Phân tích đa dạng di truyền cây quế bằng chỉ thị phân tử adn

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY QUẾ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN HÀ NỘI - 2022 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY QUẾ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ ADN Sinh viên thực : Trần Ngọc Anh Khố : 637104 Ngành : Cơng nghệ sinh học Người hướng dẫn : ThS Tống Văn Hải HÀ NỘI – 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả ngiên cứu khóa luận này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ bất kì một báo cáo nào Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho khóa luận này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn khóa luận đều được chỉ rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 30 tháng 08 năm 2022 Sinh viên Trần Ngọc Anh i LỜI CẢM ƠN Để có được báo cáo khóa luận tốt nghiệp này, không chỉ có sự cố gắng của bản thân, mà còn là sự tận tâm nhiệt huyết của thầy cô và sự cổ vũ, động viên của gia đình và bạn bè Tôi xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô Khoa Công Nghệ Sinh Học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam – những người lái đò không biết mệt mỏi đã trực tiếp giảng dạy, truyền cho kiến thức làm hành trang sau này Và đặc biệt cả đó là thầy ThS Tống Văn Hải đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên cổ vũ tinh thần suốt thời gian thực hiện khóa luận Cuối cùng, xin được gửi lời cảm ơn thân thương nhất đến gia đình và bạn bè, những người sát cánh ủng hộ quá trình học tập và thực hiện khóa luận tốt nghiệp này Mặc dù tơi đã cớ gắng để hồn thành Khóa ḷn tớt nghiệp mợt cách hồn chỉnh nhất Tuy nhiên, một số hạn chế về mặt kiến thức kinh nghiệm thực tế nên không thể tránh khỏi những thiếu sót mà bản thân chưa thấy được Tơi rất mong được sự góp ý của quý Thầy, Cơ giáo để khóa ḷn được hồn chỉnh Tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2022 Sinh viên Trần Ngọc Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii TÓM TẮT viii PHẦN I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích của đề tài 1.2.2 Yêu cầu PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về quế 2.1.1 Đặc điểm của quế 2.1.2 Đặc điểm sinh trưởng quế 2.1.3 Giá trị kinh tế của quế 2.1.4 Công dụng của quế 2.2 Các chỉ thị nghiên cứu đa dạng di truyền 10 2.2.1 Các chỉ thị 10 2.2.2 Một số nghiên cứu về đa dạng quế bằng chỉ thị phân tử 13 2.3 Nghiên cứu về Coumarin quế 16 PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 18 3.1 Vật liệu, thời gian và địa điểm nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 19 3.2 Dụng cụ, thiết bị hoá chất 19 iii 3.2.1 Dụng cụ, thiết bị 19 3.2.2 Hoá chất 19 3.3 Nội dung nghiên cứu 19 3.4 Phương pháp nghiên cứu 19 3.4.1 Chiết tách ADN 19 3.4.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền 20 mẫu giống quế bằng chỉ thị phân tử 21 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu hàm lượng Coumarin quế 23 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 4.1 Nghiên cứu các phương pháp chiết tách ADN quế 24 4.2 Phân tích đa dạng di truyền của 20 mẫu giống quế 26 4.3 Kết quả nghiên cứu hàm lượng Coumarin của 20 mẫu giống quế 30 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 5.1 Kết luận 33 5.2 Kiến nghị 