Phân tích đa dạng di truyền và khảo sát sự có mặt của các locus kháng rầy bằng chỉ thị isst và ssr (khóa luận tốt nghiệp)

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ KHẢO SÁT SỰ CÓ MẶT CỦA CÁC LOCUS KHÁNG RẦY BẰNG CHỈ THỊ ISSR VÀ SSR Hà Nội – 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - - KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ KHẢO SÁT SỰ CÓ MẶT CỦA CÁC LOCUS KHÁNG RẦY BẰNG CHỈ THỊ ISSR VÀ SSR Sinh viên : Ngô Thị Thu Trang MSV : 620467 Lớp : K62CNSHA GVHD : TS Đinh Trường Sơn Hà Nội - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp “Phân tích đa dạng di truyền khảo sát có mặt locus kháng rầy thị ISSR SSR” cơng trình nghiên cứu riêng hướng dẫn TS Đinh Trường Sơn Các nội dung, kết nghiên cứu đề tài hoàn toàn trung thực khách quan Các phần tham khảo, trích dẫn ghi rõ phần tài liệu tham khảo Nếu có phát gian lận xin chịu hoàn toàn trách nghiệm Hà Nội, ngày 22 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Ngô Thị Thu Trang i LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp, lời em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến Thầy TS Đinh Trường Sơn, người thầy dạy, hướng dẫn tận tình cho em suốt trình nghiên cứu hoàn thiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến tất Thầy Cô Bộ môn Công nghê sinh học Thực vât – Khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện giúp đỡ em suốt trình thực đề tài khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn Thầy Cô giáo Khoa Công nghệ sinh học giảng viên Học viên Nông nghiệp Việt Nam tận tình dạy tạo mơi trường học tập tốt để em hồn thành tốt quãng thời gian học tập Học viện Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân bên cạnh ủng hộ, động viên tin tưởng em suốt q trình thực khóa luận tốt nghiệp Dẫu cố gắng hồn thành khơng thể tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp từ Thầy Cơ Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 02 năm 2021 Sinh viên Ngô Thị Thu Trang ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH ẢNH vii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu 1.3 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu lúa 2.2 Rầy nâu Nilaparvata lugens Stål tác hại chúng 2.3 Đa dạng di truyền nghiên cứu đa dạng di truyền 2.3.1 Định nghĩa 2.3.2 Các phương pháp xác định đa dạng di truyền 2.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền gen kháng rầy 13 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 17 3.2 Mồi SSR ISSR 18 3.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 21 3.3.1 Nội dung nghiên cứu 21 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 21 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết tách chiết DNA 26 4.2 Kết đánh giá đa dạng di truyền thị ISSR 27 iii 4.3 Giá trị PIC Rp mồi ISSR 30 4.4 Kết khảo sát có mặt locus kháng rầy thị SSR 35 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37 5.1 Kết luận 37 5.2 Kiến nghị 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC 41 iv DANH MỤC VIẾT TẮT AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism BPH Brown Plant Hopper ISSR Inter Simple Sequence Repeat PCR Polymerase Chain Reaction PIC Polymorphic Information Content QTLs Quantitative Trait Locus SSR Simple Sequence Repeat RAPD Random Amplified Polymorphism DNA RELP Restriction Fragment Length Polymorphism UPGMA Unweight Pair Group Method with Arithmetic Mean v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Tên mẫu giống dùng cho nghiên cứu………………………… …….18 Bảng 3.2 