservation of Nature kb Kilo bazơ Kilo base NTSYS Phần mềm hệ thống phân loại số Numerical Taxonomy System M Thang ADN chuẩn Marker OD Mật độ quang phổ hấp thụ Optical Density OPA,OPC Các mồi oligonucleotit PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN Polymerase Chain Reaction RAPD Đa hình phân đoạn ADN nhân ngẫu nhiên Random Amplified Polymorphic DNA RAPD-PCR Tương tự RAPD Rb1 Nhóm ginsenoside Rb1 (có mặt protopanaxadiol) The ginsenoside Rb1 group RFLP Đa hình độ dài đoạn giới hạn Restriction fragment length polymorphism i Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh Rg1 Ginsenoside nhóm Rg1 (có chứa protopanaxatriol) The ginsenoside Rg1 group STR/SSR Trình tự vi vệ tinh Microsatellite/simple tandem repeats TBE Đệm gồm Tris, Borate EDTA Tris/Borate/EDTA buffer TE Đệm gồm có Tris EDTA UPGMA Thuật tốn phân cặp dựa giá trị trung bình Unweighted pair group with arthmetic means V Vol Volte v/v Tỉ lệ pha theo thể tích/thể tích Volume/volume WHO Tổ chức Y tế giới World Health Organization ii MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU 1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.3 LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 12 1.3.1 Thực trạng nghiên cứu dược liệu Việt Nam 12 1.3.1.1 Nghiên cứu chi Acanthopanax 12 1.3.1.2 Nghiên cứu chi Illicium 14 1.3.1.3 Nghiên cứu chi Morinda 15 1.3.1.4 Nghiên cứu chi Panax L 16 1.3.2 Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR 19 1.3.3 Mục tiêu đề tài 22 Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 VẬT LIỆU THỰC VẬT 24 2.1.1 Chi Acanthopanax 24 2.1.2 Chi Illicium 26 2.1.3 Chi Morinda 27 2.1.4 Chi Panax L 28 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31 2.2.1 Tách chiết ADN tổng số phương pháp Mini-CTAB cải tiến 31 2.2.2 Phân tích di truyền kỹ thuật RAPD-PCR 33 2.2.3 Điện di ADN gel agarose 34 2.2.4 Dựng quan hệ di truyền phần mềm NTSYSpc 2.02h 35 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 38 iii 3.1.1 Kết tách chiết ADNts từ mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax 38 3.1.2 Kết tách chiết ADNts từ mẫu thực vật thuộc chi Illicium 38 3.1.3 Kết tách chiết ADNts từ Ba kích (Morinda officinalis How) 39 3.1.4 Kết tách chiết ADNts mẫu thực vật thuộc chi Panax L 39 3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI CÂY THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU 41 3.2.1 Sự đa dạng di truyền loài thuốc thuộc chi Acanthopanax 42 3.2.1.1 Phân tích đa hình lồi ngũ gia bì gai (A trifoliatus) 43 3.2.1.2 Phân tích đa hình lồi ngũ gia bì hương (A gracilistylus) 46 3.2.2 Sự đa dạng di truyền loài thuốc thuộc chi Illicium 48 3.2.2.1 Phân tích đa dạng di truyền loài hồi hương 48 3.2.2.2 Phân tích đa dạng di truyền loài hồi núi 51 3.2.3 Sự đa dạng di truyền loài thuốc Ba kích 53 3.2.4 Sự đa dạng di truyền loài thuốc thuộc chi Panax L 56 3.2.5 Bước đầu xác định tập hợp số thị RAPD-PCR giúp phân biệt nhanh nguồn nguyên liệu từ loài thực vật nghiên cứu 61 3.2.5.1 Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ lồi dược liệu Ngũ gia bì gai Ngũ gia bì hương 61 3.2.5.2 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài hồi hương với loài hồi núi 63 3.2.5.3 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt dạng hình thái khác lồi Ba kích 64 3.2.5.4 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt loài Sâm Việt Nam, Sam Vũ Diệp Tam thất hoang 66 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 KẾT LUẬN 68 KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 iv DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng Thế hệ thị ADN Bảng Thế hệ thị ADN 7 10 Bảng Danh sách mẫu dược liệu thu thập phân tích nghiên cứu 25 Bảng Thế hệ thị ADN thứ hai Bảng Thành phần (bảng bên trái) quy trình nhiệt (bảng bên phải) phản ứng RAPD-PCR Bảng Số băng RAPD đa hình thu từ mẫu quần thể loài Acanthopanax trifoliatus A gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên Bảng Số băng ADN đa hình thu từ mẫu quần thể lồi Ngũ gia bì gai (A trifoliatus) (ký hiệu G) thu Lào Cai, Cao Bằng Lạng Sơn phân tích theo mồi RAPD Bảng Số băng RAPD đa hình thu từ mẫu quần thể lồi Illicium verum lồi hồi núi phân tích với 15 mồi ngẫu nhiên Bảng Số băng RAPD đa hình thu từ mẫu quần thể lồi Ba kích (Morinda officinalis) với dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lơng (L); dạng thân khơng có lông (K); dạng tụ (T) dạng rời (R) với 12 mồi ngẫu nhiên Bảng 10 Số băng RAPD đa hình thu từ mẫu thuộc ba loài Sâm Việt Nam (SVN), Sâm Vũ Diệp (SVD) Tam thất hoang (TTH) phân tích với 13 mồi ngẫu nhiên Bảng 11 Tập hợp thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng giúp phân biệt loài dược liệu nghiên cứu v 34 42 45 48 53 57 67 DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình Ảnh loài thực vật thuộc chi Acanthopanax nghiên cứu: a-b) Bụi cây, hoa Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, hoa Ngũ gia bì hương 26 Hình a-b) Hình thái Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái hồi núi (I anasitum) 27 Hình Hình thái loại kiểu hình Ba kích sử dụng nghiên cứu: a) tụ; b) rời; c) thân có lơng; d) thân khơng có lơng 28 Hình Các lồi thực vật thuộc chi Panax L nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P bipinnatididus); c) dạng trung gian Sâm Vũ DiệpTam thất hoang; d) Tam thất hoang (P stipulenatus) 29 Hình Bản đồ địa phương thu mẫu dược liệu nghiên cứu 30 Hình ADNts tách chiết từ phần mơ khác nhau: hình bên trái - ADNts từ mẫu Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ phần mô khác sâm (V) M: thang ADN chuẩn Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 40 Hình Ảnh điện di ADN tổng số mẫu dược liệu thu thập nghiên cứu: a) mẫu loài Ngũ gia bì gai (G) Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu loài Hồi hương (I) Hồi núi (N); c) mẫu lồi Ba kích (K); d) mẫu loài Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT) M: thang ADN chuẩn Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 40 Hình Hình ảnh điện di số sản phẩm RAPD-PCR mẫu Ngũ gia bì gai (G) Ngũ gia bì hương (H) nghiên cứu: a) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; b) Sản phẩm điện di với mồi OPA5 M: thang ADN chuẩn Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 43 Hình Sơ đồ hình quan hệ di truyền mẫu thuộc hai loài thuốc Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hiệu G) Ngũ gia bì hương (A gracilistylus – ký hiệu H) thu thập Việt Nam sở phân tích thị RAPD-PCR Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 44 Hình 10 Sơ đồ quan hệ di truyền 39 mẫu Hồi hương với 11 mẫu Hồi núi nghiên cứu Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 52 Hình 11 Sơ đồ hình phản ánh mối quan hệ di truyền 25 dịng Ba kích nghiên cứu Nguồn gốc đặc điểm mẫu trình bày Bảng 54 vi Hình 12 Băng đồng hình (chỉ hình đầu mũi tên) mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất hoang (VT) tương ứng với mồi OPA14, OPC1 OPA7 57 Hình 13 Cây quan hệ di truyền mẫu Sâm Việt Nam (ký hiệu S), Sâm Vũ Diệp (ký hiệu V), dạng trung gian Sâm Vũ Diệp Tam thất hoang (ký hiệu VT) Tam thất hoang (ký hiệu T) nghiên cứu