33 TAI LIÊU THAM KHAO 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Từ viết tắt Diễn giải DNA Deoxyribonucleic acid RAPD Random Amplified Polymorphic ADN PCR Polymerase Chain Reaction RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism SSR EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid CTAB Cetyl trimethylammonium bromide TAE 10 UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean 11 NTSYS Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System 12 TE 13 EtOH Simple sequence repeats Tris-acetate buffer Tris EDTA Ethanol v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Danh sách các mẫu giống quế phân tích đa dạng di truyền 18 Bảng 3.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 22 Bảng 3.3 Trình tự mời RAPD sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 4.1 Nồng độ ADN của 20 mẫu giống quế 25 Bảng 4.2 Số allen nhân lên bằng PCR-RAPD 27 Bảng 4.3 Hàm lượng Coumarin của nhóm giống quế thuộc tỉnh 31 vi DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Đặc điểm thực vật học của quế (Thân, hoa, quả) Hình 2.2 Lá quế Hình 2.3 Hoa, quả quê Hình 2.4 Rừng quế ở Yên Bái Hình 2.5 Vườn ươm quế giống Hình 2.6 Mô hình 3D Coumarin 16 Hình 3.1 Quy trình tách chiết ADN theo phương pháp CTAB thông thường CTAB cải tiến 20 Hình 4.1 Kết quả điện di ADN tổng số 20 mẫu giống quế được chiết tách bằng phương pháp CTAB cải tiến 26 Hình 4.2 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-13 28 Hình 4.3 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPA-4 28 Hình 4.4 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-11 28 Hình 4.5 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-17 29 Hình 4.6 Sơ đồ mối quan hệ di truyền giữa mẫu giống quế 29 vii TÓM TẮT Chi Quế (Cinamomum) thuộc họ Lauraceae, gờm khoảng 250 lồi có hương thơm Các loài họ này có đặc trưng là vỏ dầu thơm, cay nồng, dùng làm hương liệu, gia vị thực phẩm hay làm thuốc kháng viêm, chống tiểu đường chớng oxy hóa Cây q́ được biết đến từ cách rất lâu, từ khoảng 2000 năm trước công nguyên Trong nghiên cứu 20 mẫu giống quế thu thập tại Yên Bái, Lạng Sơn, Quảng Ninh được nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng xác định hàm lượng Courmarin Kết quả nghiên cứu cho thấy đã chiết tách thành công ADN của 20 mẫu giống quế và phương pháp CTAB cải tiến cho chất lượng ADN tốt Từ 12 chỉ thị RAPD, bằng kỹ thuật PCR đã nhân các vùng ADN ngẫu nhiên của bộ gen 20 mẫu giớng q́ Phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 với 20 mẫu giống quế thành nhóm giống chính và đã đề xuất hướng phát triển sau nghiên cứu Hàm lượng Coumarin của các mẫu giống quế thuộc nhóm Quảng Ninh thấp nhất, cần được nhân rộng các địa bàn trồng quế lớn tại Việt Nam viii liệu này được sử dụng để xây dựng mợt phả hệ bằng phương pháp phân nhóm UPGMA thông qua phần mềm NTSYS-pc 2.1 (F James Rohlf, 2000) 3.4.3 Phương pháp nghiên cứu hàm lượng Coumarin quế - Chiết dung môi, xác định hàm lượng Comarin bằng LC-MS / MS Được Công ty cổ phần sản xuất và xuất Quế Hồi Việt Nam nghiên cứu và phân tích 23 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Nghiên cứu các phương pháp chiết tách ADN quế Chiết tách ADN công việc đầu tiên đóng vai trò rất quan trọng cho nghiên cứu phân tử tiếp theo Lá