đánh giá đa dạng di truyền một số loài cây dược liệu việt nam thuộc chỉ đảng sâm (codonopsis sp) bằng kỹ thuật and mã vạch

Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng kỹ thuật gọi là mã vạch ADN DNA barcode thô

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thanh Nga

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM

(Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

Nguyễn Thị Thanh Nga

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU VIỆT NAM THUỘC CHI ĐẢNG SÂM

(Codonopsis sp.) BẰNG KỸ THUẬT ADN MÃ VẠCH

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60 42 70

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Đoàn Long

Hà Nội – 2012

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Chi Codonopsis 4

1.1.1 Phân loại học 4

1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố 4

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền……… 8

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode) 11

1.3 Một số mã vạch ADN được sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu 13

1.3.1 Mã vạch ADN ở động vật 13

1.3.2 Mã vạch ADN ở thực vật 14

1.4 Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật 19

1.4.1 Ứng dụng ở thực vật nói chung 19

1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dược liệu 24

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 32

2.1 Vật liệu nghiên cứu 32

2.1.1 Vật liệu thực vật 32

2.1.2 Hóa chất 32

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33

2.1.4 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu 33

2.2 Phương pháp nghiên cứu 33

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số 33

2.2.2 Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết 34

2.2.3 Phương pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR 35

2.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự 36

2.2.5 Phương pháp phân tích số liệu 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.2 Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR 39

3.3 Phân tích kết quả 40

3.3.1 Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu 41

3.3.2 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1 Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN như một công cụ

nhận diện [25] 21

Bảng 2 Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong giai đoạn dự kiến năm 2011 [30] 23

Bảng 3 Những cặp mồi được sử dụng thông dụng trong việc khuyếch đại và giải trình tự các mã vạch ADN 26

Bảng 4 Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu 32

Bảng 5 Các cặp mồi sử dựng trong nghiên cứu 33

Bảng 6 Thành phần của phản ứng PCR 35

Bảng 7 Chu trình nhiệt cho gen ITS 35

Bảng 8 Chu trình nhiệt cho gen matK 35

Bảng 9 Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu 39

Bảng 10 Bảng thống kê các điểm sai khác trong trình tự ADN giữa các loài Codonopsis trên vùng gen ITS 45

Bảng 11 Tỷ lệ % nhận diện của gen ITS (nửa trên đường chéo) và số khác biệt (nửa dưới đường chéo) của 21 mẫu Codonopsis 50

Bảng 12 Bảng thống kê các điểm đa hình trong trình tự gen matK giữa các loài Codonopsis nghiên cứu 53

Bảng 13 Tỷ lệ phần trăm nhận diện của gen matK (nửa trên đường chéo) và số khác biệt giữa các loài (nửa dưới đường chéo) của 16 mẫu Codonopsis 56

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Loài Codonopsis pilosula 5

Hình 2 Hoa của loài C javanica 6

Hình 3 Codonopsis tangsheng 7

Hình 4 Hoa của các loài (a) C nervosa (b) C.lanceolata (c) C ussuriensis 7

Hình 5 Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 1kb … 38

Hình 6 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 100bp 40

Hình 7 Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis trên gel agarose 1% 40

Hình 8 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 58

Hình 9 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp MP chạy trên khung đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93 59

Hình 10 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ……… 60

Hình 11 Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế

hệ……… 61

BẢNG CÁC TỪ VIẾT TẮT

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Anh Nghĩa tiếng Việt

ADN Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic

dNTP Deoxyribonucleotide triphosphate Deoxyribonucleotit triphosphat EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic

Acid

Axit ethylene diamine tetraacetic

MP Maximum Parsimony Thuật toán tiết kiệm tối đa

PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi polymerase Rcf relative centrifugal force Lực ly tâm tương đối

IGS intergenic spacer vùng liên gen

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nóng và ẩm nên có nguồn tài nguyên thực vật phong phú và đa dạng Theo thống kê sơ bộ, ở Việt Nam hiện đã biết khoảng 10.350 loài thực vật bậc cao có mạch, khoảng 800 loài Rêu, 600 loài Nấm và hơn 2000 loài Tảo Trong đó có nhiều loài được dùng làm thuốc Theo kết quả điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), tính đến năm 2005 đã ghi nhận được

3948 loài thực vật và nấm lớn; 52 loài tảo biển, 408 loài động vật và 75 loại khoáng vật có công dụng làm thuốc Trong tổng số 3948 loài cây thuốc, gần 90 % là các cây mọc tự nhiên, tập tung chủ yếu ở các quần xã rừng, chỉ có gần 10 % là các cây thuốc trồng Bộ Y tế cũng đã thống kê, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30 - 50 tấn dược liệu khác nhau để dùng trong y học cổ truyền hoặc làm nguyên liệu cho công nghiệp dược và xuất khẩu Trong số đó, trên 2/3 được khai thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên hoặc trồng trọt trong nước Riêng từ nguồn cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới hơn 20.000 tấn mỗi năm Khối lượng dược liệu này trên thực tế mới chỉ bao gồm từ hơn 200 loài được khai thác và đưa vào thương mại có tính phổ biến hiện nay Bên cạnh đó, còn nhiều loài dược liệu khác vẫn được thu hái, sử dụng tại chỗ trong cộng đồng và hiện chưa có những con số thống kê cụ thể Những số liệu này cho thấy nguồn dược liệu ở nước ta rất phong phú và đa dạng, việc sử dụng dược liệu làm thuốc đã có từ lâu đời và rất phổ biến, có vai trò quan trọng trong nền kinh

tế - xã hội Vấn đề đặt ra là làm sao xác định chính xác các loài thực vật được dùng làm thuốc để tránh nhầm lẫn với những loài khác? Đặc biệt giữa các loài có đặc điểm hình thái tương tự nhau

Trên thế giới, thực vật cũng được sử dụng làm thuốc ngay từ thời tiền sử [8], [47], và được ghi nhận sử dụng trong điều trị nhiều bệnh khác nhau, phổ biến nhất

là các loài gần gũi với con người [58] Trong y học cổ truyền các nước, nhìn chung các nguồn dược liệu, các hợp chất bổ sung và các loại thuốc thảo dược thường được xác định ở cấp độ loài qua tên khoa học (tên La tinh) của chúng, và đây là đơn vị cơ bản cho việc chuẩn bị của các công thức thảo dược [73] Dược điển quốc gia Trung Quốc quy định ngành công nghiệp dược phẩm và các nhà quản lý luôn bắt đầu mô

tả các loại thuốc thảo dược bằng cách xác định tên các loài thực vật được sử dụng Thật không may, dược liệu thay thế hoặc được làm giả do cố ý (ví dụ vì lý do lợi nhuận) hoặc vô ý (chẳng hạn do sai sót khi ghi chép hoặc thiếu kiến thức) xuất hiện không hiếm trong thực tế và có thể gây nguy cơ nghiêm trọng trong việc sử dụng các thuốc thảo mộc để trong điều trị và hỗ trợ điều trị

Trong công tác kiểm nghiệm dược liệu hiện nay, phương pháp được dùng chủ yếu dựa trên phân tích hình thái vĩ mô (quan sát bằng mắt) và vi mô (quan sát tiêu bản hiển vi) của mẫu vật Công việc này thường được thực hiện bởi một chuyên gia về hình thái dược liệu Tuy vậy, phương pháp hình thái học gặp trở ngại sau khi các nguyên liệu thực vật đã qua xử lý hoặc sơ chế Vì vậy, các phương pháp bổ sung giúp xác định chính xác các loài cây thuốc dựa trên hệ gen (ADN) đặc thù của chúng đã được phát triển vào cuối những năm 1990 [62] Công việc này nối tiếp các thành tựu về ứng dụng các kỹ thuật phân tích DNA trong nghiên cứu hệ thống học thực vật được bắt đầu khoảng mười năm trước đó [20] kể từ sự phát minh phản ứng chuỗi trùng hợp - PCR [13] Phương pháp PCR và sau này là sự phát triển của kỹ thuật giải trình tự ADN tự động đã tạo bước ngoặt có tính cách mạng trong các nghiên cứu về ADN Trong thực tế, các nhà phân loại học phân tử hiện nay đang hình dung ra danh mục tất cả các loài sinh vật sống trên trái đất bằng cách sử dụng

kỹ thuật gọi là mã vạch ADN (DNA barcode) thông qua việc xác định được các trình tự DNA ngắn đặc trưng của chúng và dùng chúng như “mã vạch” để nhận biết các mẫu sinh học kể cả khi chúng đã được sơ chế hoặc bảo quản lâu dài [29], [66]

Theo nguyên lý đó, các phương pháp định danh dựa trên ADN cũng đã được phát triển cho việc nhận dạng các loài cây thuốc ADN nhân và lạp thể được khuyếch đại (nhân bội) bằng PCR và các sản phẩm PCR sau đó được phân tích bằng điện di gel, được giải trình tự hoặc được lai với các đầu dò (DNA probe) đặc hiệu loài “Dấu vân tay” (fingerprinting) của hệ gen có thể giúp phân biệt từng cá thể trong loài, giữa các loài hoặc thậm chí giữa các quần thể trong cùng loài; điều này rất hữu ích cho việc đồng nhất hóa (tiêu chuẩn hóa) dược liệu và khả năng phát hiện các giả mẫu (tạp mẫu hay mẫu dễ nhầm lần về hình thái/hóa học) [73] Dẫu trình tự