lập số liệu thu từ phân tích RAPD-PCR Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 59 Hình 14 Băng đồng hình (chỉ hình mũi tên) mẫu ngũ gia bì gai (G) ngũ gia bì hương (H) nghiên cứu với mồi OPA10 Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu bảng 62 Hình 15 Băng đặc trưng phân biệt (chỉ hình mũi tên) mẫu Ngũ gia bì gai (G) Ngũ gia bì hương (H) nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái) mồi OPA1 (hình bên phải) M: thang ADN chuẩn Trong đó, thị OPA12750 OPA1500 đặc trưng cho mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai; thị OPA12950 OPA1300 đặc trưng cho mẫu thuộc lồi Ngũ gia bì hương Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 62 Hình 16 Băng đồng hình (chỉ hình mũi tên) mẫu thuộc nhóm lồi Hồi hương (I) (hình bên phải) lồi Hồi núi (N) nghiên cứu với mồi OPA7 (hình bên trái) M: thang ADN chuẩn Băng đặc trưng phân biệt hồi núi băng có kích thước 1800 bp Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng 63 Hình 17 Băng đồng hình (chỉ hình mũi tên) tất 25 mẫu Ba kích nghiên cứu với thị OPA17 Dạng hình thái thân có lơng (L), khơng có lơng (K), dạng hình thái tụ (T) hình thái rời (R) Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng M: 64 thang ADN chuẩn Hình 18 Hình ảnh điện di mẫu Ba kích với mồi OPA1 Băng đồng hình hai dạng hình thái thân có lơng (L) khơng có lơng (K) có kích thước 600 bp 300 bp (chỉ hình mũi tên) Băng đặc trưng phân biệt kiểu hình thái thân khơng có lơng có kích thước 1100 bp Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu Bảng M: thang ADN chuẩn 65 Hình 19 Ảnh điện di mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) Tam thất hoang (T) với mồi OPA14 OPC16, hình mũi tên băng đặc hiệu phân biệt cịn hình đầu mũi tên băng chung M: thang ADN chuẩn (1kb marker) Nguồn gốc 66 đặc điểm mẫu nêu Bảng vii LUẬN VĂN THẠC SĨ 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 with mini satellite core sequences yields DNA fingerprinting probes in wheat” Theor Appl Genet., 95, p276-283 Beckmann J.S (1988), “Oligonucleotide polymorphisms: A new tool for genomic genetics”, Bio/Technology, 6, p161-164 Beckmann J.S and Soller M (1990), “Toward a unified approach to genetic mapping of eukaryotes based on sequence tagged microsatellite sites”, Bio/Technology, 8, p930-932 Bensky D., Gamble A et al (1993), Chinese Herbal Medicine Materia Medica, Seattle: Eastland Press, 331-332 Blanc P.D et al (2001), Alternative therapies among adults with a reported diagnosis of asthma or rhinosiusitis, data from a population-based survey, Chest, 120, 1461-1467 Buiatti M., Maestri E., Malcevschi A., Marmiroli N., Aert R., Volckaert G., Rudea J., Linacero R., Vazquez A., Karp A (1997), “Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network ofEuropean laboratories”, Mol Breed, 3, p381–390 Burstein H.J et al (1999), “Use of alternative medicine by women with earlystage breast cancer”, New Engl J Med, 340, 1733-1739 Caetano-Anollés G., Bassam B.J and Gresshoff P.M (1993), “Enhanced detection of polymorphic DNA by multiple arbitrary amplicon profiling of endonuclease-digested DNA: identification of markers tightly linked to the super nodulation locus in soybean”, Molec Gen Genet., 241, p57-64 Chan K (2003), Chemosphere, 52, 1361 Chen X.C., Xia L., Hu S., Huang G (1996), “Inhibitory effects of Acanthopanax gracilistylus saponins on human platelet aggregation and platelet factor liberation in vitro”, Zhongguo Yao Li Xue Bao, 17(6), 523526 Cheng, K.T., Tsay, H.S., Chen, C.F., Chou, T.W (1998) " Determination of the components in a Chinese prescription, yu-ping-feng san, by RAPD analysis" Planta Medica, 64: 563-565 China National Medicines & Health Products Imp & Exp Corporation, Memory-enhancing Brain Tonic, Curing Herbs com Choi J et al., (2005) "Antinociceptive anti-inflammatory effect of Monotropein isolated from the root of Morinda officinalis" Biol Pharm Bull 28(10):1915-8 Chris Duran et al (2009), “Molecular genetic markers: discovery, applicatiosn, data storage and visulaisation”, Current Bioinformatics, 4, 16- 71 LUẬN VĂN THẠC SĨ 27 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Cui, C., et al (1995) "Antidepressant active constituents in the roots of Morinda officinalis How", Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 20(1):36-9 Dargan P.I., Gawarammana I.B et al (2008), Int J Environ Health, (3/4), 136 Diego Ize-Ludlow, et al (2004), “Neurotoxicities in infants seen with the consumption of Star anise tea”, American academy of Pediatrics, 114(5):653-656 Dorthe Joker and Nguyen Duc To Luu (2002), “Illicium verum Hook.f, Seed leaflet”, Danicla Forest Seed centre , 52 Du J., Gao L (1992), “Chemical constituents of the leaves of Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.”, Zhongguo Zhong Yao Za Zhi, 17(6), 256-257, 383 Gocmen B., Jermstad, K.D., Neale, D.B and Kaya, Z (1996) "Development of random amplified polymorphic DNA markers for genetic mapping in Pacific yew (Taxusbrevifolia)" Can J For Res 26 (3): 497503 Grodzicker T et al (1974), “Physical mapping of temperature sensitive mutatiosns”, Cold Spring Harbor Symp, 39, p439-470 Hadrys H., Balick M., Schierwater B (1992), “Applications of random amplified polymorphicDNA (RAPD) in molecular ecology”, Molec Ecol1, p55–63 Hatada I., Hayashizaki Y., Hirotsune S., Komatsubara H and Mukai T (1991), “A genome scanning method for higher organism using restriction sites as landmarks”, Proc Natl Acad Sci USA, 88 , p397-400 Hosokawa K., Minami, M., Kawahara K., Nakamura I and Shibata T (2000) "Discrimination among three species of medicinalScutellaria plants using RAPD markers" Planta Medica, Stuttgart, V 66: 270-272 Huong N.T.T., Yukihisa Murakami, Michihisa Tohda, Hiroshi Watanabe, Kinzo Matsumoto (2005), “Social isolation stress-induced oxidative damage in mouse brain and its modulation by majonoside-R2, a Vietnamese ginseng saponin”, Biol Pharm Bull., 28(8), pp 1389 – 1393 Jeffrey A.J (1979), “DNA sequence variants in the GA and B-globin gense of Man”, Cell, 18, p1-10 Jeffreys AJ., Wilson V and Thein SL (1985), “Hyper variable satellite regions in human DNA”, Nature, 314, p67-73 Jones C.J., Edwards K.J., Castaglione S., Winfield M.O., Sala F., Wiel C van de, Bredemeijer G., Vosman B., Matthes M, Daly A., Brettschneider R., 72 LUẬN VĂN THẠC SĨ 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Bettini P., Jordan S.A., and Humphries P (1994), “Single nucleotide polymorphism in exon of the BCP gene on 7q31-q35”, Human Molecular Genetics, 3, p1915 Joshi K., Chavan P et al (2004), Curr Sci, 87 (2), 159 Kalendar R., Grob T., Regina M., Suoniemi A and Schulman A (1999), “IRAP and REMAP: two new retrotransposon-based DNA fingerprinting techniques”, Theor Appl Genet., 98, p704-711 Karnataka Medicinal Plants Authoriy (2009), Authenticity, puriy of herbal drugs critical for sustained growth in global markets, KMPA chief Kassier W.J et al (1991), “The use of medicinal herbs by human immunodeficiency virus-infected patients”, Arch Intern Med, 151, 22812288 Kiem