Chúng tôi sử dụng phương pháp Parsimony và Bayesian để xây dựng cây phát sinh chủng loại cho các mẫu nghiên cứu trên từng khung đọc gen ITS và matK
Cây phát sinh chủng loại xây dựng được bằng phương pháp MP trên gen ITS
Hình 8. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên khung đọc gen ITS, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93
Cây phát sinh xây dựng bằng phương pháp MP trên khung đọc gen ITS gồm hai nhóm chính, với bootrap rất cao 91%, có thể gọi tên như sau:
- Nhóm I bao gồm: C. pillosula, C. modesta, C. nervosa, C. tangshens, C. lanceolata, C. kawakamii, C. clematidea và mẫu C4
- Nhóm II gồm loài C. javanica và các mẫu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20 và C21.
Các mẫu nghiên cứu có mặt ở cả hai nhóm, tuy nhiên phần lớn các mẫu tập trung ở nhóm II. Cây chủng loại phát sinh cho thấy chỉ có một mẫu nghiên cứu là C4
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
nằm trong nhóm I, cùng nhánh với C. tangshen, với chỉ số bootrap là 65%, còn lại các mẫu đều nằm ở nhóm II, cùng nhánh với C. javanica với chỉ số bootstrap rất cao 100%, điều này phù hợp với kết quả phân tích tính đa dạng trong trình tự vùng gen ITS
của các loài ở trên:trình tự của mẫu C4 tương đồng 100% với trình tự của loài C. tangshen, trình tự các mẫu nghiên cứu còn lại tương đồng 100% với mẫu C. javanica. Cùng với kết quả so sánh trình tự ở trên, có thể xác định các mẫu nghiên cứu: C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C. javanica, mẫu C4 thuộc loài C. tangshen.
Hình 9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp MP chạy trên khung đọc gen matK, bootstrap 500 TL: 249 CI: 0.92 RI: 0.93
Các mẫu nghiên cứu có phân bố không đổi trên cây phát sinh chủng loại được xây dựng dựa trên gen matK, ở nhóm II với bootrap của nhánh là 98%, bao gồm các mẫu nghiên cứu: C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21, trong nhóm có sự phân nhánh nhỏ hơn giữa các mẫu nghiên cứu, có thể nói gen matK có khả
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
năng phân tách tốt hơn gen ITS, và có thể có các tồn tại dưới loài của loài C. javanica. Vì số lượng gen matK của chi Codonopsis được công bố trên GenBank ít hơn nhiều so với gen ITS, do vậy cây phát sinh chủng loại dựa trên gen matK không được đầy đủ các loài như với gen ITS, và không có trình tự của loài C. tangshen có trình tự tương đồng 100% về gen ITS với mẫu C4 cũng như trình tự của loài C. javanica tương đồng 100% về gen ITS với các mẫu nghiên cứu còn lại của chúng tôi. Tuy nhiên, mẫu C4 vẫn nằm trong nhóm I, và cùng nằm trong một nhánh gần nhất tương ứng giống cây chủng loại phát sinh chạy trên gen ITS, cụ thể C4 cùng nhánh với C. kawakamii với bootstrap hơn 80%.
Cây phát sinh chủng loại thu được khi chạy bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc riêng rẽ vùng gen ITS và matK
Hình 10. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
Hình 11. Cây phát sinh chủng loại xây dựng bằng phƣơng pháp Bayesian trên khung đọc gen matK, chọn mẫu cách 1000 thế hệ, phân tích trong 5x106 thế hệ
Ở cây phát sinh chủng loại thu được bằng phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS, mẫu C. clematide và C. lanceolata không nằm trong nhánh I nữa, mà cùng chung nhánh phát sinh với nhóm I và nhóm II, với chỉ số posterior probability (PP) thấp 50%. Tuy nhiên, ở hai nhánh I và II, cây phát sinh chủng loại ở các nhánh là tương đồng với cây phát sinh chủng loại trên khung đọc gen ITS, trong đó mẫu C4 cùng nhánh với mẫu C. tangshen với chỉ số PP là khá cao 97 %, các mẫu còn lại cùng nhánh với C. javanica với PP là 87%. Điều này cho thấy, cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Bayesian trên khung đọc gen ITS vẫn chỉ ra rằng các mẫu nghiên cứu có quan hệ gần gũi với loài C. tangshen và C. javanica, tuy nhiên, có thể dữ liệu trên vùng gen ITS chưa đủ để phương pháp Bayesian phân tách loài C. clematide và C. lanceolata và các nhánh với chỉ số PP tin cậy hơn.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
Cây phát sinh thu được theo phương pháp Bayesian dựa trên khung đọc gen
matK hoàn toàn tương đồng với cây phân loại thu được dựa theo phương pháp MP. Cụ thể, mẫu C4 cùng nhánh với mẫu C. kawakamii với PP là 100%, các mẫu còn lại nằm ở nhánh II với chỉ số của nhánh là 100%, trong nhóm II tồn tại các dưới loài với chỉ số PP cao, lần lượt là: nhánh C11, C12, C18 là 99%; C14, C15, C16, C17 là 74%, và của nhánh C2, C21 là 100%. Điều này khẳng định lại một lần nữa, gen matK có khả năng phân tách tốt hơn vùng gen ITS, có thể sử dụng gen này để xác định các dưới loài.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
Từ các kết quả thu được, chúng tôi đưa ra một số kết luận chính như sau:
1. Đã khuếch đại thành công hai vùng gen ITS và matK, và kết quả phân tích sự đa hình trên mỗi vùng gen cho thấy vùng gen ITS kích thước từ 638-650 bp xuất hiện 113 điểm đa hình, chiếm 17,4% trên toàn bộ trình tự vùng gen, có độ đa hình cao hơn so với gen matK kích thước 871 bp với 61 điểm đa hình xuất hiện, chiếm 7% trên toàn bộ trình tự.