đơn gen nhân hay gen lạp thể đã được coi là hữu ích cho sự định loài, thì các nghiên tiến hóa hoặc phân loại các loài vẫn thường yêu cầu phân tích các dữ liệu về ADN

từ nhiều hơn một gen hoặc một số locut của bộ gen Việc phát hiện ra các mã vạch ADN ở các loài cây thuốc sẽ có giá trị bổ sung cho các nghiên cứu tiêu chuẩn hóa

và kiểm định dược liệu nói riêng, và đóng góp vào nỗ lực xác định mã vạch cho tất

cả các loài sinh vật trên trái đất nói chung

Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Đánh giá tính đa dạng di truyền

một số loài Codonopsis ở Việt Nam bằng kỹ thuật mã vạch ADN” Đề tài góp phần

xác định các mã vạch có thể phân biệt được các loài thuộc chi Codonopsis bằng cách kết hợp giữa phương pháp phân loại hình thái truyền thống với phương pháp

phân tích trình tự ADN của một gen mã vạch như ITS, matK, trnK

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chi Codonopsis

Chi Codonopsis có tên thường gọi ở Việt Nam là Đảng Sâm Đây là chi thực vật

hai lá mầm, thuộc họ Hoa chuông, với cấu tạo hoa đặc trưng dạng hình chuông Chi

này gồm khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu ở vùng Trung và Đông Á Codonopsis được

coi là Nhân sâm của người nghèo vì theo y học cổ truyền, nó có nhiều công dụng giống Nhân sâm nhưng lại sẵn và rẻ tiền hơn, thường được dùng thay thế Nhân sâm [75]

1.1.1 Phân loại học

Chi Codonopsis có đặc điểm phân loại học như sau:

 Liên giới: Eukaryota (Sinh vật nhân thực)

 Giới: Plantae (Thực vật)

 Phân giới: Viridaeplantae (Thực vật xanh)

 Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có hoa; Mộc lan; Hạt kín)

1.1.2 Sơ lược đặc điểm hình thái và phân bố

Chi Codonopsis gồm những cây dạng cây cỏ, sống lâu năm, leo bằng thân

quấn Rễ hình trụ dài, đường kính có thể đạt 1,5 – 2 cm, phân nhánh, đầu rễ phình to

có nhiều vết sẹo lồi, thường chỉ có một rễ trụ mà không có rễ nhánh, càng nhỏ về phía đuôi, lúc tươi màu trắng, sau khi khô thì rễ có màu vàng sẫm, có nếp nhăn [1] Thân mọc thành từng cụm vào mùa xuân, bò trên mặt đất hay leo vào cây khác, thân màu tím sẫm, có lông thưa, phần ngọn không lông Lá mọc cách hình trứng hay hình trứng tròn, đuôi lá nhọn, phần gần cuống hình tim, mép nguyên, màu

xanh hơi pha vàng, mặt trên có lông nhung, mặt dưới mầu trắng xám nhẵn hoặc có lông rải rác, dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm

Hình 1 Hình thái loài Codonopsis pilosula

Hoa màu xanh nhạt, mọc riêng lẻ ở kẽ nách lá, có cuống dài 2-6cm, đài tràng hình chuông, gồm 5 phiến hẹp, 5 cánh có vân màu tím ở họng, lúc sắp rụng trở thành màu vàng nhạt, chia làm 5 thùy, nhụy 5, chỉ nhụy hơi dẹt, bao phấn đính gốc Quả bổ đôi, hình chùy tròn, 3 tâm bì, đầu hơi bằng, có đài ngắn, lúc chín thì nứt ra

Có nhiều hạt màu nâu nhẵn bóng

Trên thế giới, chi Codonopsis có khoảng 60 loài, phân bố chủ yếu từ

Hymalaya đến Nhật bản, trong đó có ít nhất 39 loài đã được tìm thấy ở Đài Loan và Trung Quốc đại lục [75], Châu Á có khoảng 11 loài, Việt Nam có 2 loài đã được mô

tả và dùng làm thuốc với tên gọi chung trong dân gian là Đảng sâm.Một số loài

Codonopsis được dùng trong y học cổ truyền các nước có thể kể đến gồm có:

- Đảng sâm leo (Codonopsis pilosula): còn gọi là Rầy cấy, Mần cấy; cây này

chưa được mô tả trong tập Flore générale de l‟Indochine, đây là cây thảo lâu năm, thân mọc bò hay leo Rễ hình trụ dài, đường kính có thể tới 1-1,7cm Lá mọc đối có

khi mọc cách hay hơi vòng Hoa (Hình 1) mọc đơn độc ở nách lá Đài 5, Tràng hình

chuông màu vàng nhạt, chia 5 thùy, nhị 5 Bầu 5 ô, quả nang, phía trên có một núm nhỏ hình nón, khi chín có màu tím đỏ Ra hoa vào tháng 7 tháng 8, có quả vào tháng

9 tháng 10 Cây mọc tự nhiên ở những vùng rừng ẩm thấp miền núi đông bắc và tây bắc (như Lạng sơn, Cao bằng và khu Tây Bắc); người ta thu hái về bán với tên gọi

là Phòng đảng sâm

- Đảng sâm, Kim tiền báo, Thổ đảng

sâm (Codonopsis javanica (Blume) Hook.f.)

còn có tên là cây Đùi gà, Mằn rày cáy (Tày),

Cang hô (Mèo); đó là cây cỏ lâu năm, thân

leo Rễ hình trụ, phân nhánh, lá mọc đối, ít

khi mọc so le hình tim, nhẵn hoặc có ít lông,

đầu lá nhọn, mép lá nguyên hoặc có khía

răng nhỏ, bấm vào lá có nhựa mủ Phiến lá

dài 3 – 8 cm, rộng 2 – 4 cm Hoa (Hình 2)

mọc riêng rẽ ở kẽ lá, hình chuông màu trắng

hoặc hơi vàng, họng có vân tím

Hình 2 Hoa của loài C javanica

Đài 5, tràng 5 cánh, nhị 5 Quả nang, màu tím, chứa nhiều hạt hình trái xoan, màu vàng bóng Cây mọc hoang ở vùng núi cao, chỗ ẩm mát, nhiều mùn Có nhiều

ở Hoàng Liên Sơn,Sơn La, Lai Châu, Yên Bái, Tuyên Quang, còn ở Cao Bằng, Lạng Sơn thì ít hơn, ở các tỉnh phía nam chỉ thấy ở cao nguyên Langbian (Lâm Đồng), xung quanh chân núi Ngọc Linh (Đắc Giây-Kon Tum và Quảng Nam- Đà

Nẵng) Ở miền núi, người dân tộc đã trồng xen Codonopsis với ngô, cho kết quả tốt

- Đảng sâm hoa xanh (Codonopsis viridiflora M.xim), ở trên thân có nhiều

lông gai ngắn, đến lúc già thì tự rụng Lá mọc đối hay mọc cách, dài 2 – 3 cm, hai mặt đều có lông gai ngắn, lá nguyên không có răng cưa, cuống lá tương đối ngắn, Hoa mọc đơn trên ngọn, tràng hình chuông, dài khoảng 1 cm màu xanh vàng, trong

có nếp nhăn ngắn Loài này mới chỉ tìm thấy ở khu tự trị A-pa tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc

- Đảng sâm hoa ống (Codonopsis tubulosa Kom) cây thảo thân leo bò Thân lá

đều có lông dài, lá hẹp dài hình bầu dục, 3-8cm, đuôi lá có răng thưa Cánh hoa sâu,

dài bằng nửa ống hoa, tràng hình ống, dài độ 3cm, phân bố ở khu Tây Sương tỉnh

Tứ Xuyên, Trung Quốc

- Xuyên đảng sâm (Codonopsis

tangshen Oliv); hình thái cơ bản giống loài

C pilosula (Franch) Nannf nhưng lá hình

trứng hay hình trứng đuôi nhọn, mặt lá

không có lông, chỉ rìa lá có lông nhung

Sau khi ra hoa (Hình 3) thì có quả đuôi

màu trắng tím, trong hoa có sọc nhỏ màu

tím, cuống dài, hình dẹt, to hơn loại trên, ở

chổ núi cao mưa nhiều về mùa thu quả chín

không nứt Có nhiều ở tỉnh Tứ Xuyên,

Trung Quốc

Hình 3 Hoa Codonopsis tangsheng

- Đảng sâm mõm chó (Codonopsis nervosa Nannf), thuộc cây thảo, thân đứng

thẳng, sống nhiều năm Rễ cọc đâm thẳng xuống, trong có lõi gỗ bằng nửa thể tích

củ, cao độ 20cm, nhỏ bé lông thô dày Lá mọc đối, hình trứng dài 1-1,5cm, mép

nguyên, hai mặt đều có lông Hoa (Hình 4a) có tràng hình chuông dài độ 1,5cm,

màu lam nhạt, trong có thới màu tím đậm Có ở khu tự trị dân tộc Tạng A-pa và chuyên khu Tây Sương tỉnh Tứ Xuyên, Trung Quốc

Hình 4 Hoa của các loài (a) Codonopsis nervosa, (b) Codonopsis

lanceolata, và (c) C ussuriensis

Ngoài ra còn có các loài Codonopsis lanceolata Benth et Hook (Hình 4b)

có rễ hình chùy và loài Codonopsis ussuriensis Hemsl (Hình 4c) có rễ hình củ tròn,

thường được trộn lẫn với Codonopsis để bán ở Trung Quốc

Ở Việt Nam, trong thời gian 1961 – 1985, Viện Dược liệu đã phát hiện Đảng

sâm (Codonopsis spp.) tập trung ở 14 tỉnh miền núi phía Bắc; còn ở phía Nam, chỉ

có ở khu vực Tây nguyên Vùng phân bố tập trung nhất là các tỉnh Lai châu, Sơn

La, Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Lạng Sơn, Gia Lai, Kon Tum, Quảng Nam, Đà Nẵng và Lâm Đồng [4], [2]