P.V., Minh C.V., Cai X.F., Lee J.J., Kim Y.H (2003), “A new-24-norLupane-Glycoside of Acanthopanax trifoliatus”, Arch Pharm Res., 26(9), 706-708 Kiem P.V., Minh C.V., Dat N.T., Cai X.F., Lee J.J., Kim Y.H (2003), “Two new Phenyl propanoid glycosides from the stem bark of Acanthopanax trifoliatus”, Arch Pharm Res., 26(12), 1014-1017 Kim C.H., Sun B.Y (2000), “New Taxa and Combinations in Eleutherococcus (Araliaceae) from Eastern Asia”, Novon, 10(3), 209-214 Kim, I.T, et al., (2005) "In-vitro and in-vivo anti-inflammatory and antinociceptive effects of the methanol extract of the roots of Morinda", J Pharm Pharmacol 57(5):607-15 Kumar P (2009), “Potential of molecular markers in Plant biotechnology”, Plant Omics Journal, (4), p141-162 Landergren U et al (1988), “DNA diagnostics Molecular technigues andautomation”, Science, 241, 1077-1080 Li S et al (2008), Chin Med, 3, Li Z.Y., Zhu G (2005), “(1669) Proposal to conserve the name Acanthopanax against Eleutherococcus (Araliaceae)”, Taxon, 54(1), 194-195 Li, Y.F., Yuan, L., Xu, Y.K., Yang, M., Zhao, Y.M., Luo, Z.P (2001) "Antistress effevt of oligosaccharide extracted from Morinda officinalis in mice and rats", Acta Pharmacol Sin., 22(12): 1084-8 Lipp F.J (1996), “The efficacy, history and politics of medicinal plants”, Alternative Therapy and Health Medicine, 2, 36-41 Maheswaran M (2004), “Molecular markers: history, features, and application”, Advanced Biotech, p17-24 73 LUẬN VĂN THẠC SĨ 54 Mazzanti G et al (2008), Food Chem Toxicol, 46, 3043 55 Morgante M and Vogel J (1994), “Compound micro satellite primers for the detection of genetic polymorphisms”, U S Patent Appl., 08/326456 Mukherjee PK (2006), Ethnopharmacology, 103, 25 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 Muskesh Kumar Chaubey (2008), “Funmigant toxicity of essential oils from some common spices against Pulse Beetle”, Callosobruchus chenensis (Coleoptera: Bruchiae), J Oleo Sci., 57(3), pp: 171 - 179 National institute of materia medica Hanoi - Vietnam, Selected medicinal plants in Vietnam, Hanoi, Vol I, 12-17 Nazma Inamdar et al (2008), “Herbal drugs in milieu of modern drugs”, International Journal of Green Pharmacy, vol (1), p 1-8 Nguyen T.T., Matsumoto K., Yamasaki K., Nguyen MD., Nguyen TN., Watanabe H (1996), “Effects of majonoside-R2 on pentobarbital sleep and gastric lesion in psychologically stressed mice”, Pharmacol Biochem Behav., 53(4), pp 957 – 963 Niharika Sahoo et al (2010), “Herbal drugs: Standards and Regulation”, Fitoterapia, 81, pp 462-471 Orita M., Suzuki, Y., Sekiya T and Hayashi K (1989), “Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using polymerase chain reaction”, Genomics, 5, p874-879 Paran I and Michelmore RW (1993), “Development of reliable PCR-based markers linked to downy mildew resistance genes in lettuce”, Theor Appl.Genet, 85, p985-993 Park S.Y., Yook C.S., Nohara T., Mizutani T., Tanaka T (2004), “Random Amplified Polymorphic DNA Analysis of Genetic Relationships Among Acanthopanax Species”, Arch Pharm Res., 27(12), 1270-1274 Phuong N.T., Lee k A., Jeong S J., Fu C X., Choi J K., Kim Y H., J S Kang (2006), “Capillary electrophoretic method for the determination of diterpenoid isomer in Acanthopanax species”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, 56-61 Phuong N.T., Lee K.A., Jeong S.J., Fu C.X., Choi J.K., Kim Y.H., J.S Kang (2006), “Capillary electrophoretic method for the determination of diterpenoid isomer in Acanthopanax species”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 