quế chứa nhiều tinh dầu, polysaccharide polyphenol làm ức chế trình thu tủa ADN Cho nên đệm chiết tách thành phần đã được Doyle mơ tả cịn bở sung thêm β – mercaptoethanol để ức chế quá trình oxi hóa để thu kết tủa ADN (đối với phương pháp CTAB cải tiến) Để có ADN tinh sạch cho các phản ứng RAPD-PCR thì chúng đã chiết tách ADN với phương pháp CTAB thông thường và CTAB cải tiến Về bản các bước tiến hành của phương pháp này giống Tuy nhiên, với phương pháp CTAB cải tiến thì đệm chiết tách có bổ sung thêm β – mercaptoethanol nhằm hạn chế quá trình oxi hóa Ngoài còn bổ sung thêm Phenol thay vì chỉ sử dụng Chloroform : Isoamyl alcohol theo phương pháp CTAB thông thường nhằm loại bỏ muối và các tạp chất polysaccharide, phenol, carbohydrate,… Kết quả chiết tách ADN của phương pháp được tổng hợp ở bảng 4.1 Với phương pháp chiết tách ADN theo CTAB cải tiến nồng độ mẫu ADN tách chiết nằm khoảng từ 200.1 (ng/µl) đến 3086 (ng/µl), với thể tích 50µl mẫu Kết quả kiểm tra độ tinh sạch của ADN thông qua độ hấp thụ quang phổ cho thấy, tỉ lệ A260/A280 của tất cả mẫu nằm khoảng từ 1,82 - 1,9, mẫu ADN thu được đã loại bỏ hầu hết protein polypeptide Đồng thời tỉ lệ A260/A230 của hầu hết mẫu nằm khoảng – 2.22 Nhìn vào bảng ta thấy rõ tỉ lệ kết quả đo ADN bằng hai bước sóng A260 A280 được tách chiết bằng phương pháp CTAB cải tiến đều lớn 1.7, điều chứng tỏ ADN đạt độ tinh sạch cao, đảm bảo cho phản ứng PCR Ngược lại nồng độ ADN được tách chiết bằng phương pháp CTAB thông thường tỉ lệ A260/280 đạt nồng độ nhỏ 1.7, chứng tỏ ADN không có đợ tinh sạch cao, cịn 24 lẫn nhiều tạp chất nên không đảm bảo làm ADN khuôn mẫu cho phản ứng PCR sử dụng mồi RAPD Bảng 4.1 Nồng độ ADN của 20 mẫu giống quế Phương pháp CTAB cải tiến Tên mẫu Phương pháp CTAB M1 Nồng đợ (ng/µl) 2198 A260/280 A260/230 1.82 2.12 Nồng đợ (ng/µl) 1932 M2 752.6 1.89 2.18 547.1 1.44 1.71 M3 1182 1.95 2.19 885 1.62 1.78 M4 824.5 1.96 2.14 672.2 1.54 1.90 M5 200.1 1.82 2.11 152.0 1.58 1.95 M6 566.3 1.84 2.04 311.4 1.41 1.87 M7 248.9 1.89 2.08 122.4 1.45 1.82 M8 1261 1.81 2.17 908 1.65 1.72 M9 322.2 1.83 2.01 241.5 1.69 1.89 M10 870 1.99 2.16 569 1.35 1.85 M11 849.4 1.93 2.2 629.1 1.43 1.92 M12 3086 1.85 2.06 1962 1.55 1.96 M13 384.5 1.97 2.29 205.6 1.67 1.79 M14 346.1 1.92 2.09 149.2 1.62 1.74 M15 432.9 1.91 2.02 302.5 1.64 1.84 M16 538.8 1.97 2.05 351.2 1.44 1.86 M17 446.9 1.99 2.22 306.9 1.43 1.80 M18 506,6 1.88 2.29 298.3 1.37 1.81 M19 849.4 1.93 2.2 509.8 1.49 1.93 M20 248.9 1.81 2.02 194.6 1.41 1.78 25 A260/280 A260/230 1.65 1.84 Song song với xác độ tinh sạch của ADN bằng cách đo và tính tỷ lệ của hai bước sóng 260 280 nm chúng tơi cịn tiến hành điện di ADN tởng sớ gel agarose 1,0%, hình ảnh điện di được thể hiện ở hình 4.1 Hình 4.1 Kết điện di AND tổng số 20 mẫu giống quế được chiết tách bằng phương pháp CTAB cải tiến Từ kết quả điện di ADN tổng số gel agarrose 1%, thu được một vệt băng nhất ở tất cả mẫu giống vệt băng gọn và đồng đều Điều chứng tỏ chất lượng ADN của mẫu tốt, không bị gãy hay lẫn tạp chất Điều chứng tỏ ADN có nợng đợ tương đối cao, chất lượng tốt, đủ tiêu chuẩn ADN khn mẫu cho phản ứng RAPD-PCR 4.2 Phân tích đa dạng di truyền của 20 mẫu giống quế Ở phần 4.1 ADN đã được chiết tách bằng phương pháp, nhiên phương pháp