2. Từ kết quả so sánh và phân tích trình tự ADN vùng gen ITS có thể xác định các mẫu nghiên cứu C2, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C20, C21 thuộc loài C. javanica và mẫu C4 thuộc loài C. tangshen.
3. Với sự tương đồng 100% trong trình tự, vùng gen ITS là rất bảo thủ ở loài C. javanica và C. tangshen, rất có ý nghĩa trong kiểm định dược liệu.
4. Xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên phương pháp Tiết kiệm tối đa (Maximum Parsimony) và Bayesian dựa trên khung đọc riêng rẽ từng gen ITS và matK
cho kết quả tương đồng, cho thấy độ đáng tin cậy của cây thu được cũng như của 2 phương pháp MP và Bayesian sử dụng để xây dựng cây chủng loại phát sinh trong chi (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Codonopsis. Các cây phân loại xây dựng được cho kết luận xác định các mẫu nghiên cứu thuộc hai loài C. javanica (đối với các mẫu C2 thu được ở, C11, C12 thu được ở Kon Tum, mẫu C13, C14, C15, C16, C17, C18 thu được ở Lạc Dương, Lâm Đồng và các mẫu C20, C21 thu được ở xã Long Hẹ, Sơn La) và C. tangsheng (đối với các mẫu C4 thu được ở Sa Pa, Lào Cai).
5. Kết quả phân tích trình tự ADN và cây phát sinh chủng loại cho kết luận vùng gen matK có khả năng phân biệt tốt hơn vùng gen ITS, vùng gen matK có thể được sử dụng để phân biệt các dưới loài của chi Codonopsis.
6. Nghiên cứu này lần đầu tiên ứng dụng mã vạch ADN trong phân tích đa dạng di truyền các loài Codonopsis ở Việt Nam, và cùng các kết quả nghiên cứu trước đây trên thế giới khẳng định vùng gen ITS và matK có thể giúp nhận diện loài và dưới loài như một mã vạch phân tử, đồng thời công nghệ này có thể được dùng cho các nghiên
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
cứu tiếp theo về tiến hóa học phân tử và nghiên cứu bảo tồn nguồn gen của loài dược liệu quý.
Kiến nghị
1. Tiếp tục thu thập thêm các mẫu thuộc chi Codonopsis để đánh giá toàn diện hơn nữa tính đa dạng và phân bố của chi này ở Việt Nam
2. Nghiên cứu và ứng dụng các mã vạch phân tử này cho các nguồn dược liệu quý khác ở Việt Nam
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Võ Văn Chi (1999), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học.
2. Viện Dược Liệu (2003), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Giáo Dục.
3. Huỳnh Thị Thu Huệ, Nguyễn Đăng Tôn, Cao Xuân Hiếu, Nguyễn Thùy Dương, Lê Thị Thu Hiền, Trần Thị Phương Liên, Đặng Văn Hạnh, Lã Đình Mỡi, Lê Trần Bình, Nông Văn Hải (2003), “Tách dòng và xác định trình tự gen 18S rRNA của cây Bình vôi”, Tạp chí Công nghệ SInh học, 1, pp. 203-209. 4. Đỗ Bích Huy (1993), Tài nguyên cây thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật. 5. Đỗ Tất Lợi (1999), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học.
6. Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử và tế bào, NXB Đại học Quốc Gia Hà Nội.
7. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thúy Hạnh, Trần Quốc Trọng (2007), “Kết quả sử dụng một số chuỗi gen lục lạp trong nghiên cứu đa dạng di truyền và xuất xứ cây lâm nghiệp”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5, pp. 77-83.