1.1.3 Thành phần hóa học và giá trị sử dụng của Codonopsis trong y học cổ truyền

Bộ phận chính của Codonopsis được dùng làm thuốc là rễ Vào mùa đông,

lúc cây đã úa vàng, rụng lá hoặc tới đầu xuân năm sau lúc cây chưa đâm chồi nảy

lộc là có thể thu hoạch, lúc này phẩm chất Codonopsis tốt nhất, sản lượng cao; đào

rễ phải dài sâu trên 0,7m, vì rễ rất dài, không làm trầy xát Rửa sạch đất cát, phân loại rễ to nhỏ để riêng, phơi riêng trên gìan từng loại đến lúc nào rễ bẻ không gãy là đạt bó từng bó đem phơi Dựa vào chất lượng của rễ sau khi thu hoạch, người ta

chia ra làm 5 loại sau:

- Tây đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi đều tròn, màu vàng hay xám,

thịt rễ có màu ánh vàng, có vân tròn, đường kính từ 13mm trở lên, không lẫn rễ con

- Đông đảng sâm: khô, nhiều đường, đầu và đuôi tròn với ít nếp nhăn, vỏ màu vàng xám hay nâu xám, thịt màu trắng vàng, thoáng có vân tròn, đường kính từ

10mm trở lên

- Lộ đảng sâm: khô, nhiều đường, mềm, rễ dài, vỏ màu vàng hay màu vàng

xám, thịt màu vàng nâu hay màu vàng, đường kính trên 10mm

- Điều đảng sâm: khô, có chất đường, hình trụ tròn, vỏ khô màu vàng, thịt

màu trắng hay màu vàng trắng, đường kính 12mm trở lên

- Bạch đảng sâm: khô, tương đối cứng, ít đường, hình dạng rễ không thống nhất, vỏ màu vàng xám hay màu trắng vàng, thô mập, đường kính 10mm trở lên

Về thành phần hóa học, trong rễ của Codonopsis đến nay đã tìm thấy

sucrose, glucose, fructose, galactose, arabinose, mannose, xylose, rhamnose, inulin, nhiều loại alcaloid, scutellarein glucoside, CP1 – 4, syringin, N-Hexyl b-D-glucopyranoside, ethyl a-D-fructofuranoide, tangshenoside I, choline

Về nghiên cứu tác dụng dược lý về Codonopsis và các dịch chiết hoặc thành

phần của chúng có thể được tóm lược như sau:

- Tác dụng tăng lực: thực nghiệm cho thấy Codonopsis có tác dụng chống

mỏi mệt và tăng sự thích nghi của súc vật trong môi trường nhiệt độ cao Thí

nghiệm cho thấy dịch chiết xuất thô của Codonopsis có tác dụng làm tăng sự thích ứng của chuột nhắt trong trạng thái thiếu dưỡng khí [5]

- Đối với hệ tiêu hóa: dịch chiết Codonopsis làm tăng trương lực của hồi tràng chuột, nồng độ thuốc tăng lên thì trương lực cũng tăng theo Dịch Codonopsis

có tác dụng đối kháng (đối vận) với serotonin (5-HT) gây co bóp ruột nhưng không

kháng với acetylcholine Codonopsis có tác dụng bảo vệ rõ rệt với 4 mô hình gây

loét bao tử ở súc vật: gây loét do kích thích, gây viêm, gây loét do acid acetic, loét

do thắt môn vị [5]

- Đối với hệ tim mạch: tiêm tĩnh mạch dịch chiết Codonopsis với liều 2g/kg

cho mèo gây mê có tác dụng tăng co bóp tim, tăng lưu lượng máu tới não, chân và

nội tạng Truyền 20-25ml dịch Codonopsis với tỉ lệ 1:1 cho thỏ bị gây choáng do

mất máu, có tác dụng nâng áp, áp lực trung tâm hạ, nhịp tim chậm lại Khi đối chiếu

với các dịch chiết nhân sâm, cam thảo, tác dụng nâng áp của Codonopsis cao hơn Ngoài ra, tác dụng hạ áp của Codonopsis trên súc vật là do tác dụng giãn mạch ngoại vi và tác dụng ức chế adrenalin của thuốc gây nên

- Đối với máu và hệ thống tạo máu: dịch chiết cồn và nước sắc Codonopsis

có tác dụng làm tăng số hồng cầu, làm giảm số bạch cầu trong đó lượng bạch cầu

trung tính tăng còn lượng tế bào lâm ba lại giảm Dịch tiêm Codonopsis làm tăng

nhanh sự đông máu (không có tác dụng tán huyết)[5]

- Đối với điều hòa huyết áp: Tiêm mạch máu dịch Codonopsis 20% (chiết

bằng nước và bằng rượu) cho thỏ và chó đã gây mê đều thấy gây hạ huyết áp, trong

khi các lô đối chứng được tiêm 4,8% glucose và dung dịch sinh lý thì không thấy hạ

huyết áp, do đó hiện tượng hạ huyết áp của dịch Codonopsis có lẽ không liên quan đến thành phần đường của nó Codonopsis còn có tác dụng ức chế hiện tượng cao

huyết áp gây ra do adrenalin [5]

- Đối với đáp ứng miễn dịch của cơ thể: dùng chế phẩm Codonopsis tiêm

bụng, tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch chuột đều có tác dụng làm tăng số lượng thực bào rõ rệt, khả năng thực bào cũng tăng

- Đối với hệ thần kinh trung ương: cho chuột dùng Codonopsis với liều

6-7mcg/kg thấy có tác dụng ức chế

Ngoài ra Codonopsis còn có tác dụng kháng khuẩn Trong mô hình thực nghiệm „in vitro‟, Codonopsis có tác dụng kháng khuẩn ở mức độ khác nhau đối với

não mô cầu khuẩn, trực khuẩn bạch hầu, trực khuẩn đại tràng, tụ cầu khuẩn vàng,

trực khuẩn lao ở người Codonopsis cũng được tìm thấy còn có tác dụng làm hưng

phấn tử cung ở chuột cống, phát triển nội mạc tử cung, gây tăng trương lực cổ tử cung, tiết sữa ở súc vật mẹ cho con bú, nâng cao corticosterone trong huyết tương,

nâng cao đường huyết [75]

Trong Y học cổ truyền Việt Nam, Codonopsis được ghi nhận có tác dụng bổ

trung ích khí, sinh tân, dưỡng huyết Chủ trị chứng huyết hư hoặc khí huyết lưỡng

hư, không có sức, ăn ít, khát, tiêu chảy lâu ngày, thoát giang, trị trung khí suy nhược, ăn uống kém, ỉa chảy do tỳ hư, vàng da do huyết hư, tiêu ra máu, rong kinh, trị thiếu máu mạn, gầy ốm, bệnh bạch huyết, bệnh ở tụy tạng, trị hư lao, nội thương, phát sốt, mồ hôi tự ra, băng huyết, các chứng thai sản [1]

Hiện nay ở Việt Nam, các loài thuộc chi Codonopsis được liệt vào Sách Đỏ

Việt Nam do bị khai thác thường xuyên, liên tục (gần như không có giới hạn), cùng với nạn tàn phá rừng làm nương rẫy (ở Tây Bắc, Tây Nguyên) cũng làm cho vùng phân bố tự nhiên của các loài này bị thu hẹp nhanh chóng Với giá thành rẻ hơn Nhân sâm, lại có nhiều tác dụng giống Nhân Sâm, một số sản phẩm từ Codonopsis được thay thế bởi rễ củ phơi khô của một số loài cây khác có hình thái tương tự như cây Thương lục (Phytolacca acinosa Roxb ) hoặc cây Tục đoạn (Dipsacus

japonicus) do các lợi ích về kinh tế hoặc do nhầm lẫn khi thu hái trong tự nhiên và

phân loại sản phẩm Trong đó nguy hiểm nhất là sự nhầm lẫn với cây Thương lục, bởi đây là loài cây có độc ở tất cả các bộ phận, các tài liệu [1] [4] [5] đều có ghi chú

về sự nhầm lẫn chết người này Trong sách Trồng hái và dùng cây thuốc của Lê Trần Đức, NXB Nông nghiệp in năm 1984 đã từng lưu ý: “Hiện nay củ thương lục được bán ở Hà Nội và chở vào miền Nam bán với tên giả mạo hồng sâm hay phòng sâm Củ thương lục chính là một vị thuốc công hạ mãnh liệt, có thể gây sảy thai

Dù người khỏe mạnh mà dùng thì cũng tổn thương gân cốt và hại thận” Từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này với các mục đích chính:

1 Đánh giá tính đa dạng di truyền của một số loài Codonopsis được thu

thập tại Việt Nam

2 Xác định các mã vạch có khả năng phân biệt, nhận dạng được các loài

thuộc chi Codonopsis, cùng với chỉ thị hình thái, trở thành công cụ ứng

dụng hữu hiệu trong kiểm định dược liệu

3 Góp phần bảo tồn nguồn gen của loài cây thuốc quý hiếm đang được liệt vào Sách Đỏ Việt Nam

1.2 Tổng quan về mã vạch ADN (DNA barcode)

Phương pháp phân loại hình thái có lịch sử phát triển lâu đời và đã xây dựng được một hệ thống phân loại sinh vật nói chung và thực vật nói riêng tương đối đầy

đủ và toàn diện Phương pháp phân loại này chủ yếu dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản (hoa) Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu vật đang trong giai đoạn phát triển (chưa ra hoa), những mẫu có đặc điểm giống nhau do cùng thích nghi với điều kiện môi trường, hoặc khó nhận biết do có nhiều điểm tương đồng ở bậc phân loại thấp như loài và dưới loài [36]; ngoài ra, phương pháp phân loại hình thái thường chỉ thực hiện được bởi các chuyên gia hình thái học; việc phân loại đôi khi tốn nhiều thời gian và công sức [29]