40, 56-61 Rao J.K et al (1999), “Use of complementary therapies for arthritis among patients of rheumatologist”, Ann Intern Med, 131, 409-416 74 LUẬN VĂN THẠC SĨ 68 Rates S.M.K (2001), Toxicon, 39, 603 69 Rohde W (1996), “Inverse sequence-tagged repeat (ISTR) analysis, a novel and universal PCR-based technique for genome analysis in the plant and animal kingdom”, Journal of Genetics Breed, 50, p249-261 Rohlf F.J., 2000 NTSys-PC numerical taxonomy and multivariable analysis system.Exeter software Applied Biostatistics Ins., New York Saiki R.K et al (1986), “Analysis of enzymatically amplified beta-globin and HLA-DQ alpha DNA with allele-specific oligonucleotide probes”, Nature, 324, p163-6 Saper R.B et al (2008), JAMA, 300(8), 915 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 Saxena P.K., Cole I.B., Murch S.J (2007), “Approaches to quality plant based medicine: signficance of chemical profiling”, Applications of Plant Metabolic Engineering, p311 Schierwater B., Ender A (1993), “Different thermostable DNA polymerases may amplify different RAPD products”, Nucleic Acids Research, 21, 46474648 Shan B E., Yoshita Y., Sugiura T., Yamashita U (1999), “Suppressive effect of Chinese medicinal herb, Acanthopanax gracilistylus, extract on human lymphocytes in vitro”, Clin Exp Immunol., 118(1), 41-48 Sharma M et al (2008), “Molecular markers: new prospects in plant genome analysis”, Pharmacognosy Review, 2(3), p23-34 Shasany A.K., Kukreja A.K., Saikia D., Darokar M.P., Khanuja S.P.S and Kumar S (1999) "Assessment of diversity among Taxus wallichiana accessions from North East India using RAPD analysis" Plant Genetic Resources Newsletter,121: 27-31 Soon Y.Y., Tan B.K (2002), "Evaluation of the hypoglycemic and antioxidant activitives of the Morinda officinalis in streptozotocin-induced diabetic rats " Singapore Med J., 43(2): 77-85 Stewart K.M (2003), Ethnopharmacology, 89, Strader D.B et al (2002), “Use of complementary and alternative medicine in patients with liver disease”, Am J Gastroenterol, 97, 2391-2397 Suhhanshu Tiwari (2008), “Plants: A Rich Source of Herbal Medicine”, IJournal of Natural Products, 1, pp 27 - 35 Telenius H., Carter N.P., Bebb C.E., Nordenskjold M., Ponder B.J., TunnacliffebA (1992), “Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer”, Genomics, 13, 75 LUẬN VĂN THẠC SĨ p718-725 83 93 Thomas A Mc, Donald et al (1999), Evidence on the carcinogeneicity of estragole, Reproductive and Cancer Hazard Assesment Section Tran Q.L., Adnyana I.K., Tezuka Y., Harimaya Y., Saiki I., Kurashige Y., Tran Q.K., Kadota S (2002), “Hepatoprotective effect of majonoside-R2, the major saponin from Vietnamese ginseng (Panax vietnamensis)”, Planta Medica, 68(5), pp 402 – 406 Vos P., Hogers R., Bleeker M., Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M and Zabeau M (1995), “AFLP: A new technique for finger printing”, Nucleic Acids Res., 23, p4407-4414 Wang D.Q., Fan J., Feng S.B., Li S.R., Wang X.B., Yang C.R., Zhou J (1989a), “Studies on saponins from the leaves of Panax japonicus var bipinnatifidus (Seem.) Wu et Feng”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 593 – 599 Wang D.Q., Feng B.S., Wang X.B., Yang C.R., Zhou J (1989b), “Further study on dammarane saponins of leaves of Panax japonicus var major collected in Quinling Mountains China”, Yao Xue Xue Bao, 24(8), pp 633 – 636 Waumans D., Brunnel N., Tytagat J (2004), Anise oil as a precusor for 2Alkoxy-5-methoxybenzadehydes, Microgram Journal, 