Bảng hóa chất dùng nghiên cứu 18 Bảng 3.3 Danh sách mồi SSR dùng nghiên cứu 19 Bảng 3.4 Danh sách mồi ISSR dùng nghiên cứu 22 Bảng 4.1 Kết số OD260/280 nồng độ DNA mẫu nghiên cứu 27 Bảng 4.2 Số locus khuếch đại 10 mồi ISSR mẫu lúa 29 Bảng 4.3 Độ đa hình mẫu giống lúa với mồi ISSR 29 Bảng 4.4 Giá trị PIC mồi ISSR 30 Bảng 4.5 Giá trị Rp 32 Bảng 4.6 Hệ số tương đồng di truyền mẫu lúa kháng rầy 34 Bảng 4.7 Thống kê có mặt locus kháng rầy giống lúa 36 vi DANH SÁCH HÌNH ẢNH Hình 4.1 Kết điện di DNA tổng số mẫu giống lúa nghiên cứu 26 Hình 4.2 Sơ đồ mối quan hệ di truyền mấu giống lúa kháng rầy dựa vào phần mềm NTSYSPC 2.1 35 vii TÓM TẮT Lúa (Oryza Sativa L.) lương thực chính, cung cấp lương thực cho hàng tỷ người giới Tuy nhiên, dịch hại rầy nâu Nilaparvata lugens Stål gây làm ảnh hường đến suất, chất lượng lương thực Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển lúa kháng rầy nâu quan tâm ý nhiều lợi ích to lớn Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu lúa thông qua 10 thị ISSR thu tổng số 286 băng, có 123 băng đa hình chiếm 43.03% (từ 38.24% - 46.15%) Trung bình hệ số PIC 10 mồi ISSR 0.17 (từ 0.00 đến 0.31) Như vậy, khả phát đa hình 10 thị ISSR 10 mẫu giống lúa nghiên cứu mức trung bình thấp Giá trị Rp trung bình 10 thị ISSR 7.16 Sử dụng hệ số tương đồng Sokal Michener (1958) phương pháp UPGMA để phân tích cho thấy: hệ số tương đồng di truyền mẫu giống dao động từ 0.63 – 0.91 Mức độ tương đồng di truyền 0.81 chia làm nhánh chính: nhánh (TN1), nhánh (Hangangchal, Pokkali), nhánh (IRBB10, IRBB8, KR8, KR1), nhánh (ISC3) Đã tiến hành khảo sát có mặt locus kháng rầy mẫu lúa kháng rầy mẫu nhiễm rầy chuẩn thị SSR Trong tổng số 20 locus kiểm tra, giống TN1 nhiễm rầy chuẩn mang 18 locus kháng rầy Các mẫu giống lại mang tối thiểu 18 locus kháng rầy viii Bảng 4.7 Thống kê có mặt locus kháng rầy giống lúa Stt Mồi Tên locus Độ lớn Số sản phẩm PCR nhân locus kháng rầy/giống SP PCR lúa (bp) TN1 Hangangchal Pokkali IRBB10 ISC3 KR8 KR1 IRBB8 MS5 Bph15 215 1 1 1 1 RM3827 Qbph6 160 1 1 1 1 RM435 Bph20 90-100 1 1 1 1 RM42 166 1 1 2 RM313 Qbph3 111 1 1 1 1 RM19291 Bph3 146 1 1 1 1 RM401 Bph17 156 1 1 1 0 RM8072 Bph3 146 1 1 1 1 RM514 Bph14 259 1 1 0 10 RM210 GM4 140 0 1 1 11 RM12 Qbph2 100- 1 1 1 184 12 RM8213 Bph17 177 1 1 1 13 RM5479 Bph21(t) 100-200 1 1 1 14 RM312 97 1 1 1 1 15 RM573 Qbph2 201 1 1 1 1 16 RM512 Bph3 214 1 1 1 1 17 B42 Bph20(T) 117 1 1 1 1 18 SA598 GM7 100-400 1 1 1 19 RM6947 155 0 1 1 20 112-17- 400-500 1 1 1 1 18 18 19 19 20 19 18 18 Qsbphl2 RM3331 Tổng số locus/cây Kết cho thấy hầu hết giống lúa mang locus kháng rầy Trong số 20 locus kiểm tra, mẫu giống TN1 mẫu giống nhiễm rầy chuẩn mang số locus kháng rầy 18 locus (khơng có locus RM210 RM6947) Mẫu giống Hangangchal khơng có locus RM210 RM6947 mẫu giống ISC3 mang tồn 20 locus… Ngoài ra, số locus xuất băng vạch/locus ví dụ mẫu giống TN1 có locus RM12 RM5479 xuất băng vạch/locus, mẫu giống IRBB10 có locus RM5479 xuất băng vạch/locus… 36 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Kết phân tích đa dạng di truyền mẫu lúa thông qua 10 thị ISSR thu tổng số 286 băng, có 123 băng đa hình chiếm 43.03% (từ 38.24% - 46.15%) Trung bình hệ số PIC 10 mồi ISSR 0.17 (từ 0.00 đến 0.31) Như vậy, khả phát đa hình 10 thị ISSR 10 mẫu giống lúa nghiên cứu mức trung bình thấp Giá trị Rp trung bình 10 thị ISSR 7.16 Sử dụng hệ số tương đồng Sokal Michener (1958) phương pháp UPGMA để phân tích cho thấy: hệ số tương đồng di truyền mẫu giống dao