chiết tách theo CTAB cải tiến cho chất lượng ADN đảm bảo độ tinh sạch đủ điều kiện để sử dụng cho phản ứng PCR với mời chỉ thị RAPD Chính vậy nghiên cứu đa dạng di truyền sử dụng ADN từ phương pháp CTAB cải tiến làm khuôn mẫu Tiến hành nghiên cứu, phân tích và đánh giá mức độ đa hình di truyền của 20 mẫu quế, 12 mồi RAPD đã được sử dụng nghiên cứu Cơ sở của kỹ thuật RAPD sự nhân bản DNA genome bằng phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên để tạo sự đa hình DNA sự tái sắp xếp mất nucleotide ở vị trí bắt mồi (Nguyễn Đức Thành, 2014) Sau điện di sản phẩm RAPD-PCR nhận thấy cả 12 chỉ thị đều cho đa hình, kết quả được tổng hợp ở bảng 4.2 26 Bảng 4.2 Số allen nhân lên PCR-RAPD Chỉ thị Tổng số allen Số allen đa Tỷ lệ % allen hình đa hình OPA-4 25,0 OPA-9 50,0 OPB-17 62,5 OPA-19 6 100,0 OPB-07 45,45 OPB-19 50,0 OPB-08 50,0 OPB-10 7 100,0 OPB-11 20,0 OPB-13 60,0 OPB-16 60,0 OPB-20 60,0 72 52 72,2 Tổng cộng allen chỉ thị SSR Qua bảng 4.2 nhận thấy tổng số allen nhân lên là 72, đó 52 allen là allen đa hình, tức 52 allen đó chỉ được sự khác giữa mẫu giớng Chỉ thị OPB-07 có số allen nhân lên nhiều nhất (9 allen), nhiên chỉ có allen đa hình, chiếm 45,45% Hai allen cho đa hình 100% là OPA-19 OPB-10, hai chỉ thị này có ý nghĩa quan trọng phân tích đa dạng di truyền Từ kết quả điện di của 12 chỉ thị RAPD, trường điện di tiến hành ghi điểm (0) và (1) Điểm tức khơng có allen, điểm có allen ở mợt vị trí giớng Bằng phần mềm chun dụng NTSYSpc 2.1 đã tính toán được hệ số tương đồng di trùn và sơ đờ hình quan hệ di truyền của 20 mẫu giống quế Dựa vào hệ số tương đờng di trùn đã xây dựng sơ đờ hình diễn 27 tả quan hệ di truyền của 20 mẫu giống quế nghiên cứu, qua đó đã phân theo các nhóm để có hướng sử dụng công tác bảo tờn phát triển ng̀n gen tớt Hình 4.2 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-13 Hình 4.3 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPA-4 Hình 4.4 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-11 28 Hình 4.5 Điện di sản phẩm RAPD – PCR chỉ thị OPB-17 Hình 4.6 Sơ đồ mối quan hệ di truyền các mẫu giống quế Kết quả hệ số tương đồng di truyền và sơ đờ hình quan hệ di trùn của 20 mẫu giớng q́ được thể hiện ở Hình 4.6 Dựa vào kết quả có thể biết được mới quan hệ giữa mẫu giống, từ đó nhóm chúng thành từng nhóm để có hướng sử dụng bảo tồn hiệu quả Các mẫu giớng có hệ sớ tương đờng di truyền giao động từ 0,44 đến 1,0 Đối với hệ sớ tương đờng bằng 1,0 mẫu giớng giớng 100% ở cấp đợ ADN Cịn phân tích hệ sớ tương tương đờng từ 0,72 từ phân loại hình 4.6 ta chia 20 mẫu giớng q́ thành nhóm Nhóm gờm những mẫu giống M1, M2, M3, M4, M5, M10, M11, M12, M13 Nhóm gờm mẫu giớng M6, M7, M8, M9 29 Nhóm gờm mẫu giớng M14, M15, M16 M17 Nhóm gờm mẫu giớng M18, M19, M20 Phân tích cụ thể nhận thấy mẫu quế thu thập ở vùng khác nhau, khác Các mẫu giống quế thu thập tại Yên Bái gồm 13 mẫu giớng và được chia 02 nhóm Trong mợt nhóm nhiều mẫu giớng giớng hệt (100%) M1, M3, M5; M2 và M4; M10 và M12; M11 và M13…Qua nghiên cứu cũng nhận thấy rằng mẫu giống thu thập ở vùng trồng quế khác nhác và đặc trưng cho từng nhóm vùng Vùng Quảng Ninh, vùng Lạng Sơn không giống vùng Yên Bái Tuy nhiên tất cả 20 mẫu giống quế đều phát sinh chung từ mợt lồi chung Tại n Bái, sớ mẫu thu