2(1-4), - 10 Welsh J and McClelland M (1990), “Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers”, Nucleic Acids Res 18, p7213-7218 Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalsk J.A and Tingey S.V (1990), “DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers”, Nucleic Acid Research, 18, p6531-6535 World Health Organization (1978), The Declaration of Alma-Ata, WHO express World Health Organization (2007), WHO guidelines for assessing quality of herbal medicines with reference to contaminants and residues WHO express World Health Organization (2008), Traditional medicine, WHO express 94 Xue J., Hao L., Peng F (2008), Chemosphere, 71, 1051 95 Zietkiewicz E., Rafalski A and Labuda D (1994), “Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification”, Genomics, 20: 176-183 Ziming Wang, Lu Wang, Tiechun Li, Xin Zhou, Lan Ding, Young Yu, Aimin Yu, Hanqi Zhang (2006), “Rapid analysis of the essential oils from dried Illicum verum Hook.f and Zingiber officinale Rosc By improved solvent- 84 85 86 87 88 89 90 91 92 96 76 LUẬN VĂN THẠC SĨ 97 free microwave extraction with three types of microwave-absorption medium”, Anal Bioanal Chem, 386, 1863-1868 Yap K.Y., Chan S.Y., Lim C.S (2008), Food Chem, 107, 570 77 PHỤ LỤC Phụ lục Thành phần dung dịch sử dụng phản ứng tách chiết ADN tổng số Dung dịch CTAB 2% 10 ml Nước cất (dH2O) 3,2 ml 0,5 M Tris-HCl pH8 ml M NaCl 2,8 ml 0,1 M EDTA ml 14,3 M β-mercaptoethanol 28 µl CTAB 0,2 g Dung dịch Wash I 10 ml 100% ethanol 7,6 ml NaOAc 0,272 g Nước cất (dH2O) 2,4 ml Dung dịch Wash II 10 ml 100% ethanol ml Nước cất ml Dung dịch đệm TE 10 ml Nước cất (dH2O) 9,7 ml 0,5 M Tris-HCl pH8 0,2 ml 0,1 M EDTA 0,1 ml Phụ lục Bảng hệ số tương đồng di truyền mẫu thuộc hai lồi thuốc Ngũ gia bì gai (G) Ngũ gia bì hương (H) thu thập nghiên cứu sở phân tích thị RAPD-PCR Nguồn gốc đặc điểm mẫu trình bày bảng Phụ lục Bảng hệ số tương đồng di truyền mẫu thuộc loài thuốc hồi hương nghiên cứu sở phân tích thị RAPD-PCR Nguồn gốc đặc điểm mẫu trình bày bảng mẫu trình bày bảng Phụ lục Bảng hệ số tương đồng di truyền mẫu quần thể thuộc lồi Ba kích Nguồn gốc đặc điểm Phụ lục Bảng hệ số tương đồng di truyền mẫu quần thể thuộc ba loài thuốc sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp Tam thất hoang thu thập Việt Nam Nguồn gốc đặc điểm mẫu trình bày bảng Phụ lục Sản phẩm điện di băng đồng hình băng đặc trưng phân biệt hai loài ngũ gia bì gai ngũ gia bì hương với mồi OPA15 Băng OPA151000 đặc trưng cho A trifoliatus, hai băng OPA151500 OPA15850 đặc trưng cho A gracilistylus Băng chung cho tất mẫu OPA15600 M thang ADN chuẩn Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu bảng 600 bp Phụ lục Băng đặc trưng phân biệt (được hình mũi tên) ngũ gia bì hương với mồi OPA4 M thang ADN chuẩn Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu bảng Phụ lục Hình ảnh số băng đồng hình mồi OPA6, M - thang ADN chuẩn, băng chung cho tất mẫu hồi 500 bp; băng mang tính đặc hiệu cho lồi hồi hương 1300 bp Phụ lục Hình ảnh số băng đồng hình mồi OPC4, M - thang ADN chuẩn, băng chung cho tất mẫu hồi 300 bp; băng mang tính đặc hiệu cho loài hồi hương 1100 bp Phụ lục 10 Hình ảnh số băng đồng hình mồi OPA14, M - thang ADN chuẩn, băng chung cho tất mẫu hồi 1050 400 bp Phụ lục 11 Hình ảnh điện di mồi OPC10, với M - thang ADN chuẩn; băng chung cho tất mẫu hồi có kích thước 1600 bp; băng đặc hiệu lồi hồi hương có kích thước 1600 bp Phụ lục 12 Hình ảnh số băng đồng hình từ kết điện di mẫu ba kích với mồi OPA15 Nguồn gốc đặc điểm mẫu nêu bảng