2.2.1. Tách chiết ADN tổng số
Các mẫu thực vật được tách chiết lấy ADN tổng số bằng quy trình mini- CTAB, gồm các bước cơ bản sau:
Bước 1: Cân 100mg mẫu đã nghiền thành dạng bột mịn vào ống eppendorf 1.5ml.
Bước 2: Bổ sung 900µl đệm CTAB 2%, dùng đũa thủy tinh nghiền nhẹ mẫu trog 3-5 phút. Sau đó ủ mẫu ở 65oC trong bể ổn nhiệt trong vòng 90 phút, cứ 10 phút đảo mẫu một lần
Bước 3: Làm nguội về nhiệt độ phòng , bổ sung 450µl chlorofom/ isoamylalcohol ( tỷ lệ V : 24/1) , đảo nhẹ đầu 2 ống để trộn đều , để trong nhiệt độ phòng 10p.
Bước 4: Ly tâm mẫu ở 4o
C với tốc độ 10000v/p trong vòng 10p, lấy mẫu ra đặt trong hộp đá.
Bước 5: Dùng miệng tip đầu rộng (1000µL) hút từ từ dịch phía trên và chuyến sang ống eppendorf 1,5ml mới sạch.
Bước 6: Bổ sung 600µL isopropanol vào mỗi ống, làm đều bằng việc đảo đều 2 đầu ống và ủ ở 40
C trong 24 giờ.
Bước 7: Sau 24h, đem mẫu ra ly tâm ở 10000v/p trong 10p,đặt mẫu trong hộp đá
Bước 8: Hút bỏ phần dịch phía trên và rửa ADN tủa bằng 800 dung dịch Wash 1 trong 5p.
Bước 9: Ly tâm mẫu ở 10000v/p trong 10p,tiếp tục rửa tủa sau khi hút bỏ dịch phía trên bằng 100µl dung dịch Wash II trong 5p.
Bước 10: Ly tâm lạnh thu lại tủa ở 40C 10000v/p trong 5p,để tủa khô tự nhiên trong tủ cấy.
Bước 11: Hòa tan ADN tủa trong 100µl đệm TE và bảo quản ở 40
C.
2.2.2. Kiểm tra sản phẩm ADN sau tách chiết
ADN tổng số của các mẫu thực vật sau khi tách chiết sẽ được điện di trên gel agarose 1%, trong đệm TBE 1X, ở hiệu điện thế 90V và được so sánh với thang chuẩn là marker 1kb để kiểm tra chất lượng.
Nồng độ và độ tinh sạch của ADN tổng số được kiểm tra qua phương pháp đo mật độ quang phổ hấp phụ ở bước sóng 260 và 280nm. Pha loãng dịch chiết 100 lần (5µl mẫu + 450µl DDW), mỗi mẫu đo ba lần và giá trị trung bình của ba lần đo được lấy làm kết quả cuối cùng. Độ tinh sạch của mẫu thể hiện qua thông số
A260/280, thông thường A260/280=1,6-2.0 được coi là mẫu tinh sạch, nồng độ ADN của mẫu được tính thông qua giá trị 1,0A260=50µg/µl.
2.2.3. Phƣơng pháp nhân bản gen đích bằng kỹ thuật PCR
Thể tích mỗi phản ứng PCR của mỗi mẫu là 25µl, được thực hiện trên máy PCR 9700. Quy trình nhiệt để nhân bản các đoạn gen đích được tóm tắt ở Bảng 6. Thể tích cụ thể của các thành phần trong một phản ứng PCR được thể hiện ở Bảng
7 và Bảng 8. Bảng 6. Thành phần của phản ứng PCR STT Thành phần Nồng độ Thể tích (µl) 1 dd H2O 12.75 2 Tag buffer 10X 2.5 3 MgCl2 25mM 2.0 4 DNTPs 10mM 2.5
5 Mồi xuôi 10pmol 1.0
6 Mồi ngược 10pmol 1.0
7 Tag DNA polymerase 1u/µl 0.25
8 ADN khuôn 3
9 Tổng thể tích 25
Bảng 7. Chu trình nhiệt cho gen ITS
Bước Nhiệt độ(o
C)
Thời gian Chu kỳ Khởi động 94 4p 1 Biến tính 94 40s 35 Gắn mồi 55 1p Kéo dài 72 1p Ổn đinh 72 7p 1 Bảo quản 4 ∞
Bảng 8. Chu trình nhiệt cho gen matK
Bước Nhiệt độ(o
C)
Thời gian Chu kỳ Khởi động 94 60s 1 Biến tính 94 30s 35 Gắn mồi 52 20s Kéo dài 72 50s Ổn đinh 72 5p 1 Bảo quản 4 ∞
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự
Sản phẩm sau khi được khuyếch đại bằng phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% trong đệm TBE 1X, cùng với thang chuẩn marker 100 bp để so sánh kích thước đoạn nhân. Những sản phẩm được khuyếch đại thành công sẽ được tinh sạch bằng kit GeneJET® PCR Purification Kit của Fermentas. Các bước tinh sạch thực hiện như sau:
Bước 1: thêm một tỉ lệ thể tích là 1:1 của Buffer Binding vào hỗn hợp PCR để được một dung dịch hoàn chỉnh (ví dụ cho mỗi 100µl của hỗn hợp phản ứng, thêm 100µl Buffer Binding). Trộn kỹ và đều. Kiểm tra màu sắc của dung dịch: màu vàng thể hiện một pH tối ưu cho sự cố định ADN. Nếu màu sắc của dung dịch có màu cam hoặc tím, thêm 10µl dung dịch acetate 3M, pH 5.2 và mix, màu sắc của hỗn hợp sẽ trở thành màu vàng.