thập để phân tích lớn và được chia làm 02 nhóm, nhiên hai nhóm này cũng không khác xa ở mức độ ADN Qua cũng nhận thấy rằng giống quế trồng ở xã Việt Thành Hịa Cng được trờng từ mợt giống Giống được trồng ở Đào Thịnh một giống quế khác Giống được trồng ở Quảng Ninh Lạng Sơn cũng là các giống quế khác Công việc tiếp theo là đánh giá suất vỏ quế, chất lượng tinh dầu của từng nhóm quế nêu trên, xem nhóm nào cho suất, chất lượng cao nhất từ đó nhân rợng nhóm giớng tớt để tạo q̀n thể quế đồng đều, chất lượng đem lại hiệu quả kinh tế cao 4.3 Kết nghiên cứu hàm lượng Coumarin của 20 mẫu giống quế Coumarin lần đầu tiên được phân lập từ đậu tonka cỏ ba ngọt vào năm 1820 bởi A Vogel của Munich, người ban đầu nhầm với axit benzoic Cũng năm 1820, Nicholas Jean Baptiste Gaston Guibourt (1867) của Pháp đã phân lập độc lập coumarin, ông nhận rằng đó không phải axit benzoic Trong một luận tiếp theo, ông đã trình bày cho bộ phận dược phẩm của Académie Royale de Médecine, Guibourt đặt tên cho chất mới "coumarine" Năm 1835, dược sĩ người Pháp A Guillemette đã chứng minh rằng Vogel và Guibourt đã phân lập một chất Coumarin lần đầu tiên được tởng hợp vào năm 1868 bởi nhà hóa học người Anh William Henry Perkin 30 Coumarin được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1868 Nó được sử dụng ngành công nghiệp dược phẩm thuốc thử tiền thân q trình tởng hợp của mợt sớ tởng hợp thuốc chống đông dược phẩm tương tự dicoumarol, chế chống đông máu tương tự 4-hydroxycoumarin một loại chất đối kháng vitamin K Coumarin dược phẩm đều được phát triển từ nghiên cứu về bệnh cỏ ba ngọt Tuy nhiên, coumarin khơng biến đởi nó xảy thực vật, khơng có tác dụng đới với hệ thớng đơng máu vitamin K Coumarin có giá trị y tế lâm sàng, một công cụ điều chỉnh phù nề Coumarin loại benzopyrones khác, chẳng hạn 5,6 - benzopyrone, 1,2 - benzopyrone, diosmin loại khác, được biết là kích thích các đại thực bào để làm giảm albumin ngoại bào Coumarin cũng được sử dụng làm môi trường khuếch đại một số laser nhuộm, chất nhạy cảm các cơng nghệ quang điện cũ Theo nhóm nghiên cứu mạnh “Công nghệ sinh học nano công nghệ gen - protein tái tổ hợp” (2022) Trong thực tiễn sản xuất quế, hàm lượng Coumarin ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng quế Nếu hàm lượng Coumarin cao (>4000 mg/kg) thì quế không đủ tiêu chuẩn xuất Chính vì vậy những giống quế có hàm lượng Coumarin thấp được ưu tiên phát triển 20 mẫu giống quế nghiên cứu được chia thành nhóm, nhóm chúng lấy một mẫu ngẫu nhiên phân tich hàm lượng Coumarin Bảng 4.3 Hàm lượng Coumarin của nhóm giống quế thuộc tỉnh STT Nhóm mẫu giống quế Hàm lượng Coumarin (mg/kg) Nhóm Yên Bái 5161.4 Nhóm Yên Bái 5625.0 Nhóm Lạng Sơn 2614.7 Nhóm Quảng Ninh 2569.0 Kết quả nghiên cứu hàm lượng Coumarin của 20 mẫu giống quế được chia làm nhóm (Yên Bái 1, Yên Bái 2, Lạng Sơn và Quảng Ninh) được gửi 31 test tại Công ty SGS Việt Nam bằng phương pháp LFOD – TST – SOP - 8551 có hàm lượng dao động từ 2569.0 – 5625.0 mg/kg Trong đó, các mẫu giống quế thuộc nhóm Yên Bái có hàm lượng Coumarin cao nhất là 5625.0 mg/kg Các mẫu giống quế thuộc nhóm Quảng Ninh có hàm lượng Coumarin thấp nhất là 2569.0 mg/kg Hai nhóm Yên Bái và nhóm Lạng Sơn có hàm lượng Coumarin của các mẫu giống quế đạt lần lượt