Từ giữa những năm 1990, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, một phương pháp nghiên cứu mới trong lĩnh vực phân loại học đã hình thành và

được gọi là phương pháp phân loại học phân tử Phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen (ADN) trong và ngoài nhân hoặc các sản phẩm của chúng (protein) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen (đoạn ADN) khác nhau hoặc các sản phẩm khác nhau của hệ gen Trong phương pháp phân loại phân tử, các kỹ thuật thường được ứng dụng để nghiên cứu tính đa dạng sinh học, mối quan hệ tiến hóa giữa các loài, xây dựng cây chủng loại phát sinh cũng như giúp nhận dạng đến cấp phân loại loài hoặc chi

Ở thực vật, một số phương pháp chỉ thị phân tử được sử dụng để nhận dạng loài như sử dụng enzym giới hạn kết hợp với lai ADN (RFLP), dấu vân tay ADN (ADN fingerprinting), phản ứng chuỗi trùng hợp PCR, và đặc biệt việc sử dụng các

kỹ thuật mã vạch ADN (DNA barcode) ngày càng trở nên phổ biến Các phương pháp này đều dựa trên thực tế rằng cấu trúc hóa học của ADN từ mọi loài là giống nhau và sự khác biệt đặc trưng duy nhất giữa chúng là trình tự các cặp bazơ

Năm 2003, Paul Hebert, nhà nghiên cứu tại Đại học Guelph ở Ontario, Canada, đề xuất "mã vạch DNA" (DNA Barcode) như là một cách để xác định loài

Mã vạch được sử dụng là một đoạn ADN ngắn từ một phần của hệ gen và được dùng giống như cách một máy quét ở siêu thị phân biệt được các sản phẩm bằng cách nhận diện được các sọc màu đen đặc chưng của từng sản phẩm [59] Trong công nghệ mã vạch, có thể hai mặt hàng trông rất giống nhau và không phân biệt được bằng mắt thường, song qua mã vạch, máy quét có thể phân biệt được

Việc sử dụng DNA barcode để nhận dạng các loài trên quy mô toàn cầu có ý nghĩa ngày càng lớn Theo The Barcode of Life Data Systems (http://www.boldsystems.org) năm 2011 đã lưu trữ được hơn 1.100.000 DNA barcoding từ hơn 95.000 đối tượng sinh vật khác nhau Trong 10 năm qua, đã có hơn 180.000 trình tự ADN barcode của thực vật được lưu giữ trong Ngân hàng gen Quốc tế (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) và liên kết với hơn 2.000 bài báo khác nhau Để chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng DNA barcode, cộng đồng khoa học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN có thể làm mã

vạch có thể phân biệt đồng thời nhiều loài [16], [25], [28], [44] Một mã vạch ADN điển hình phải đáp ứng được các yêu cầu sau :

(i) có tính phổ biến cao để có thể thực hiện trên nhiều loài thực vật;

(ii) trình tự có tính đặc hiệu cao và có hiệu suất nhân bản cao;

(iii) có khả năng phân biệt đồng thời được nhiều loài

1.3 Một số mã vạch ADN đƣợc sử dụng rộng rãi và tình hình nghiên cứu

1.3.1 Mã vạch ADN ở động vật

Việc lựa chọn các vùng ADN mã vạch liên quan đến việc lựa chọn một hoặc một vài locut có thể thu được trình tự thường xuyên và đáng tin cậy trong bộ mẫu lớn và đa dạng, đưa ra dữ liệu so sánh một cách dễ dàng giúp phân biệt các loài với nhau; hay có thể nói đây là vùng thông tin di truyền có ý nghĩa thực sự có thể cung cấp thông tin nhận dạng: nó thường phải đủ dài để chứa đủ thông tin có thể phân biệt giữa các loài nhưng đủ ngắn để thuận tiện cho phân tích Mã vạch ADN locut gen CO1 ở động vật thường được dùng rộng rãi do đáp ứng được các tiêu chí này [29] Đây là một gen đơn bội, được di truyền từ mẹ và cho mức độ phân biệt cao

Đó là một vùng gen mã hóa cho protein có mặt với nhiều bản sao trong mỗi tế bào

Ở động vật, nó có tính bảo thủ với những vùng đảo ngược nhỏ, hoặc thường xuyên lặp đi lặp lại đơn nucleotide Những đặc điểm này kết hợp với cặp mồi được thiết kế tốt, hiệu quả sử dụng gen CO1 để phân biệt nhiều mẫu động vật có cùng tổ tiên được ghi nhận tốt, thậm chí hiệu suất sử dụng cao ngay với các mẫu đã được lưu giữ qua thời gian dài [78]

Chẳng hạn ở các loài linh trưởng, hệ gen mỗi tế bào có khoảng 4 tỷ cặp bp

Mã vạch gen ty thể CO1 (mã hóa cho tiểu đơn vị của cytochrome oxidase) chỉ có kích thước 648 bp, nhưng từ người tới tinh tinh và các loài vượn khác, sự khác biệt của CO1 là vừa đủ để phân biệt giữa mỗi loài Loài người khác hai loài còn lại ở một hoặc hai cặp base trong vùng mã vạch, nhưng khác biệt ở cả hệ gen người với tinh tinh, là khoảng 60 vị trí và với khỉ đột là khoảng 70 vị trí [59] Đối với công nghệ mã vạch ADN, hệ gen ti thể cũng tỏ ra đặc biệt phù hợp do sự khác biệt giữa các loài là nhiều hơn so với DNA hệ gen nhân Vì đó, một số phân đoạn ngắn ADN

ti thể có thể được dùng để phân biệt các loài Ngoài ra, ADN ti thể thường có nhiều bản sao hơn so với ADN nhân và vì vậy dễ phục hồi từ các mẫu vật, đặc biệt là từ các mẫu với lượng nhỏ hoặc các mẫu đã bị xuống cấp Nhiều nghiên cứu đã được thử nghiệm và đưa ra hiệu quả của mã vạch CO1 trong phân loại các nhóm động vật

đa dạng, phân bố trên đất liền cũng như dưới biển, từ các vùng cực đến các vùng nhiệt đới Nhiều nghiên cứu cho thấy CO1 giúp phân biệt được khoảng 98% các loài với nhau Trong phần còn lại, nó xác định hẹp đến các cặp hoặc bộ nhỏ của các loài có mối quan hệ gần gũi, nói chung là các loài chỉ vừa mới tách ra hoặc các loài lai thường xuyên [59] Ngoài locut gen CO1, các đoạn gen ti thể Cytb (cytochrome b), gen ribosome 12S, 16S cũng được dùng như ADN mã vạch trong nhận dạng ở động vật

1.3.2 Mã vạch ADN ở thực vật

Nếu như các gen ti thể như CO1 và Cytb được dùng rộng rãi cho động vật [74] và một số loài tảo [68], thì khi chúng được áp dụng cho các loài thực vật trên cạn lại biểu hiện tính bảo thủ cao và vì vậy không phù hợp làm ADN mã vạch Thay vào đó, các vùng rời rạc trong hệ gen lạp thể đã được dùng trong các nghiên cứu

phát sinh loài (như các vùng exon của các gen rbcL, atpB, ndhF và matK và vùng intron của các gen trnL và trnL-F) Những vùng ADN này đủ có ích như mã vạch

bởi tính đủ bảo thủ trong phạm vi mỗi loài nhưng đa hình giữa các loài Một vùng trình tự thông thường khác cho nghiên cứu phát sinh loài thực vật trên cạn là

ribosome ITS nhân (vùng đệm của tiểu đơn vị lớn ADN ribosome), nhưng vùng này

không đạt hiệu quả cao ở một số nhóm thực vật do các yếu tố khác liên quan đến các diễn biến tiến hóa phức tạp của các vùng lặp lại cao trong hệ gen nhân [44] Tính đến năm 2009, đã có khoảng 8 locus gen được sử dụng làm mã vạch DNA ở các loài thực vật, bao gồm cả hệ gen nhân và hệ gen lục lạp

1.3.2.1 Dấu chuẩn gen lục lạp đƣợc sử dụng rộng rãi

Hệ gen lục lạp là toàn bộ lượng thông tin di truyền chứa trog ADN của lục lạp Tuy chỉ chiếm hàm lượng ít (0,2-0,5%) nhưng cũng giống như trong ty thể, ADN có vai trò rất quan trọng và đáng chú ý vì sự có mặt của ADN trong lục lạp có

liên hệ với hệ thống di truyền ngoài nhiễm sắc thể (di truyền ngoài tế bào chất) và

hệ tự tổng hợp protein của lục lạp Phân tử ADN lục lạp là phân tử ADN dạng vòng trần chứa trung bình khoảng 120 kb đủ ghi mã cho 120 gen Những gen mã hóa cho protein có khoảng 100 gen, thêm và đó, chúng còn có các gen tRNA và ARN ribixomal [6]

Dựa trên sự phù hợp khác nhau của các dấu chuẩn gen lục lạp mã hóa và không mã hóa, bốn đề xuất chính cho một mã vạch cây trồng đã được đề xuất bởi ba nhóm nghiên cứu khác nhau Các mã vạch được đề xuất liên quan đến sự kết hợp

khác nhau của 7 dấu chuẩn gen lục lạp, bao gồm rpoC1 + rpoB + matK hoặc rpoC1 + matK + trnH-psbA; rbcL + trnH-psbA và atpF-H + psbK-I + matK Sự kết hợp

khác nhau các dấu chuẩn đã được thảo luận tại Hội nghị quốc tế Barcode of Life lần

thứ 2 tại Đài Bắc Năm sau, LaHaye và cộng sự [48] đề xuất riêng gen matK cấu

thành nên mã vạch cây trồng, đây là một trong những khu vực có tốc độ tiến hóa nhanh nhất trong lục lạp và cho thấy khả năng phân biệt cao các loài trong thực vật hạt kín [48]