động từ 0.63 – 0.91 Mức độ tương đồng di truyền 0.81, mẫu giống lúa chia làm nhánh chính: nhánh (TN1), nhánh (Hangangchal, Pokkali), nhánh (IRBB10, IRBB8, KR8, KR1), nhánh (ISC3) Tiến hành khảo sát có mặt locus kháng rầy thị SSR mẫu lúa kháng rầy nâu mẫu nhiễm rầy chuẩn cho thấy hầu hầu hết mẫu giống mang locus kháng rầy 5.2 Kiến nghị Cần tiếp tục phân tích, đánh giá đa dạng di truyền giống lúa kháng rầy Giải trình tự locus SSR kháng rầy để phát khác biệt trình tự nucleotide locus 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Chí Bửu Nguyễn Thị Lang (2005) Nghiên cứu ứng dụng thị phân tử để phát gen kháng rầy nâu lúa (Oryza sativa L.) Hội nghị khoa học toàn quốc Công nghệ sinh học, tr 165-169 Lê Xuân Thái, Trần Nhân Dũng (2012) Nguồn gen kháng rầy nâu giống lúa phổ biến Đồng sông Cửu Long năm 2008-2011 Tạp chí Khoa học (20) 12:22a 115-122 Nguyễn Thị Diễm Thúy, Lê Vĩnh Thúc Trần Nhân Dũng (2012) Khảo sát tính kháng rầy nâu (Nilaparvata Lugen Stal) giống lúa (Oryza Sativa L.) hai dấu phân tử RG457 RM190 Tạp chí Khoa học: 23a 145-154, Trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật thị DNA nghiên cứu chọn lọc thực vât Tạp chí sinh học: 36(3): 265- 294 Nguyễn Thị Kim Liên, Nguyễn Huy Hoàng (2016) Xác định nguồn gen kháng rầy nâu số giống lúa thị phân tử Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 14(2): 261-269 Nguyễn Thị Lang, Trần Quang Tấn, Trịnh Thị Lũy, Bùi Chí Bửu (2007) Nguyên cứu gen kháng rầy nâu hai loài giống lúa (Oryza Rufipogon Oryza Officinalis) Việt Nam Tạp chí Nơng nghiệp phát triển nơng thôn số 19, tr.3-9 Phạm Thị Thanh Mai, Nguyễn Thị Như Ý, Hoàng Thị Kim Hồng (2012) Xác định diện gen kháng rầy nâu (Nilarpavata lugens Stal) số giống lúa (Oryza sativa L.) Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, tập 75A, số 6, tr 83-90 Phan Hữu Tôn (2016) Khảo sát khả kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu giống lúa phục tráng: nếp Đèo Đàng, tẻ Pude, Blechâu Khẩu Dao Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2016, tập 14, số 4: 551559 Thiều Văn Đường, Lưu Thị Ngọc Huyền (2000) Khảo sát tính kháng rầy nâu dòng thị số dịng, giống lúa Thơng tin Sinh học Ứng dụng, số 4, tr 67-72 38 Tiếng Anh Mahmoodreza S (2015) Marker-assisted selection for rice brown planthopper (Nilaparvata lugens) resistance using linked SSR markers Turkish Journal of Biology 39: 666-673 Haiyuan Y., Aiqing Y (2004) High-resolution genetic mapping at the Bph15 locus for brown planthopper resistance in rice (Oryza sativa L.) Theor Appl Genet (2004) 110: 182-191 Nono C (2013) Identification of Polymorphism on Simple Sequence Repeats Markers Associated with Brown Planthopper Resistance Genes in Twenty Rice Genotypes and Its Genetic Relationship Proceeding ICBS 2013 BIO-UGM, Sept 20-21, 2013 Yang H., You A., Yang Z., Zhang F., He R., Zhu L., He G (2004) Highresolution genetic mapping at the Bph15 locus for brown plant-hopper resistance in rice (Oryza sativa L.) Theor Appl Genet110:182–191 Rahman ML., Jiang W., Chu SH., Qiao Y., Ham TH., Woo MK (2009) High-resolution mapping of two brown planthopper resistancegenes, Bph20(t) and Bph21(t), originating from Oryza minuta Theor Appl Genet 119:1237–46 Liu Y., Su C., Jiang L., He J., Wu H., Peng C., (2009) The distribution and identification of brown planthopper resistance genes in rice Hereditas 146:67–73 Chen J., Wang L., Pang X., Pan Q (2006) Genetic analysis and gene mapping of a rice brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) resistance