là 5161.4 mg/kg và 2614.7 mg/kg Từ kết quả nghiên cứu thấy rằng các mẫu giống quế có hàm lượng Coumarin cao rất khó xuất nước ngoài, vì vậy mẫu giống quế có hàm lượng Coumarin thấp nhóm Quảng Ninh cần được phát triển và thay thế các mẫu giống quế có hàm lượng Coumarin cao, đặc biệt các vùng có diện tích đất trồng quế rộng Yên Bái 32 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Đã chiết tách được ADN bằng phương pháp CTAB thông thường và cải tiến, xác định phương pháp CTAB cải tiến cho chất lượng ADN tốt đảm bảo cho phản ứng RAPD-PCR Từ 12 chỉ thị RAPD, bằng kỹ thuật PCR đã nhân các vùng ADN ngẫu nhiên của bộ gen 20 mẫu giớng q́ Phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 với 20 mẫu giống quế thành nhóm giống và đã đề xuất hướng phát triển sau nghiên cứu Phân tích được hàm lượng Coumarin của các mẫu giống quế, tiêu chuẩn xuất của giống quế có hàm lượng Coumarin thấp 4000 mg/kg thì quế đat tiêu chuẩn xuất khẩu, hàm lượng Coumarin thuộc nhóm Quảng Ninh thấp nhất 5.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu đa dạng mẫu giống quế với chỉ thị khác để có kết luận về đa dạng di trùn mợt cách xác Cần nghiên cứu nhóm q́ ở Quảng Ninh hay Lạng Sơn để biết được hàm lượng Courmarin gen hay điều kiện môi trường tác động, từ đó có hướng sử dụng phát triển một cách hợp lý giống quế hay vùng nguyên liệu sản xuất để sản phẩm từ quế đạt chất lượng cao nhất, đem lại lợi ích kinh tế ngày cao 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Phạm Thanh Huyền, Đinh Đoàn Long (2017) Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen Đảng sâm góp phần định hướng công tác bảo tồn và phát triển ở Việt Nam Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Y Dược, Tập 33, Sớ 1: 32-39 Theo Giáo trình Mơ – đun 02: Trồng quế, hồi, sả lấy tinh dầu (Bộ NN PTNT - 2016) Trồng quế mang lại giá trị kinh tế cao Khuất Hữu Trung, Kiều Thị Dung, Lưu Cảnh Trung, Ngũn Huy Hồng, Hờ Trung Lương (2017) Đánh giá đa dạng di truyền các loài quế Thanh Hóa bằng chỉ thị RAPD Tạp chí Khoa học Việt Nam, Trang 39, 40 Nguyễn Mạnh Chinh (2021) Cây quế: nguồn gốc, đặc điểm, các điều kiện sinh trưởng của Lê Việt Ngân, Lê Đình Chi, Ngũn Thị Hờng Anh, Ngũn Bích Ngọc, Ngũn Thị Phương Lan, Nguyễn Thị Minh Lợi & Lê Thị Hồng Hảo (2020) Xác định coumarin, cinnamyl alcohol, cinnamaldehyd, acid cinnamic, eugenol, cinnamyl acetat, acid 2-hydroxycinnamic quế bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tạp chí Kiểm nghiệm và an toàn thực phẩm Tập 3, Số 1: 11-19 Hoàng Thị Thu Yến, Dương Thị Nhung, Hà Thị Thanh Hoàn, Lê Bắc Việt, Nguyễn Huy Hoàng (2017) Nghiên cứu chỉ thị phân tử SSR từ chề trồng tại tỉnh Thái Nguyên Trường Đại học khoa học, Đại học Thái Nguyên, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Tập 39 số 1: 68-79 Nguyễn Đức Thành (2014) Các kỹ thuật chỉ thị DNA nghiên cứu và chọn lọc thực vật Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam Tập 36 số 3: 265-294 34 Khuất Hữu Trung, Kiều Thị Dung, Lưu Cảnh Trung, Ngũn Huy Hồng & Hờ Trung Lương (2016) Đánh giá đa dạng di truyền các loài quế Thanh Hóa bằng chỉ thị phân tử RAPD Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam.Tập 13 số 2: 39-44 Đàm Minh Đức (2021) Báo cáo nghiên cứu chi tiết về quế Văn Yên Yên Bái – Tổng quan Quế sản phẩm của Quế Yên Bái 10.Theo trang GVC Organic & Healthy (2021) Những tác dụng phụ khó lường của bột quế Tuy cập từ https://www.gvcorganic.com/nhung-tac-dungphu-kho-luong-cua-bot-que1#:~:text=B%E1%BB%99t%20qu%E1%BA%BF%20c%C3%B3%20ch%E1 %BB%A9a%20l%C6%B0%E1%BB%A3ng,Cassia%20ch%E1%BB%A9a%2 0kho%E1%BA%A3ng%205mg%20coumarin 11.Cẩm Nang Cây Trồng (2016) Nguồn gốc của quế, đặc điểm thực vật học của quế Truy cập từ http://camnangcaytrong.com/cay-quecd2144.html 12.Phạm Thị Ngọc, Nguyễn Quốc Trung, Vũ Văn Liết (2016) Phân tích đa dạng di truyền của các mẫu giống đậu cô ve bằng chỉ thị hình thái và chỉ thị phân tử SSR 13.Theo Seminar khoa học t̀n 36 của Nhóm nghiên cứu mạnh “Cơng nghệ sinh học nano công nghệ gen - protein tái tổ hợp” (2022) Phân tích đa dạng di truyền quế bằng chỉ thị phân tử AND 14.Theo trang Bách khoa toàn thư mở (2022) Hàm lượng Coumarin Truy cập từ: https://vi.wikipedia.org/wiki/Coumarin#:~:text=Do%20%C4%91%C3%B3%2 C%20m%E1%BB%99t%20mu%E1%BB%97ng%20c%C3%A0,v%E1%BB% 9Bi%20nh%E1%BB%AFng%20ng%C6%B0%E1%BB%9Di%20nh%E1%BB %8F%20h%C6%A1n 35 Tiếng Nước Ngoài Doyle JJ, Doyle JL (1990) A rapid DNA isolation procedure from small quantity of fresh leaf material Phytochem Bull 119, 11-15 African journal of Biotechnology (2011) Genetic diversity in Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) using random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers According to Sandigawad's research AM and Patil CG (2011) Genetic diversity in Cinnamomum zeylanicum Blume (Lauraceae) using randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers African Journal of Biotechnology Vol 10 (19), pp 3682-3688 S.C Lee, S.J Chiou, J.H Yen, T.Y Lin, K.T Hsieh, J.C Yang (2010), “DNA barcoding Cinnamomum osmophloeum Kaneh Based on the partial non-coding ITS2 region of ribosomal genes ”, J Food Drug Anal, 18, pp.128-135 S.J Govinden, V.M Ranghoo, S.D Seeburrun (2007), “Tissue culture and RAPD analysis of Cinnamomum camphora and P P P H P ”, Biotechnology, (2), pp.239-244 J.J Miss (2010), “Genetic Diversity of Cinnamomum spp In Southern Thailand Based on RAPD (Random Ampli ed Polymorphic DNA) Technique ”, Master thesis in Plant Science, pp.1-4 A.M Sandigawad, C.G Patil (2011a), “Genetic diversity in some south-Indian Cinnamomum Scha Species revealed by RAPD markers ”, Indian J Genet., 71 (1), pp.87-90 M.J Asif, H Cannon (2005), “DNA extraction from processed wood - a case study for the identi cation of an endangered species ”, Plant Mol Biol Rep, 23, pp.185-192 F.J Rohlf (2000), “NTSYS-pc: Numerical taxonomy et al multivariate analysis system ”, Version 2.1 Exeter Publication, New York, USA 36 10 V J Bansode (2012), “A review on pharmacological activities of cinnamomum cassia blume”, International Journal of Green Pharmacy, vol 6, no 2, pp.102108 11 J N Barboza, C S M B Filho, R O Silva, J V R Medeiros and P Sousa (2018), “An Overview on the Antiinflammatory potential and antioxidant profile of eugenol”, Oxidative Medicine and Cellular Longevity, vol 2018, no.6, pp.19 12 K Abraham, F Wöhrlin, O Lindtner, G Heinemeyer and A Lampen (2010), “Toxicology and risk assessment of coumarin: Focus on human data”, Molecular Nutrition & Food Research, vol 54, no pp 228239 37