Nhóm nghiên cứu thực vật CBOL đề nghị một mã vạch cốt lõi bao gồm phần

hai khu vực mã hóa của gen lục lạp, rbcL + matK [28] Mã vạch rbcL bao gồm một

khu vực 599 bp ở cuối 5 'của gen, nằm ở bp từ 1-599 trong trình tự hệ gen gen lục

lạp hoàn chỉnh của Arabidopsis thaliana Khu vực mã vạch matK bao gồm một

vùng khoảng 841 bp ở trung tâm của gen nằm giữa bp 205-1046 (bao gồm cả các

vùng mồi) trong trình tự toàn bộ hệ gen gen lục lạp của A thaliana Sự lựa chọn

rbcL + matK như mã vạch lõi được dựa trên sự khuếch đại đơn giản của khu vực rbcL (rbcL được khuếch đại thành công trong phạm vi rộng bao gồm thực vật có

hoa, thực vật hạt trần và thực vật không có hoa) và khả năng phân biệt của khu vực

matK (MatK là một trong những khu vực mã hóa tiến hóa nhanh nhất của hệ gen

của gen lục lạp [30], và có thể nói là gần tương tự mã vạch CO1 ở động vật) Tuy nhiên, matK có thể khó khăn để PCR khuếch đại khi sử dụng bộ mồi hiện có - đặc

biệt là khi thực vật nghiên cứu không phải là thực vật hạt kín Ngược lại, khu vực

mã vạch của rbcL là dễ dàng để khuếch đại, thu trình tự, và so sánh trong hầu hết

các thực vật trên đất liền và cung cấp một bộ khung hữu ích cho các dữ liệu mã vạch, mặc dù nó chỉ có khả năng phân biệt khiêm tốn Hai dấu chuẩn mã vạch gen lục lạp phân biệt tốt hơn so với việc sử dụng một dấu chuẩn mã vạch duy nhất, nhưng không có 2 dấu chuẩn hoặc đa dấu chuẩn gen lục lạp cho độ phân giải tốt

hơn sự kết hợp giữa hai dấu chuẩn rbcL + matK [11] Khi cả hai dấu chuẩn đều là

vùng mã hóa, sự đọc dịch các trình tự trên ADN thành các axit amin của protein của gen đó có thể được sử dụng để tự động hóa kiểm tra cho việc chỉnh sửa/lắp ráp

lỗi, sự hiện diện của gen giả, và định hướng đúng trình tự Ngoài mã vạch rbcL +

matK, dấu chuẩn mã vạch gen lục lạp được sử dụng rộng rãi nhất là trnH-psbA Ở

hầu hết thực vật có hoa, kích thước vùng này dao động từ 340- 660 bp, dễ dàng được khuếch đại, và là một trong những vùng liên gen (IGS-intergenic spacer) ở thực vật [69] Nó đã được sử dụng thành công trong một loạt các nghiên cứu mã vạch và là một sự lựa chọn rõ ràng cho một mã vạch bổ sung Trong những nghiên

cứu so sánh trực tiếp, nó thành công cao hơn trong việc phân biệt loài so với rbcL +

matK ở những nhóm như Ficus và Alnus [67] và giải quyết hoàn thiện các nhóm

phức tạp như Quercus và Salix [76] Sự hiện diện của những vùng lặp lại có thể dẫn đến vài vấn đề ở một số nhỏ của các nhóm (ví dụ như Pinus, cây mè; Eryngium ) Một trong những mối quan tâm chính liên quan đến việc có sử dụng trnH-psbA như

là một mã vạch tiêu chuẩn hay không là vấn đề trình tự được đọc bị dừng lại sớm do xuất hiện các đơn nucleotide lặp đi lặp lại Tuy nhiên, thử nghiệm với các polymerase mới đã cải thiện chất lượng đọc trình tự ngay cả khi có sự hiện diện của các đơn nucleotide [23]

Các IGS atpF-atpH và psbK-psbI đã được đề xuất như các khu vực mã vạch thực vật tại Hội nghị Barcode of Life quốc tế thứ hai (KJ Kim) Trong nghiên cứu

của Nhóm nghiên cứu thực vật CBOL [28], psbK-psbI cho khả năng phân biệt ở mức độ cao, nhưng cho chất lượng trình tự kém hơn, trong khi atpF-atpH cho thấy

khả năng phân biệt tương đối khiêm tốn và chất lượng trình tự trung bình Một số nghiên cứu gần đây đã cung cấp các báo cáo tích cực về hiệu suất sử dụng và hiệu

quả của cả atpF-atpH và psbK-psbI và báo cáo đã chỉ ra rằng chúng rất hữu ích

trong các nghiên cứu về thực vật ở Hàn Quốc (Ki-Joong Kim)

Intron trnL và vùng IGS giữa trnL và trnF đã được sử dụng rộng rãi trong

các hệ thống học thực vật và phát sinh loài địa lý kể từ đầu những năm 1990 Các khu vực này có thể thu được trình tự một cách đơn giản, mặc dù các đơn nucleotide lặp lại có thể ảnh hưởng đến việc đọc trình tự ở một số đơn vị phân loại Những bản

sao lặp lại của gen trnF đã được báo cáo ở họ Brassicaceae, và trong một vài đơn vị phân loại, bộ gen lục lạp đã bị mất một IGS (ví dụ như Manihot esculenta,

Selaginella moellendorffii) và ở một vài đơn vị khác thì mất intron (ví dụ như Lathyrus sativus, Lotus japonicus, Trifolium subterraneum ) Một số nghiên cứu đã

chỉ ra rằng các khu vực khác của bộ gen lục lạp có thể có nhiều biến đổi và cung cấp thông tin cho nghiên cứu phát sinh loài [69], nhưng tiềm năng chính của intron

trnL cho nhận dạng loài là sự hiện diện của một cấu trúc thân-vòng nhỏ trong

intron, đó là vòng P6 Đây là một “minibarcode” ngắn đã được chứng tỏ rất hữu ích cho các nhà sinh thái học nghiên cứu ADN thoái hóa cao và sử dụng kỹ thuật giải trình tự ở các thế hệ tiếp theo để đánh giá sự đa dạng của các mẫu trong môi trường phức tạp (ví dụ như chất lắng)

1.3.2.2 Các dấu chuẩn vùng gen nhân đƣợc sử dụng rộng rãi

Trình tự ITS bao gồm: ITS1- 5.8S rDNA-ITS 2 với kích thước khác nhau, từ

400 đến hơn 1000 bp Đây là trình tự được sử dụng thường xuyên trong nghiên cứu

hệ thống phát sinh ở thực vật do nó có khả năng phân biệt loài cao nhất và dễ khuếch đại [10], [35] và cũng là một sự lựa chọn cho một mã vạch bổ sung ở những nhóm có thể giải trình tự trực tiếp [28] Ở một vài thực vật ký sinh với hệ gen lục

lạp bị giảm mạnh, các nrITS có thể đại diện cho các mã vạch duy nhất khả thi hiện đang có sẵn (mặc dù matK có thể được giữ lại trong một số thực vật dị dưỡng đầy đủ) Khả năng phân biệt tốt hơn (nói chung) của nrITS so với các vùng gen lục lạp ở

các mức phân loại thấp cũng được thành lập trong hệ thống học phân tử thực vật, và

rõ ràng rằng trong những nhóm mà nrITS hoạt động tốt, nó sẽ thường xuyên được

sử dụng như là một mã vạch DNA

Một số nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng nrITS phân biệt giữa các loài thực vật

chia sẻ haplotype gen lục lạp [67] Tuy nhiên, có ba mối quan tâm chính về nrITS, ngăn cản nó là một thành phần cốt lõi của mã vạch cây trồng Đầu tiên, trong quá trình tiến hóa, các gen liên quan trong một loài trải qua quá trình trao đổi gen không hoàn toàn có thể dẫn đến bản sao paralogous (hiện tượng một gen nhân lên và chiếm các vị trí khác nhau trong cùng một hệ gen) khác nhau trong cá thể [12] Sự xuất hiện của bản sao khác nhau này đòi hỏi những phân tích tỉ mỉ, cẩn thận trong việc xem xét những vùng này có phải là các cơ sở đa hình không, và tệ nhất, các bản sao khác nhau có thể ngăn cản việc thu hồi các trình tự có thể đọc được Ngoài

ra, các biến thể khác nhau có thể được thu từ cùng một mẫu đã cho tùy thuộc vào chiến lược khuếch đại, cặp mồi được sử dụng, và hiệu quả PCR Một mối quan tâm thứ hai là nhiễm nấm mốc [10], đặc biệt là trong trường hợp thực vật chứa nấm hội

sinh Và thứ ba, mặc dù một số bộ mồi nrITS là có sẵn, và đã được sử dụng thành

công trước đó, tuy nhiên vẫn có thể gặp khó khăn trong việc khuếch đại và giải trình tự khu vực này từ những bộ mẫu có độ đa dạng cao Ví dụ, Gonzalez và cộng

sự [27] đã báo cáo chỉ PCR và giải trình tự thành công 41% từ mẫu của 285 cây nhiệt đới