Bước 2: chuyển tối đa 800µl dung dịch từ bước 1 vào cột GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ các dung dịch thông qua cột. Lưu ý: nếu tổng khối lượng vượt quá 800µl, dung dịch có thể được thêm vào các cột thành từng giai đoạn. Sau khi bổ sung 800µl dung dịch, ly tâm cột 30-60s và loại bỏ dòng chảy thông qua. Lặp lại cho đến khi toàn bộ dung dịch đã được thêm vào màng cột.
Bước 3: thêm 700µl Wash Buffer (đã được thêm Ethanol) vào cột lọc GeneJET ™. Ly tâm 30-60s. Loại bỏ các lưu lượng thông qua cột và đặt các cột lọc trở lại vào ống thu.
Bước 4: Ly tâm cột GeneJET ™ trống thêm 1 phút để hoàn toàn loại bỏ phần đệm rửa còn sót lại. Lưu ý: bước này là điều cần thiết vì ethanol còn sót lại trong mẫu DNA có thể ức chế các phản ứng sau đó.
Bước 5: chuyển cột GeneJET ™ tới một ống 1,5 ml sạch (không kèm theo trong bộ kit). Thêm 50µl Elution buffer đến trung tâm màng của cột GeneJET ™ và ly tâm trong 1 phút.
Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch sẽ được gửi đi giải trình tự tại hãng Bioneer tại Hàn Quốc.
2.2.5. Phƣơng pháp phân tích số liệu
Phát sinh loài phổ biến nhất là xây dựng lại bằng cách sử dụng các trình tự sinh học phân tử (DNA, RNA, hay axit amin) ở các gen cụ thể hoặc vùng không mã hóa của DNA. Hầu hết các công cụ đưa ra để tái dựng lại sự phát sinh loài bằng việc hình thành nên các cây, nó được sử dụng rộng rãi và được chấp nhận là cây đơn giản hóa lịch sử tiến hóa của nhiều nhóm cơ thể, nổi bật nhất là vi khuẩn (vì chuyển gen ngang) và thực vật (vì sự hình thành những loài lai).
Phương pháp Maximum Parsimony có lẽ là phương pháp tái xây dựng lại phát sinh loài dựa trên trình tự được sử dụng rộng rãi nhất[57]. Trong phân tích phát sinh loài, vấn đề của MP là tìm một cây phả hệ giải thích một tập hợp của các chuỗi liên kết bằng cách sử dụng một số lượng tối thiểu của "sự kiện tiến hóa" [33]. Trong nghiên cứu này, để xây dựng cây phát sinh chủng loại chúng tôi sử dụng phương pháp tiết kiệm tối đa với các tùy chỉnh bước đầu với 100 taxon ngẫu nhiên được thêm lặp lại, sử dụng phương pháp hoán đổi cât TBR (Tree Bisection Reconection) , không chọn giới hạn trên cho số cây tối đa ghi nhớ. Chỉ số tin cậy bootstrap (BP) áp dụng là 500 và 100 taxon ngẫu nhiên được thêm lặp lại.[50], [51]. Cây phát sinh cũng được xây dựng theo phương pháp Bayesian, với phương pháp này, để xác định mô hình tiến hóa phù hợp, chúng tôi sử dụng phần mềm Modeltest v3.7 và các chỉ số được xác định bởi phần mềm MrBayes v3.1. Phân tích được thực hiện với việc bắt đầu từ một cây ngẫu nhiên và chạy trong 5x106 thế hệ. Bốn mô hình Markov chains, một nóng và ba lạnh (giá trị mặc định) được lấy mẫu sau mỗi 1000 thế hệ. Hai phân tích đồng thời sẽ được tiến hành song song. Sau phân tích, cần xác định các điểm lấy mẫu, mà tại đó biểu đồ Markov chains bắt đầu ổn định, các cây ở trước thời điểm lấy mẫu này sẽ được loại bỏ.