Tiếng Anh
8. A., H.R. (2005), “Medicinall plants: historical and cross-cultural usage patterns”, AEP, 15, pp. 686-699.
9. Albach D. C., L.H.Q., Zhao N., Jensen S. R. (2007), “Molecular systematics and phyotchemistry of Rehmannia (Scrophulariaceae)”, Biochem Syst Ecol, 35, pp. 293-300.
10. Alvarez I., W.J.F. (2003), “Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp. 417-434.
11. B., H.M. (1999), “Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation”, Molecular Ecology, 8, pp. 513- 525.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
12. Bailey C. D., C.T.G., Harris S. A., Hughes C. E. (2003), “Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 29, pp. 435-455.
13. Bartlett J, S.D. (2003), “A short history of the polymerase chain reaction”,
Humana Press Inc., pp. 1-6.
14. Bruni I., D.M.F., Galimberti A., Galasso G., Banfi E., Et Al. (2010), “Identification of poisonous plants by DNA barcoding approach”, International Journal of Legal Medicine 124, pp. 595-603.
15. Chen F., C.H.Y., Wong K. L. ,Wang J., Yu M. T., but P. P. H., Shaw P. C. and (2008), “Authentication of Saussurea lappa, an endangered medicinal material, by ITS DNA and 5S rRNA sequencing.”, Planta Medica, 74, pp. 889–892. 16. Chen S., Y.H., Han J., Liu C., Song J., Et Al. (2010), “Validation of the ITS2
region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species”, PLoS ONE 5: e8613.
17. Chiou S. J., Y.J.H., Fang C. L., Chen H. L., Lin T. Y. (2007), “Authentication of medicinal herbs using PCR-amplified ITS2 with specific primers”, Planta Medica, 1421-1426.
18. Chun-Feng Qiao, Q.-B.H., Zhi-Li Zhao, Zheng-Tao Wang, Luo-Shan Xu and Hong-Xi Xu (2009), “Sequence Analysis Based on ITS1 Region of Nuclear Ribosomal DNA of Amomum villosum and Ten Species of Alpinia”, Journal of Food and Drug Analysis, 17, pp. 142-145. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
19. Cuenoud P., S.V., Chatrou L. W., Et Al. (2002), “Molecular phylogenetics of Caryophyllales based on nuclear 18S rDNA and plastid rbcL, atpB, and matK
DNA sequences”, American Journal of Botany, 89, pp. 132-144.
20. Dj., C. (2000), “Plant macromolecular systematics in the past 50 years: one view”, Taxon, 49, pp. 479-501.
21. E., E. (2006), “Herbal medicines-they are popular, but are they also safe?”, Eur J Clin Pharmacol, 62, pp. 1-2.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
22. Fay M. F., S.S.M., Chase M. W. (1997), “Taxonomic affinities of Medusagyne oppositifolia (Medusagynaceae)”, Kew Bulletin, 52, pp. 111-120.
23. Fazekas A. J., S.R., Newmaster S. G., Hollingsworth P. M. (2010), “Stopping the stutter: Improvements in sequence quality from regions with mononucleotide repeats can increase the usefulness of non-coding regions for DNA barcoding”, Taãon, 59, pp. 694-697.
24. Gao T., S.Z., Yao H., Song J., Zhu Y., Et Al. (2011), “ Identification of Fabaceae plants using the DNA barcode matK”, Planta Medica, 77, pp. 92-94. 25. Gao T., Y.H., Song J., Liu C., Zhu Y., Et Al. (2010), “ Identification of
medicinal plants in the family Fabaceae using a potential DNA barcode ITS2”,
Journal of Ethnopharmacology, 130, pp. 116-121.
26. Ge Y. F., H.Y.Y., Xia B., Wei Y. L. (2007), “Sequencing of trnL-F and analysis of interspecific genetic relationship of five medicinal species in Atractylodes
DC.”, Journal of Plant Resources and Environment, 16, pp. 12-16.
27. Gonzalez M. A., B.C., Engel J., Mori S. A., Pe ´Tronelli P., Et Al. (2009), “Identification of Amazonian trees with DNA barcodes”, PLoS ONE, 4: e7483. 28. Group, C.P.W. (2009), “A DNA barcode for land plants”, Proceedings of the
National Academy of Sciences, 106, pp. 2794-12797.
29. Hebert P. D. N. , C.A., Ball S. L. , De Waard J. R. (2003), “Biological indentification through DNA barcodes”, Proc R Soc Lond B Biol Sci, 270, pp. 313-321.
30. Hilu K. W., L.H. (1997), “The matK gene: sequence variation and application in plant systematics”, American Journal of Botany, 84, pp. 830-839.