Một đề xuất đã được đưa ra thay thế cho việc sử dụng toàn bộ vùng 5.8S-ITS2 là sử dụng chỉ là một phần của khu vực này như là mã vạch, cụ thể là nrITS2 Cách tiếp cận này đã hữu ích trong nhiều nghiên cứu và nó được lập luận rằng việc tập trung trên khu vực nrITS2 sẽ làm giảm các vấn đề liên quan đến việc khuếch đại và giải trình tự toàn bộ tập hợp nrITS Do chiều dài ngắn hơn của khu vực nrITS2 nên công việc giải trình tự cũng dễ dàng hơn nhiều so với việc thực hiện trên toàn bộ nrITS, và khu vực nrITS2 đã được bảo tồn lâu dài hơn so với khu vực nrITS1 Do đó, việc sử dụng các nrITS2 sẽ liên quan đến sự đánh đổi một số

ITS1-lượng lớn ký tự có thể dùng được với việc chỉ sử dụng một phần nhỏ của vùng

nrITS để dễ dàng thu hồi được vùng gen cần nhân bản và so sánh dễ dàng hơn Để đánh giá hiệu quả khi sử dụng các trình tự ngắn hơn của nrITS2 so với toàn bộ khu vực nrITS, Liu và cộng sự đã thu thập và xử lý nhiều mẫu hơn nữa và khả năng

phân biệt của nrITS2 giảm đáng kể so với sự kết hợp cả tập hợp ITS15.8S-ITS2

[56] Những hạn chế của vùng đệm nội bộ sao chép đã được ghi nhận trong điều kiện chung [10]

1.4 Ứng dụng mã vạch ADN trên thực vật

1.4.1 Ứng dụng ở thực vật nói chung

Nghiên cứu mã vạch ADN thực vật đã vượt xa nhiệm vụ so sánh các vùng ADN khác nhau để tiến tới những ứng dụng thực tế hơn Các ứng dụng này có thể được chia thành hai loại rộng Một là để cung cấp cái nhìn sâu hơn vào phân loại học ở cấp độ loài và đóng góp vào quá trình phân loại học: nhận diện và phân chia ranh giới giữa các loài Ứng dụng thứ hai, và là ứng dụng chính, là hỗ trợ quá trình nhận diện các mẫu vật không nhận biết được hoặc chưa xác định được thuộc loài nào Mã vạch DNA thực vật có khả năng cung cấp cái nhìn sâu vào phân loại cấp độ loài trong những nhóm có hình thái đơn giản, nhóm có phân bố rất rộng, nhóm có kích thước nhỏ, và / hoặc những nhóm đã được phân loại nhưng không đầy đủ, chưa tương xứng với đặc điểm đa dạng của chúng (ví dụ như một số trường hợp không thể dựa trên nguyên tắc phân loại hình thái học để đánh giá, phân loại, hoặc đã được phân loại nhưng chưa thực sự triệt để) Phương pháp tiếp cận mã vạch ADN đã cung cấp các thông tin hữu ích về những bí ẩn trong đa dạng loài của nhóm thực vật bryophytes (rêu) [60] Phương pháp này từ lâu đã được sử dụng để phân định các loài trong nhóm này [34], do đó tiêu chuẩn hóa và mở rộng các hoạt động của mã vạch ADN là một sự tiến triển tự nhiên ADN mã vạch cũng được sử dụng để tăng cường sự hiểu biết các loài thực vật có hạt, hoặc thông qua đó đóng góp đến sự khám phá các loài ẩn danh [31]

Hiện nay có rất nhiều ngành nghề liên quan đến việc thực hiện hoặc sử dụng

nhận dạng thực vật (Bảng 1), ví dụ như phân loại học, sinh thái học, bảo vệ môi

trường, lâm nghiệp, nông nghiệp, các nhà khoa học pháp y, hải quan và cán bộ kiểm dịch, và trong nhiều tình huống mà các phương pháp tiếp cận mã vạch sẽ dẫn đến việc xác định “nhóm loài” hơn là loài Tuy nhiên, đối với một số ứng dụng, thậm

chí là một mã vạch ADN với khả năng phân biệt tương đối khiêm tốn cũng có thể hữu ích Tình huống cụ thể bao gồm:

(1) nghiên cứu vùng địa lý nhằm đánh giá sự đa dạng tại một vùng hoặc một khu vực, nơi mà nhiều trong số những mẫu nghiên cứu không nhất thiết phải có mối quan hệ chặt chẽ với nhau

(2) với các loài có giá trị thương mại, mục tiêu của mã vạch là để phân biệt một tập hợp các loài mục tiêu mà ta quan tâm, với những loài họ hàng xa có tiềm năng thay thế hoặc để xác định các thành viên của các nhóm phân loại cao hơn (ví

dụ như họ, chi) hơn là xác định một loài cụ thể, và

(3) khi cần nhận diện một vật mẫu nào đó mà người sử dụng hoàn toàn không có ý tưởng hay sự quen thuộc nào về vật mẫu đó thuộc họ nào Trong tình huống này, việc xác định một nhóm các loài có liên quan sẽ rất hữu ích vì nó có thể thu hẹp phạm vi các lựa chọn lại và có thể sử dụng kết hợp với khóa phân loại hình thái học hoặc tham khảo ý kiến chuyên gia để có được một xác định cuối cùng

Trong dãy các ứng dụng, ADN mã vạch còn được sử dụng để xác định các rễ cây, cây giống, hoặc giai đoạn sống chưa rõ (ví dụ như cây dương xỉ gametophytes) ADN mã vạch đã cung cấp một con đường thực tế hơn để có thể xác định trong những tình huống này [40] Kesanakurthi và cộng sự [40] sử dụng riêng

lẻ chuỗi rbcL để thực hiện phân chia đến các loài (hoặc nhóm loài) cho 85% các

mẫu rễ kiểm tra, cho phép kiểm tra chi tiết các yếu tố sinh thái Tương tự như vậy,

mã vạch DNA có thể nhận diện các mẫu vật, vật liệu đã được xử lý bằng cách này hay cách khác, chẳng hạn như phân tích chế độ ăn uống của động vật ăn cỏ [72], các sản phẩm thực phẩm, hoặc các thành phần của các loại thuốc thảo dược [71]

Baker và Little sử dụng mã vạch ADN matK để làm nổi bật các loài thực vật

bị xác định nhầm trong thảo dược bổ sung [46] Hơn 1/4 thảo dược thương mại có

sẵn của Black Cohosh được kiểm tra và phát hiện không chứa loài Actea raceomosa Bắc Mỹ, mà thay vào đó là loài Actea Châu Á Một ứng dụng khác đang nổi lên của

mã vạch ADN ở thực vật là việc xác định các loài được bảo vệ trong thương mại

Bảng 1 Bảng liệt kê một số các nghiên cứu sử dụng mã vạch ADN nhƣ

trnH-psbA đã được đánh giá

như vùng biểu hiện tốt nhất Nhận diện những loài

Herbertus (rêu) ẩn danh

psbA+nrITS

rcbL+matK+trnH-matK và nrITS đánh giá là

vùng biểu hiện tốt nhất Nhận diện những cây

con trên một mảng rừng

nhiệt đới [27]

nrITS, trnH-psbA, rbcL, matK (và những vùng

khác)

trnH-psbA đã được đánh giá

là vùng biều hiện tốt nhất

Nhận diện các cây thảo

dược Trung Quốc họ

Polygonaceae [70]

trnH-psbA

Nhận diện các cây thảo

dược Trung Quốc họ

cây thảo dược [16]

nrITS2, nrlITS, matK, rcbL, psbA-trnH (và các

vùng khác)

nrITS2 được đánh giá là dấu

chuẩn thể hiện tốt nhất

khăn trong việc khuyếch đại, nên bị loại bỏ

trnL intron ít thông tin do độ

bao phủ thấp trong cơ sở dữ liệu tham khảo

matK và trnH-psbA được chỉ

ra là không đủ độ biến đổi

Nhận dạng những thực

vật cấu thành bữa ăn của

động vật ăn cỏ

trnL P6 loop, trnL intron, trnH-psbA

Có khoảng 29.000 loài cây trồng được bảo hộ trong Công ước CITES (Công ước về buôn bán quốc tế các loài động vật, thực vật hoang dã nguy cấp (http://www.cites.org/eng/disc/species.shtml), và việc phát triển các phương pháp hiệu quả để phân biệt loài nằm trong danh sách CITES với những loài không nằm trong danh sách CITES Ogden và cộng sự [64] phát triển một cách tiếp cận kiểu

gien SNP dựa trên ADN mã vạch gen matK để phân biệt giữa các sản phẩm gỗ của

Ramin (Gonostylus)-loài được CITES bảo vệ, với các loài không cùng họ hoặc loài

có cấu trúc giải phẫu tương tự nhưng quan hệ xa- không được bảo vệ bởi CITES

Bảng 2 Một số dự án mã vạch ADN thực vật đang thực hiện hay đang trong

giai đoạn dự kiến năm 2011 [31]

Cây BOL: mã vạch các loài cây trên thế

giới

Vườn thực vật New York

Cỏ BOL: mã vạch cho thực vật cỏ và giống

cỏ

Đại học Adelaide và Đại học British Columbia

Hệ thực vật của công viên quốc gia Kruger Đại học Johannesburg

Hệ thực vật của khu bảo tồn Guanacaste

Vườn thực vật New York

Mã vạch ADN của trung tâm những mảnh

Mã vạch ADN cho hệ thực vật xứ Wales Vườn thực vật quốc gia của Wales

Mã vạch ADN cho ngành rêu ở Anh Vườn thực vật hoàng gia Edinburgh

Việc thành lập một thư viện tài liệu tham khảo phù hợp là điều kiện quan trọng tiên quyết cho các ứng dụng của mã vạch ADN, điều này đòi hỏi các dữ liệu

về mã vạch ADN phải được xây dựng từ các mẫu xác định và được đảm bảo về độ

tin cậy và chuẩn xác Có rất nhiều kế hoạch dựa trên phân loại học và vùng phân bố địa lí phức tạp của các mẫu được tiến hành nhằm góp phần hướng tới thư viện tham

khảo này, một số dự án được liệt kê ở Bảng 2 Ngoài các dự án này, còn có các

chuỗi thông tin được lưu trữ trong GenBank, nó đã cung cấp một nguồn hữu ích cho việc nhận dạng Các mẫu đối chiếu gắn với các tiêu chuẩn mã vạch ở GenBank và các cơ sở dữ liệu như cơ sở dữ liệu Barcode of Life (BOLD) [66] trở nên mạnh mẽ hơn rất nhiều: chúng được chứng thực và đảm bảo thông tin, trình tự, tập tin và được liên kết với các siêu dữ liệu khác

