đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật and mã vạch

i ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2012 ii ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Đinh Đoàn Long Hà Nội – 2012 iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. Chi Codonopsis 4 1.1.1. Phân loại học 4 1.1.2. Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố 4 1.1.3. Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền…………… 8 1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) 11 1.3. Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 13 1.3.1. Mã vạch ADN ở động vật 13 1.3.2. Mã vạch ADN ở thực vật 14 1.4. Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật 19 1.4.1. Ứng dụng ở thực vật nói chung 19 1.4.2. Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu 24 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32 2.1. Vật liệu nghiên cứu 32 2.1.1. Vật liệu thực vật 32 2.1.2. Hóa chất 32 2.1.3. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33 2.1.4. Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 33 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số 33 2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 34 2.2.3. Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 35 2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự 36 2.2.5. Phương pháp phân tích số liệu 37 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38 3.1. Tách chiết ADN tổng số 38 iv 3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 39 3.3. Phân tích kết quả 40 3.3.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu 41 3.3.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 v DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN như một công cụ nhận diện [25] 21 Bảng 2. Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong giai đoạn dự kiến năm 2011 [30] 23 Bảng 3. Những cặp mồi được sử dụng thông dụng trong việc khuyếch đại và giải trình tự các mã vạch ADN 26 Bảng 4. Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu 32 Bảng 5. Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu 33 Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR 35 Bảng 7. Chu trình nhiệt cho gen ITS 35 Bảng 8. Chu trình nhiệt cho gen matK 35 Bảng 9. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu 39 Bảng 10. Bảng thống kê các điểm sai khác trong trình tự ADN giữa các loài Codonopsis trên vùng gen ITS 45 Bảng 11. Tỷ lệ % nhận diện của gen ITS (nửa trên đường chéo) và số khác biệt (nửa dưới đường chéo) của 21 mẫu Codonopsis 50 Bảng 12. Bảng thống kê các điểm đa hình trong trình tự gen matK giữa các loài Codonopsis nghiên cứu 53 Bảng 13. Tỷ lệ phần trăm nhận diện của gen matK (nửa trên đường chéo) và số khác biệt giữa các loài (nửa dưới đường chéo) của 16 mẫu Codonopsis 56 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Loài Codonopsis pilosula 5 Hình 2. Hoa của loài C. javanica 6 Hình 3. Codonopsis tangsheng 7 Hình 4. Hoa của các loài (a) C. nervosa (b) C.lanceolata (c) C. ussuriensis 7 Hình 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 1kb … 38 Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 100bp 40 Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1% 40 Hình 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 58 Hình 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 59 Hình 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10 6 thế hệ……… 60 Hình 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x10 6 thế hệ…………………………………………………………………………………… 61 vii BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic Bp Base pair Cặp bazơ nitơ dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotit triphosphat EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Axit ethylene diamine tetraacetic Kb Kilobase (= 1000 bp) 1000 cặp bazơ MP Maximum Parsimony Thuật toán tiết kiệm tối đa OD Optical density Mật độ quang học PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối mtDNA mitochondrial DNA ADN ty thể IGS intergenic spacer vùng liên gen 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng. Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo. Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc. Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được 3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc. Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng. Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu. Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm. Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay. Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể. Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh tế - xã hội. Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau. Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8], [47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất là các loài gần gũi với con người [58]. Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73]. Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô 2 tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng. Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị. Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật. Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên gia về hình thái dược liệu. Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế. Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62]. Công việc này nối tiếp các thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13]. Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các nghiên cứu về ADN. Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66]. Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc. ADN nhân và lạp thể được khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu loài. “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73]. Dẫu trình tự 3 đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen. Việc phát hiện ra các mã vạch ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung. Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN”. Đề tài góp phần xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK. [...]... rRNA của 4 loài Bình vôi ở Việt Nam [3] Nguyễn Đức Thành và cộng sự đã sử dụng một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ một số loài cây lâm nghiệp, trong đó có một số loài bị đe dọa [7] Những kết quả nghiên cứu trên chỉ ra rằng mã vạch ADN là công cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và bằng cách so sánh mã vạch ADN ở một vài sinh vật khác với các mã vạch đã được... đích chính: 1 Đánh giá tính đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis được thu thập tại Việt Nam 2 Xác định các mã vạch có khả năng phân biệt, nhận dạng được các loài thuộc chi Codonopsis, cùng với chỉ thị hình thái, trở thành công cụ ứng dụng hữu hiệu trong kiểm định dược liệu 3 Góp phần bảo tồn nguồn gen của loài cây thuốc quý hiếm đang được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam 1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA... Trung Quốc Mã vạch ADN miêu tả cho tất cả các loài Vườn thực vật New York thực vật hạt kín Mã vạch ADN của trung tâm những mảnh Viện Smithsonian rừng nhiệt đới Mã vạch ADN cho thực vật dược liệu Viện phát triển thực vật dược liệu Trung Quốc Beijing Mã vạch ADN cho hệ thực vật xứ Wales Vườn thực vật quốc gia của Wales Mã vạch ADN cho ngành rêu ở Anh Vườn thực vật hoàng gia Edinburgh Việc thành lập một thư... xác định “nhóm loài hơn là loài Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng, thậm 19 chí là một mã vạch ADN với khả năng phân biệt tương đối khiêm tốn cũng có thể hữu ích Tình huống cụ thể bao gồm: (1) nghiên cứu vùng địa lý nhằm đánh giá sự đa dạng tại một vùng hoặc một khu vực, nơi mà nhiều trong số những mẫu nghiên cứu không nhất thiết phải có mối quan hệ chặt chẽ với nhau (2) với các loài có giá trị thương... psbA+nrITS Nhận di n những cây nrITS, trnH-psbA, rbcL, trnH-psbA đã được đánh giá con trên một mảng rừng matK (và những vùng là vùng biều hiện tốt nhất nhiệt đới [27] khác) Nhận di n các cây thảo trnH-psbA dược Trung Quốc họ Polygonaceae [70] Nhận di n các cây thảo nrITS2, matK dược Trung Quốc họ Fabaceae [25] [24] Nhận di n loài trnH-psbA Phyllanthus trong thuốc thảo dược [71] Nhận dạng loài Actaea MatK... Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm .Một số loài Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có: - Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula):... một cách tiếp cận kiểu gien SNP dựa trên ADN mã vạch gen matK để phân biệt giữa các sản phẩm gỗ của 22 Ramin (Gonostylus) -loài được CITES bảo vệ, với các loài không cùng họ hoặc loài có cấu trúc giải phẫu tương tự nhưng quan hệ xa- không được bảo vệ bởi CITES Bảng 2 Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong giai đoạn dự kiến năm 2011 [31] Cơ quan nghiên cứu Dự án Cây BOL: mã vạch. .. các loài thực vật bị xác định nhầm trong thảo dược bổ sung [46] Hơn 1/4 thảo dược thương mại có sẵn của Black Cohosh được kiểm tra và phát hiện không chứa loài Actea raceomosa Bắc Mỹ, mà thay vào đó là loài Actea Châu Á Một ứng dụng khác đang nổi lên của mã vạch ADN ở thực vật là việc xác định các loài được bảo vệ trong thương mại 20 Bảng 1 Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN nhƣ một. .. vạch ADN nhƣ một công cụ nhận di n [25] Ứng dụng Dấu chuẩn mã vạch sử Ghi chú dụng Nhận dạng những loài MatK lan ẩn danh [48] Nhận dạng những loài RbcL Conocephalum (rêu) ẩn danh [61] Nhận di n những loài nrITS, trnL-F, trnH-psbA, trnH-psbA đã được đánh giá Taxus ẩn danh [56] như vùng biểu hiện tốt nhất matK, rbcL Nhận di n những loài rcbL+matK+trnH- matK và nrITS đánh giá là Herbertus (rêu) ẩn danh... soạn trong thư viện thông tin có thể giúp nhận di n loài, loài mới hoặc các loài quý hiếm 1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu Cây thuốc là nguồn gốc của một số lượng lớn các loại thuốc thiết yếu trong y học phương Tây và là cơ sở của thuốc thảo dược, đó không chỉ là nguồn chính chăm sóc sức khỏe cho hầu hết dân số thế giới ở các nước đang phát triển mà còn ngày càng phổ biến ở các . Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60 42 70 . Nguyễn Thị Thanh Nga ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƢỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM (Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA. đích chính: 1. Đánh giá tính đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis được thu thập tại Việt Nam. 2. Xác định các mã vạch có khả năng phân biệt, nhận dạng được các loài thuộc chi Codonopsis,