31. Hollingsworth Pm, G.S., Little Dp (2011), “Choosing and using a Plant DNA Barcode”, PLoS ONE, 6(5).
32. Hu Y, Z.Q., Xin H, Qin Lp, Lu Br, Rahman K Et Al. (2007), “Associtation between chemical and genetic variation of Vitex rotundifolia populations from different locations in China: ITS implication for quality control of medicinal plants”, Biomed Chromatogr, 21, pp. 967-975.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
33. Huson, D. (2007), Algorithms in Bioinformatics I, ZBIT pp.175-182.
34. J., S. (2001), “Biogcographic patterns and cryptic speciation in bryophytes”,
Journal of Biogcography, 28, pp. 253-261.
35. Jaakola L., S.M., Haggman H. (2010), “Novel approaches based on DNA barcoding and high-resolution melting of amplicons for authenticity analyses of berry species”, Food Chemistry, 123, pp. 494-500.
36. Jarman, S.N., Elliott, N. G. (2000), “DNA evidence for morphological àn cryptic Cenozoic speciations in the Anaspididae, "living fossils" from the Triassic”, J. Evol. Biol., 13, pp. 624-633.
37. Jhi., C. (2002), “Challenges and opportunities confronting the botanical dietary supplement industry”, J Nat Prod, 65, pp. 1073-1084.
38. Jones W. P., C.Y.-W., Kinghorn A. D. (2006), “The role of pharmacognosy in modern medicine and pharmacy”, Current Drug Targets, 7, pp. 247-264.
39. Karehed J., G.I., Dessein S., Motley T. J., Bremer B. (2008), “The phylogenetic utility of chloroplast and nuclear DNA markers and the phylogeny of the Rubiaceae tribe Spermacoceae”, Molecular Phylogenetics and Evolution, 49, pp. 843-866.
40. Kesanakurthi R. P., F.a.J., Burgess K. S., Percy D. M., Newmaster S. G., Et Al. (2011), “ Spatial patterns of plant diversity below ground as revealed by DNA barcoding”, Molecular Ecology, 20, pp. 1289-1302.
41. Koehn Fe, C.G. (2005), “The evolving role of natural products in drug discovery”, Nat Rev Drug Discov, 4, pp. 206-220.
42. Kojoma M., K.K., Yamada K., Sekita S., Satake M., Iida O. (2002), “Genetic identification of cinnamon (Cinnamomum spp.) based on the trnL–trnF chloroplast DNA”, Planta Medica, 68, pp. 94-96. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
43. Kress J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the non-coding trnH-psbA spacer region”, PLoS One, 6, pp. 1-10.
Luận văn Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Nga_K19
44. Kress, J.W., Wurdack, K . J. ,Zimmer, E. A. ,Weigt, L. A. & Janzen, D. H. (2005), “Use of DNA barcodes to identify flowering plants”, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 102, pp. 8369-8374.
45. Kress W. J., E.D.L. (2007), “A two-locus global DNA barcode for land plants: the coding rbcL gene complements the noncoding trnH–psbA spacer region”,
PLoS One, 2: e508.
46. L., H. Rare flowers and common herbal supplements get unmasked with plant DNA barcoding (reporting unpublished data of Damon Little and David
Baker). 2010 [cited; Available from:
http://www.scientificamerican.com/blog/post.cfm?id = rare-flowers-and-
common-herbal-supp-2010-04-18.
47. L., H.B. (2005), “The evolution of herbal medicine: behavioral perspectives”,
Anim Behav, 70, pp. 975-989.
48. Lahaye R., V.D.B.M., Bogarin D., Warner J., Pupulin F., Et Al. (2008), “DNA barcoding the floras of biodiversity hotspots”, Proceedings of the National Academy of Sciences 105, pp. 2923–2928.
49. Lau D. T., S.P.C., Wang J., but P. P. H. (2001), “Authentication of medicinal Dendrobium species by the internal transcribed spacer of ribosomal DNA”,
Planta Medica, 67, pp. 456-460.
50. Le, M., W.P. Mccord, and J.B. Iverson (2007), “On the paraphyly of the genus Kachuga (Testudines: Geoemydidae)”, Mol Phylogenet Evolution, 45(1), pp. 398-404.
51. Le, M., C.J. Raxworthy, W.P. Mccord, and L. Mertz (2006), “A molecular phylogeny of tortoises (Testudines: Testudinidae) based on mitochondrial and nuclear genes”, Mol Phylogenet Evolution, 40(2), pp. 517-531.
52. Li, M., H. Cao, P.P.-H. But, and P.-C. Shaw (2011), “Identification of herbal medicinal materials using DNA barcodes”, Journal of Systematics and