Ở nước ta, rất nhiều nghiên cứu về nguồn gốc tiến hóa của thực vật trên cơ

sở phân tích một số vùng ADN đã được thực hiện Huỳnh Thị Thu Huệ và cộng sự

đã phân lập và xác định trình tự gen 18S rRNA của 4 loài Bình vôi ở Việt Nam [3] Nguyễn Đức Thành và cộng sự đã sử dụng một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ một số loài cây lâm nghiệp, trong đó có một số loài bị đe dọa [7] Những kết quả nghiên cứu trên chỉ ra rằng mã vạch ADN là công

cụ hữu hiệu trong nghiên cứu đa dạng di truyền và bằng cách so sánh mã vạch ADN

ở một vài sinh vật khác với các mã vạch đã được biên soạn trong thư viện thông tin

có thể giúp nhận diện loài, loài mới hoặc các loài quý hiếm

1.4.2 Ứng dụng mã vạch ADN trong nhận biết cây dƣợc liệu

Cây thuốc là nguồn gốc của một số lượng lớn các loại thuốc thiết yếu trong y học phương Tây và là cơ sở của thuốc thảo dược, đó không chỉ là nguồn chính chăm sóc sức khỏe cho hầu hết dân số thế giới ở các nước đang phát triển mà còn ngày càng phổ biến ở các quốc gia phát triển[38], [41], [63] Sự gia tăng nhu cầu sử dụng các sản phẩm từ thực vật để làm thuốc đã được đáp ứng bởi một ngành công nghiệp mở, được đảm bảo về hiệu quả, chất lượng và an toàn [21], [37] Thực vật dùng làm thuốc thảo dược luôn cần được xác định ở cấp độ loài, vì vậy, xác định chính xác là một bước quan trọng để có thể đảm bảo về chất lượng sản phẩm và có tầm quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền [9], [32], phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý [79] cũng như bảo vệ các loài có nguy

cơ tuyệt chủng

Ngày nay, đến 80% dân số thế giới đã sử dụng y học cổ truyền cho mục đích chăm sóc sức khỏe và chữa bệnh [65], trong đó Trung Quốc có lịch sử rất lâu đời về việc sử dụng nguyên liệu từ thảo dược có nguồn gốc từ hơn 10.000 loài, hơn 2.000 chi và 400 họ để làm thuốc [16] Hiện nay, các thị trường xuyên quốc gia về nguồn nguyên liệu thảo dược dùng trong sản xuất dược phẩm có tiềm năng rất lớn

và đang tiếp tục phát triển Doanh thu từ thảo dược đạt đến 14 tỷ USD tại Trung Quốc trong năm 2005 và 5 tỷ USD tại Châu Âu trong năm 2004 [65] Cùng với sự phát triển của thị trường thảo dược, sự giả mạo các nguyên liệu thảo dược thuốc cũng trở thành vấn đề toàn cầu Các nguyên liệu thảo dược này có thể được thay thế bằng các loại thảo mộc khác có quan hệ họ hàng gần gũi, thậm chí từ những nguyên liệu giả mạo Việc giả mạo các nguyên liệu thảo dược thường là do:

(i) vật liệu không phân biệt được bằng đăc điểm hình thái

(ii) những vật liệu có tên tương tự nhau, và

(iii) việc thay thế những nguyên liệu có giá trị kinh tế bằng nguyên

liệu khác rẻ tiền hơn

Tuy nhiên, việc xác định chính xác các nguyên liệu thảo dược làm thuốc theo phương pháp truyền thống như sự đánh giá cảm quan và phương pháp hóa học đôi khi gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là những nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật

đã được chế biến một phần hoặc ở dạng bột Vì vậy, phương pháp sử dụng các dấu chuẩn phân tử rõ ràng là chính xác và phổ biến hơn, cho phép những người dù k phải là chuyên gia cũng có khả năng nhận biết được nguồn gốc các loại thực vật chỉ

từ một lượng mẫu mô nhỏ Mã vạch ADN đã trở thành phương pháp chính được sử dụng trong lĩnh vực đa dạng sinh học và các công trình bảo tồn trong những năm gần đây, ở đây, ứng dụng của mã vạch ADN được xem xét là để kiểm soát chất lượng sản phẩm và trong công tác điều tra Việc nhận biết các nguyên liệu thảo dược sử dụng phương pháp mã vạch AND có thể bảo vệ người dụng tránh khỏi tác dụng độc hại của các loại thuốc giả mạo, đặc biệt trong nhiều trường hợp có thể nguy hiểm đến tính mạng Vì vậy, một cơ sở dữ liệu DNA barcode bao gồm các

Bảng 3 Những cặp mồi đƣợc sử dụng thông dụng trong việc khuyếch đại và

trình tự DNA có thể phân biệt được ở các mức độ phân loại khác nhau là rất cần thiết để nhận dạng.Gần đây, một cơ sở dữ liệu mã vạch ADN online đầu tiên

(http://www.cuhk.edu.hk/icm/mmdbd.htm), đã được xây dựng, cho phép người sử dụng có thể tìm và phân tích trình tự ADN của nhiều nguyên liệu thảo dược Cơ sở

dữ liệu chứa khoảng 20.000 trình tự ADN của 1.300 loài dược liệu bao gồm Dược phẩm của nước Cộng hòa nhân dân Trung Quốc (Pharmacopoeia of the People‟s Republic of China) và Dược điển Hoa Kỳ (The United States Pharmacopoeia) [52],

và có bốn mã vạch ADN tiêu chuẩn đại diện cho trên 50% trình tự của các nguyên

liệu thảo dược Trình tự ITS được sử dụng thường xuyên nhất (28%), tiếp theo là

trnH-psbA (9%), rbcL (8%) và matK (8%) Ngoài ra, đoạn xen trnL - trnF ở lục lạp

và 5S rDNA cũng được sử dụng như các trình tự dấu chuẩn ADN Dưới đây trình bày một số mã vạch ADN đã được nghiên cứu và ứng dụng trong các cây dược liệu

Vùng gen ITS được sử dụng như trình tự phổ biến nhất để làm mã vạch và

xác thực các nguyên liệu thảo dược Ví dụ, ITS cung cấp số lượng thông tin đặc trưng lớn nhất và khả năng xử lý tốt nhất 6 mẫu của Hedyotis L có họ với Rubiaceae [39] ITS đã được sử dụng thành công để phân biệt 14 lòai Hedyotis L, bao gồm cả loài chính thống trong phương thuốc điều trị khối u “Baihuasheshecao”

có nguồn gốc từ H diffusa Willd, và cả loài giả mạo có nguồn gốc từ H corymbosa

(L.) Lam [53] Do mức độ biến đổi giữa các các cá thể trong loài rất nhỏ (<0.5%)

nhưng giữa các loài khác nhau thì lớn( >16%) khiến cho ITS trở nên phù hợp để

phân biệt được 2 loài khác nhau ITS cũng hữu dụng trong việc phân biệt

Baihuasheshecao được làm giả từ một số loài thuộc các họ khác , như Sagina

japonica (Sw ) Ohwi, Stellaria alsine Grimm và Arenaria serpyllifolia L Tuy

nhiên, trong một số trường hợp sự biến đổi, sai khác của ITS giữa các loài khác nhau là nhỏ Ví dụ, nó không có khả năng phân biệt nhiều loài Aconitum L bao gồm A carmichaeli Debeaux và A.kusnezoffii Rchbb Cả hai đều được coi như là các thảo dược làm thuốc “Wutou” trong thảo điển của Trung Quốc ITS cũng không

có khả năng phân biệt được Bupleurum chinense DC (Apiaceae) từ B

scorzonerifolium Willd, cả hai đều được coi là “Chaihu, mặc dù, B scorzonerifolium Willd là tách ra từ B chinense DC và bảy loài Bupleurum L bằng

cách sử dụng phương pháp phân tích Maximum Parsimony [82]

Trình tự ITS2 nằm trong ITS đã được chứng minh là có vai trò to lớn trong việc nhận dạng nguyên liệu thảo dược ở 55 loại thảo mộc [17] Khu vực ITS2 dễ

dàng phân biệt tất cả 24 loài dược liệu và 66 loài liên quan với nhau ở cấp độ chi và cũng có thể nhận dạng được 80% loài ở mức độ loài, tỷ lệ thành công trong việc xác

định hơn 4.800 loài thực vật từ 750 chi bằng cách sử dụng ITS2 đạt tới 92,7% [16] Độ biến đổi cao và khả năng phân biệt loài của ITS2 là cơ sở mạnh mẽ cho

việc sử dụng của nó như là một mã vạch ADN trong việc nhận biết các nguyên liệu

thảo dược Ở ITS2, mức độ biến đổi cao giữa các loài khác nhau, và thấp trong nội

bộ loài là một lợi thế chủ yếu cho việc phân biệt những loài có quan hệ gần Ví dụ,

sự thay đổi của trình tự này trong số các loài Fabaceae( thuộc họ đậu ) cho thấy mức