Nhóm ngoài (Outgroup) được chúng tôi lựa chọn cho cả 2 phương pháp là
Cyananthus lobatus và Campanula peregrina. Đây là 2 nhóm có quan hệ khá gần với chi Codonopsis. Đồng thời, các nhóm ngoài này cũng đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây [75]. Mã số của hai loài dùng làm outgroup và mã số của các loài thuộc chi Codonopsis trên GenBank được chúng tôi thống kê ở phần Phụ lục 1.
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tách chiết ADN tổng số
Chúng tôi đã tách chiết thành công 12 mẫu Codonopsis (xem Bảng 9). Tất cả các mẫu đều được tách riêng phần lá và thân nhằm mục đích xác định bộ phần nào cho hiệu suất thu hồi ADN tổng số là tốt nhất, kết quả điện di cho thấy, các mẫu lá cho kết quả tốt hơn với băng ADN tổng số, còn các mẫu thân thường cho băng mờ hoặc ở dạng vệt mờ.
Ban đầu các mẫu được tách chiết theo quy trình mini-CTAB và đã thu hồi được ADN tổng số, tuy nhiên do đặc tính của các mẫu thực vật có chứa thành phần các hợp chất thứ sinh rất lớn, khiến cho dung dịch ADN tổng số lẫn nhiều tạp chất, dung dịch thường có độ nhớt rất cao, co cụm lại với nhau và có màu (vàng hoặc nâu đen), hơn nữa phương pháp này tiêu tốn khá nhiều thời gian, 2 ngày để tách chiết và thu hồi được ADN. Nhằm tiết kiệm thời gian và để thu hồi được dung dịch ADN tổng số tinh sạch hơn, tránh ảnh hưởng đến phản ứng PCR sau này, chúng tôi thực hiện tách chiết ADN tổng số bằng kit DNeasy® Plant Mini Kit của Qiagen. Dung dịch ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%.
Hình 5. Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu Codonopsis trên gel agarose 1%, marker 1kb
Trên ảnh điện di, tất cả các mẫu đều quan sát được băng ADN tổng số với kích thước như lý thuyết, vào khoảng 10kb, các băng rõ nét chứng tỏ nồng độ ADN thu được khá cao.
Để xác định hàm lượng và độ tinh sạch, ADN tống số được đo mật độ quang phổ (OD) ở bước sóng 260nm và 280nm.
Bảng 9. Kết quả đo OD một số mẫu nghiên cứu
Mẫu A260/280 [ADN] µg/µl C2 1,50 86,2 C4 1,63 108,9 C11 1,52 85,1 C12 1,61 121,5 C13 2,00 170,6 C14 1,96 98,8 C15 2,00 170,6 C16 2,00 229,0 C17 1,95 191,3 C18 1,9 107 C20 1,85 84,5 C21 1,87 81,0
Kết quả đo OD cho thấy, các mẫu có tỉ số A260/280 trong khoảng từ 1.5-2, như vậy mẫu ADN đủ độ tinh sạch để thực hiện phản ứng PCR. Hàm lượng mẫu đạt từ 80-200 µg/µl, một vài mẫu có nồng độ ADN tương đối thấp hơn, hoặc có chỉ số OD nằm ngoài vùng 1.8-2.0 phản ánh bản chất của các mẫu khác nhau là khác nhau.
3.2. Khuyếch đại vùng gen nghiên cứu bằng kỹ thuật PCR
Hai cặp mồi ITS và matK được sử dụng để khuyếch đại hai vùng gen tương ứng trên 12 mẫu Codonopsis. Theo lí thuyết, hai cặp mồi sẽ nhân được hai đoạn gen tương ứng khoảng 900bp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%.
Kết quả thu được như sau: chúng tôi đã nhân thành công 11/12 mẫu
Codonopsis với gen ITS (Hình 6), 10/12 mẫu Codonopsis với gen matK (Hình 7). Tất cả các mẫu đều nhân được đoạn gen với kích thước như dự đoán, các băng sáng rõ, không có băng phụ, đạt tiêu chuẩn để giải trình tự.