gene bph19 (t) Mol Genet Genomics 275: 321–329 Ali M., Chowdhury T (2014) Tagging and mapping of genes and QTLs of Nilaparvata lugens resistance in rice Euphytica 195: 1–30 Du B., Zhang W., Liu B., Hu J., Wei Z., Shi Z., He R., Zhu L., Chen R., Han B (2009) Identification and characterization of Bph14, a gene conferring resistance to brown planthopper in rice P Natl Acad Sci USA 106: 22163–22168 10 Jairin J., Phengrat K., Teangdeerith S., Vanavichit A., Toojinda T (2007) Mapping of a broad-spectrum brown planthopper resistance gene, Bph3, on rice chromosome Mol Breeding 19: 35–44 11 Jena K., Jeung J., Lee J., Choi H., Brar D (2006) High-resolution mapping of a new brown planthopper (BPH) resistance gene, Bph18 (t), and marker-assisted selection for BPH resistance in rice (Oryza sativa L.) Theor App Genet 112: 288–297 39 12 Jena K., Kim SM (2010) Current status of brown planthopper (BPH) resistance and genetics Rice 3: 161–171.Jena KK, Mackill D (2008) Molecular markers and their use in marker-assisted selection in rice Crop Sci 48: 1266–1276 13 Kim SM., Sohn JK (2005) Identification of a rice gene (Bph 1) conferring resistance to brown planthopper (Nilaparvata lugens Stal) using STS markers Mol Cells 20: 30–34 14 Zhang Q (2007) Strategies for developing green super rice P Natl Acad Sci USA 104: 16402–16409 15 Zhou L., Chen Z., Lang X., Du B., Liu K., Yang G., Hu G., Li S., He G., You A (2013) Development and validation of a PCR-based functional marker system for the brown planthopper resistance gene Bph14 in rice Breeding Sci 63: 347 16 Zhou WC, Kolb F, Bai GH, Domier L, Boze L, Smith N (2003) Validation of a major QTL for scab resistance with SSR markers and use of marker-assisted selection in wheat Plant Breeding 122: 40–46 17 Wang BJ, Xu HX, Zheng XS, Fu Q, Lu ZX (2010) High temperature modifies resistance performances of rice varieties to brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stal) Rice Sci 17: 334–338 18 Preap, V.; Zalucki, M P.; Jahn, G C (2006) “Brown planthopper outbreaks and management” Cambodian Journal of Agriculture (1): 17–25 19 Williams, J.G., R.S Reiter, R.M Young, and P.A Scolnik 1993 Genetic mapping of mutations using phenotypic pools and mapped RAPD markers Nucleic Acids Res 21: 2697-2702 20 Schlotterer C., Pemberton J (1994) The use of microsatellites for genefic analysis of natural populations EXS., 69, pp 203-214 21 Smith, Bruce D The Emergence of Agriculture Scientific American Library, A Division of HPHLP, New York, 1998 40 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết điện di mẫu lúa thị SSR ISSR RM3827 MS5 RM42 RM435 41 RM19291 RM313 RM401 RM8072 42 RM514 RM210 RM12 RM8213 43 RM5479 RM312 RM573 RM512 44 SA598 B42 112-17-RM3331 RM6947 45 UBC-808 UBC-807 UBC-826 UBC-812 46 UBC-827 UBC-861 UBC-868 UBC-872 47 UBC-873 UBC-876 48 Phụ lục 2: Bảng ma trận nhị phân mồi ISSR UBC-807 UBC-808 UBC-812 UBC-826 UBC-827 UBC-861 UBC-868 UBC-872 TN1 Hangangchal Pokkal i 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 49 IRBB1 0 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ISC 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 KR 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 KR 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 IRBB 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 UBC-873 UBC-876 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 50 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1