độ biến đổi trong nội bộ loài trung bình là 1,7% (dao động từ 0% đến 14,4%) và mức độ biến đổi giữa các loài khác nhau trung bình là 8,6% (từ 0% -68%) [25]

Việc xác định các "Shihu" bắt nguồn từ Dendrobium nobile Lindley (Orchidaceae),

D chrysotoxum Lindley, D fimbriatum Hooker, và có quan hệ gần gũi với loài Dendrobium Sw , mức độ biến đổi trung bình giữa các loài khác nhau là: 12,4%,

trong khi trong nội bộ loài là khoảng 1% [49]

Những ví dụ trên chứng minh ITS2 là một công cụ mạnh mẽ để xác định các loài thực vật và các loại thuốc thảo dược Mặc dù ITS và ITS2 có thể giúp xác định

các nguyên liệu thảo dược thuốc bằng cách giải trình tự ADN, các trình tự này đôi khi đòi hỏi phải được nhân lên thành công vì sự hiện diện của nhiều bản sao trong

hệ gen và vấn đề về cấu trúc bậc hai khiến kết quả giải trình tự có chất lượng kém Hơn nữa hiện tượng nhiễm nấm xảy ra phổ biến ở nguyên liệu thảo dược do

quy trình tiến hành và lưu trữ không đúng cách và trình tự ITS ở nấm lại dễ dàng

được khuếch đại bằng cách sử dụng cặp mồi phổ biến, tạo ra kết quả PCR dương tính Để khắc phục vấn đề này, cần thiết kế các căp mồi đặc hiệu dùng cho thực vật

Maturase K trình tự này đã thành công trong việc xác định các loại thuốc

thảo dược "Dahuang" có nguồn gốc từ Rheum palmatum L (Polygonaceae), R

tanguticum (Maxim ex Regel) Maxim ex Balf, R officinale Baill., và loài gần gũi Rheum L với mức độ biến đổi nội bộ loài và giữa các loài khác nhau là cao [81]

Vì vậy, nó thường được sử dụng để xác định các nguyên liệu thảo dược ở những vị

trí địa lý khác nhau Trình tự matK đã xác định được các loài được gọi là

"Heshouwu" (Fallopia multiflora (Thunb.) Moldenke; Polygonaceae) và

"Shechuang"(Cnidium monnieri (L.) Cusson ex Juss.; Apiaceae.) ở những vị trí địa

lý khác nhau [80] Ngoài ra, vùng gen matK còn được sử dụng để dự đoán nguồn gốc của các loài được sử dụng để tạo nên "Chuanxiong" ở Trung Quốc (Ligusticum

chuanxiong hort ex S H ; Apiaceae) và tại Nhật Bản (Cnidium officinale Makino;

Apiaceae) MatK cũng khác nhau đủ để phân biệt "Sanqi" (Panax notoginseng

(Burkill) F H Chen; Araliaceae) ở những vùng địa lý khác nhau, nhưng nó lại thất

bại trong việc phân biệt các giống cây trồng [84] Mặc dù các matK là hữu ích trong

việc nhận dạng loài nhưng việc khuếch đại trình tự này còn gặp nhiều khó khăn, cần phải hoàn thiện và tối ưu thêm [28]

trnH-psbA cho thấy tỷ lệ khuếch đại thành công cao nhất (100%) và tỷ lệ sai

khác là 83% trong số chín locus thử nghiệm, bao gồm cả ITS, rbcL và matK [44] Vì vậy, trnH - psbA được coi như 1 trình tự hữu ích để phân biệt các loài thảo mộc với loài giả mạo nó Nó được dùng để phân biệt loài giả mạo Shihu Bulbophyllum

odoratissimum (Sm.)Lindl ex Hook.f (Orchidaceae) có nguồn gốc từ loài Dendrobium Sw với tỷ lệ sai khác trong trình tự là từ 2% đến 3,1% [83] Gần đây, trnH-psbA được sử dụng để phân biệt các loại thảo dược chống ho "Madouling" có

nguồn gốc từ Aristolochia contorta Bunge (Aristolochiaceae) và A debilis Siebold

& Zucc và nghiên cứu này đã phát hiện ra hai mẫu Madouling từ Đài Loan và Vân

Nam (Trung Quốc) đều có chứa loài Cardiocrinum (Endl.) Lindl (Liliaceae) thay thế cho dược liệu gốc Trong khi mẫu từ Quảng Đông và Cam Túc (Trung Quốc) là

mẫu Madouling chính xác [55] Một nhược điểm của trnH-psbA là nó không tạo ra trình tự có 2 chiều rõ ràng [28] Sự hiện diện của đoạn poly-A/T trong trình tự trnH

-psbA làm giảm tỷ lệ thành công giải trình tự ADN Ngoài ra, việc thêm bớt các

nucleotide thường xuyên xảy ra trong khu vực này gây khó khăn cho việc điều

chỉnh trình tự, do vậy việc biên tập, chỉnh sửa bằng tay được ưu tiên hơn

Tiểu đơn vị lớn của ribulose-bisphosphate carboxylase-rbcL trình tự này có

chất lượng cao khi làm thử nghiệm trên 7 locus [28] Tuy nhiên, rbcL cho thấy sự

khác biệt thấp nhất (0,83%) trong số 11 locus mã vạch tiềm năng được thử nghiệm

cho thí nghiệm phân biệt hai loài trong họ Solanaceae là Atropa belladonna L và

Nicotiana tabacum L [44] Tuy mức độ biến đổi thấp giữa các loài khác nhau

nhưng rbcL vẫn cho phép nhận biết được nguyên liệu thảo dược với loại giả mạo nó (Ví dụ, có chưa đến 21 vị trí thông tin trong trình tự 1374 bp của "Gancao" có nguồn gốc từ bảy loài Glycyrrhiza L (Fabaceae) Thảo dược dương xỉ

"Mianmaguanzhong" có nguồn gốc từ Dryopteris crassirhizoma Nakai (Dryopteridaceae) có 19 nucleotide là đa hình trong trình tự rbcL khi đối chiếu với loài giả mạo [85]) Sự biến đổi ở mức độ thấp trong trình tự rbcL là một trở ngại lớn

cho việc xác định các thuốc thảo dược có quan hệ gần gũi với nhau Thú vị ở chỗ

bằng cách sử dụng kết hợp trình tự rbcL với trnH-psbA lại đạt kết quả cao nhất

trong việc phân biệt và xác định loài Chính vì vậy, có thể coi đây là một công cụ

quan trọng trong việc nhận dạng, phân biệt các loài [45]

trnL- trnF: gần đây, trnL-trnF được sử dụng để xác định các loài trong thảo

dược "Madouling", nó có thể tách Cardiocrinum giganteum (Wall.) Makino (Liliaceae) từ biến thể của nó là C giganteum var yunnanense (Leichtlin ex Elwes) Stearn và loài có quan hệ chặt chẽ với nó C cordatum (Thunb.) Makino [54] Khả năng trnL-trnF phân biệt được các loài có thể chỉ ở mức độ vừa phải ở những

trường hợp khác nhau Ví dụ, khu vực này đã được sử dụng để phân Atractylode

chinensis (Bunge) Koidz (Asteraceae) với A koreana (Nakai) Kitam và A macrocephala Koidz nhưng nó không phân biệt A lancea (Thunb.) DC với A japonica Koidz Ex Kitam [26] Ngoài ra, các loài của dược liệu "Fanlu" (Vill Stellaria (L) Vill., "Rougui" (Cinnamomum cassia Nees ex Blume; Lauraceae) và

các loài có mối quan hệ gần gũi cũng không được phân biệt rõ ràng khi sử dụng

vùng này [42]

5S rDNA: là một trong những vùng biến đổi thường được sử dụng để nhân

dạng các nguyên liệu thảo mộc 5S rDNA đã được sử dụng để phân biệt "Muxiang "

và loài Epimedium L (Berberidaceae) [15] Mặc dù 5S rDNA có mức độ biến đổi

cao và có khả năng phân biệt tốt nhưng một vấn đề quan trọng là khu vực này có nhiều bản sao, ngoài ra mức độ biến đổi trình tự này giữa các loài khác nhau và trong nội bộ loài là cao khiến cho việc sắp xếp và so sánh các trình tự trở nên khó khăn Đây cũng chính là nhân tố khiến 5S rDNA chưa đủ để trở thành mã vạch

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu thực vật

Các mẫu thực vật được sử dụng trong nghiên cứu do Khoa Tài nguyên Dược

liệu (Viện Dược Liệu, Bộ Y tế) cung cấp Các mẫu thực vật Codonopsis ẩn danh

loài được thu thập ở nhiều địa điểm khác nhau trên cả nước Các mẫu sau khi thu được đựng trong túi nilon có chứa silicagel và giữ ở nhiệt độ phòng cho đến khi sử dụng

Bảng 4 Địa điểm thu mẫu và thông tin mẫu sử dụng trong nghiên cứu Chi thực vật Nhóm mẫu Địa điểm thu mẫu Kí hiệu mẫu

Codonopsis

Đảng Sâm vỏ trắng

Thôn I, xã Hòa Bình, TP Kontum

C11; C12

Codonopsis sp Lô trồng T, Đa Sal, Lạc Dương,

Lâm Đồng

C13; C14; C15

Dương, Lâm Đồng

C16; C17; C18

-Bộ kit tách chiết ADN tổng số DNeasy® Plant Mini Kit của hãng Qiagen,

và các hóa chất tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp mini-CTAB Bộ hóa chất PCR và hóa chất sử dụng trong điện di

-Các cặp mồi sử được sử dụng để nhân các vùng gen nghiên cứu

-Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR: GeneJET® PCR Purification Kit của Fermentas