Hình 6. Ảnh điện di một số sản phẩm PCR khuyếch đại vùng gen ITS của mẫu
Codonopsis trên gel agarose 1%, M: marker 100bp
Hình 7. Ảnh điện di sản phẩm PCR nhân đoạn gen matK của mẫu Codonopsis
trên gel agarose 1%, M: marker 100bp 3.3. Phân tích kết quả
Các chuỗi DNA được so sánh và liên kết với nhau bằng chương trình BioEdit trình (phiên bản 4.1.4) và tiếp tục được xác minh, so sánh với các trình tự khác bằng cách sử dụng công cụ BLAST trong trang web của Trung tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ sinh học (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ blast.cgi). So sánh toàn bộ trình tự của các mẫu nghiên cứu và các mẫu trên GenBank bởi phần mềm ClustalW (version 2.1). Cây phát sinh được xây dựng dựa trên trình tự ADN của vùng gen ITS và gen matK bằng phương pháp tiết kiệm tối đa
(MP) và Bayesian trên phần mềm PAUP (version 4.0 beta 10). Trình tự vùng gen
ITS và matK của các mẫu Codonopsis mà chúng tôi nghiên cứu được trình bay ở phần Phụ lục 2
3.3.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên các vùng gen nghiên cứu nghiên cứu
3.3.1.1. Phân tích sự đa hình trình tự ADN trên gen ITS
Vùng ITS (Internal Transcribed Spacers) là một vùng mã hóa cho một đoạn ARN không đóng vai trò chức năng nằm trong vùng mã hóa cho các ARN ribosome nhân. Vùng ITS dài khoảng 655 bp gồm ba phần: vùng ITS1 nằm giữa vùng 16S và 5.8S có kích thước khoảng 255-261 bp, vùng 5.8S dài khoảng 164 bp và vùng ITS2
nằm giữa vùng 5.8S và 28S khoảng 216-233 bp. Trong quá trình chế biến rARN thành dạng trưởng thành, các vùng ITS1 và ITS2 sẽ bị cắt bỏ khỏi ARN và nhanh chóng bị phân hủy. Do thiết kế cặp mồi nhân vùng gen này, chúng tôi thu được trình tự dài khoảng 850-900 bp gồm một phần trình tự của vùng cuối 18S và đầu 26S. Tuy nhiên, chúng tôi chỉ phân tích đoạn trình tự có chiều dài khoảng 650 bp, tương ứng với trình tự ADN của vùng gen ITS đã được công bố trên GenBank.
Align trình tự ADN vùng gen ITS của 12 mẫu nghiên cứu cùng với 10 trình tự ADN vùng gen ITS của các loài thuộc chi Codonopsis đã được công bố trên GenBank bằng phần mềm Bioedit, cho thấy chiều dài vùng ITS giữa các loài dao động từ 638 đến 650 bp, GC trong vùng này khoảng từ 60,3% đến 62,5%, có 113 điểm sai khác giữa các loài, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự, trong đó có 51 sai khác được tìm thấy ở vùng ITS1, 8 điểm ở vùng 5.8S và 53 điểm ở vùng ITS2. Số lượng các sai khác và phần trăm khả năng nhận dạng của gen ITS được thể hiện ở
Bảng 11, trong đó sai khác trong nội loài từ 0,0-0,2%, sai khác giữa các loài khác
nhau đạt đến 15,4%. Có thể thấy sự đa hình trong trình tự nucleotid ở vùng ITS1 và
ITS2 là rất cao, tại đây xảy ra các biến đổi lớn như thêm hoặc mất một đoạn nucleotide, số lượng các biến đổi này nhiều hơn nhiều so với vùng 5.8S, hay có thể nói vùng 5.8S với chiều dài trung bình khoảng 164 bp là vùng bảo thủ cao, với sự
biến đổi rất ít trong trình tự ở tất cả các loài, điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu trước đó [31].
Trong các mẫu nghiên cứu, mẫu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 có trình tự tương đồng hoàn toàn 100% với trình tự ADN của loài C. javanica trên GenBank, với GC chiếm 62,5% trên vùng ITS có chiều dài 638 bp, mẫu C4 có trình tự tương đồng hoàn toàn với trình tự ADN của loài C. tangshen
trên GenBank, với GC chiếm 60,3% trên vùng ITS dài 650 bp (sự sai khác trình tự nucleotide giữa các loài được trình bày ở Bảng 10). Như vậy, dựa vào phương pháp so sánh trình tự gen ITS, đã có thể nhận diện được đến loài của các mẫu nghiên cứu, đồng thời góp phần khẳng định thêm vùng gen ITS là một mã vạch ADN tiềm năng cho nhận diện loài.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
Bảng 10. Bảng thống kê các điểm sai khác trong trình tự ADN giữa các loài Codonopsis trên vùng gen ITS
Loài
Vị trí các điểm đa hình trên trình tự vùng gen ITS
9 28 36 41 44 45 54 68 75 76 77 78 81 82 83 86 90 95-98 103 107-110 114 115 118 1 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A C 2 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A T 3 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A T 4 C C C C T G C C T C G G C G C G A ACCA G TAGG C G T 5 C C C C G G C C T C G G C A C A G ACCA G AAGG C A T 6 C G C T G A C C T C A A T G C G G ACCA G CAGA T G T 7 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A C 8 C C T C G G A T T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A C 9 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A T 10 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 11 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 12 C C C C G G C C T C G G C A T A G ACCA G AAGG C A T 13 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 14 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 15 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 16 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C 17 A C C C G G C C C T G G T G C G A ---- C ---- C A C