nguyễn đức tú tổng hợp và thử tác dụng ức chế tế bào ung thư của một số dẫn chất n hydroxyhexanamid mới mang dị vòng triazol

TỔNG QUAN

HISTON DEACETYLASE (HDAC)

1.1.1 Giới thiệu chung về enzym histon deacetylase

Histon là các protein cơ bản đóng vai trò quan trọng trong tổ chức nhân tế bào Các protein histon kết hợp cùng ADN tạo thành dạng cấu trúc được gọi là dị nhiễm sắc [38] Sự acetyl và deacetyl hóa đuôi acid amin của chúng ảnh hưởng đến khả năng tiếp cận của ADN với quá trình phiên mã Quá trình acetyl hóa được thực hiện nhờ sự có mặt của enzym histon acetyltransferase (HAT) Enzym này làm trung hòa điện tích dương ở chuỗi bên bằng cách acetyl hóa nhóm ε-NH2 của lysin tận cùng Quá trình này làm cho các histon mất đi khả năng liên kết với nhóm phosphat tích điện âm trong các nucleotid của ADN, dẫn tới nhiễm sắc thể tháo xoắn và hoạt hóa quá trình phiên mã Ngược lại, histon deacetylase (HDAC) loại bỏ các nhóm acetyl khỏi histon và làm cho các histon tích điện dương ở đầu N, tương tác mạnh với ADN dẫn tới đóng xoắn chromatin Trạng thái liên kết này hạn chế khả năng tiếp cận phiên mã của ADN dẫn tới ức chế biểu hiện gen Quá trình chuyển hóa thuận nghịch giữa HAT và HDAC đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì các kiểu biểu hiện gen và chức năng tế bào [13], [16] Sai khác trong hoạt động của HDAC có liên quan đến nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm ung thư và rối loạn thoái hóa thần kinh Trong sinh lý bệnh ung thư, các HDAC làm thay đổi phiên mã các gen hoạt hóa hình thành khối u và gen ức chế khối u thông qua việc thay đổi các dạng tồn tại của histon [27] Ngoài ra, HDAC cũng deacetyl hóa một số protein khác không phải histon như α-tubulin, p53, VEGF… từ đó chi phối hàng loạt các quá trình sinh học bao gồm cả sự khởi phát và tiến triển của ung thư [13], [16]

Cho đến thời điểm hiện tại, các nhà khoa học đã xác định được 18 loại HDAC có mặt ở người Chúng được chia thành 4 nhóm dựa trên sự tương đồng cấu trúc với các HDAC của nấm men [31]

- Nhóm I: bao gồm các HDAC1-3, HDAC8, có cấu trúc tương tự với enzym

Reduced potassium dependency-3 (Rpd3) của nấm men

- Nhóm II: Cấu trúc trung tâm hoạt động của các enzym nhóm này có nhiều điểm tương đồng với histon deacetylase 1 (HDAC1) nhưng kích thước lớn hơn HDAC nhóm

I Các HDAC nhóm này được chia làm hai phân nhóm nhỏ hơn là IIa (bao gồm HDAC4, HDAC5, HDAC7, HDAC9) và IIb (bao gồm HDAC6 và HDAC10)

- Nhóm III: các HDAC nhóm này có sự tương đồng với protein sirtuin của nấm men, chúng hoạt động phụ thuộc vào coenzym NAD + và bao gồm các sirtuin 1-7

- Nhóm IV: nhóm này chỉ có duy nhất một đại diện là HDAC11 và không có sự tương đồng với protein của nấm men

3 Các HDAC nhóm I, II, IV là những enzym phụ thuộc Zn 2+ với trung tâm hoạt động dạng túi chứa ion Zn 2+ ở đáy, do đó, các enzym này có thể bị ức chế bởi các hợp chất tạo chelat với Zn 2+ Nhóm III là các sirtuin với cơ chế hoạt động khác với ba nhóm còn lại với coenzym là NAD + [39]

1.1.3 Cấu trúc trung tâm hoạt động của enzym HDAC phụ thuộc Zn 2+

Các HDAC đều có trung tâm hoạt động gồm hai phần chính là ion Zn 2+ và kênh enzym

- Ion Zn 2+ là coenzym của HDAC, nằm ở đáy của kênh enzym Ion này có thể liên kết phối trí với các acid amin, phân tử nước và nguyên tử oxy trong nhóm acetyl của lysin ở đầu N protein histon, từ đó xúc tác cho quá trình tách loại nhóm acetyl Các cơ chất có khả năng liên kết càng mạnh với ion Zn 2+ thì tác dụng ức chế HDAC càng mạnh, độc tính tế bào càng mạnh [28], [42]

- Kênh enzym có dạng túi hình ống hẹp, được cấu tạo bởi các acid amin thân dầu, đặc biệt là các acid amin có nhân thơm như His, Phe, Pro, Tyr Sự linh động của kênh enzym cho phép nó thay đổi kích thước để phù hợp với cấu trúc của cơ chất Trên miệng túi có một vài vòng xoắn protein có thể tham gia liên kết với nhóm nhận diện bề mặt của các HDACi [42].

CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC (HDACi)

1.2.1 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC

Các mô hình phân tử đầu tiên ra đời chia cấu trúc chung của các HDACi thành 3 phần chính bao gồm: vùng nhận diện bề mặt (surface recognition CAP-group), vùng cầu nối (linker), nhóm kết thúc gắn kẽm (Zinc-binding group – ZBG) [18] Về sau, mô hình pharmacophore này được mở rộng với nhóm liên kết (connecting unit – CU) có vị trí ở giữa vùng nhận diện bề mặt và vùng cầu nối [8]

Hình 1.1 Cấu trúc khung pharmacophore cổ điển và mở rộng của các HDACi 1.2.1.1 Vùng nhận diện bề mặt – CAP group

Vùng nhận diện bề mặt giữ vai trò tương tác với các acid amin trên bề mặt kênh enzym Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vùng CAP có cấu trúc thân dầu, đặc biệt là vòng thơm, sẽ cho hoạt tính ức chế HDAC mạnh hơn [30] Bên cạnh đó, các chất có vùng CAP cồng kềnh với cấu trúc dạng trạc chữ Y thường cho hoạt tính ức chế chọn lọc hơn

4 trên HDAC6 Ví dụ, Tubacin có nhóm CAP với cấu trúc dạng này cho hoạt tính chọn lọc trên HDAC6 [8]

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của Tubacin 1.2.1.2 Nhóm kết thúc gắn kẽm – ZBG

Nhóm ZBG là phần tương tác với coenzym Zn 2+ ở dưới đáy của kênh enzym Một số nhóm gắn kẽm đã được sử dụng trong các nghiên cứu trước đây có thể kể đến như: acid hydroxamic, benzamid, acid carboxylic, thiol… [20] Tuy nhiên, nhóm dẫn chất của acid hydroxamic cho thấy hoạt tính tốt với 3 chất đã được cấp phép trên điều trị lâm sàng Đồng thời, rất nhiều các chất tiềm năng mang cấu trúc này đang trong giai đoạn thử nghiệm [12] Do vậy, đề tài hướng đến tổng hợp các chất có cấu trúc nhóm kết thúc gắn kẽm là acid hydroxamic

1.2.1.3 Vùng cầu nối – Linker group

Vùng cầu nối có vai trò kết nối nhóm ZBG với phần còn lại của khung pharmacophore Vùng này thường được cấu tạo từ các nhóm sơ nước như các hydrocarbon thân dầu mạch thẳng hoặc vòng, no hoặc không no Nó tương tác với lòng kênh enzym thông quan liên kết van der Waals [15] Các chất ức chế HDAC có vùng cầu nối với chiều dài 5 hoặc 6 carbon sẽ cho hoạt tính tối ưu [34] Ví dụ, vùng cầu nối của SAHA có 6 carbon, vùng cầu nối của TSA có 5 carbon (Hình 1.1)

Phần cấu trúc này của các HDACi thường là một nhóm lai hóa sp 2 như nhóm ceton trong cấu trúc của SAHA Nhóm CU thường được tích hợp vào vùng nhận diện bề mặt của các HDACi, tuy nhiên, chỉ có một số ít các nghiên cứu thực hiện thay đổi cấu trúc này trong thiết kế các dẫn chất nhằm tăng tính chọn lọc vào mục tiêu sinh học [8]

1.2.2 Phân loại các chất ức chế HDAC

Theo cấu trúc hóa học, các HDACi được phân loại thành 5 nhóm bao gồm: các acid hydroxamic, các benzamid, các peptid vòng, các acid béo chuỗi ngắn và các dẫn chất ceton [50] Bốn trong năm chất ức chế HDAC được FDA phê duyệt có cấu trúc

5 mang nhóm acid hydroxamic cho thấy tiềm năng phát triển của nhóm dẫn chất này Các acid hydroxamic có nhiều ưu điểm như cấu trúc tương đối đơn giản, tác dụng ức chế đạt được ở nồng độ thấp (cỡ nM), nhưng có nhược điểm là nhanh bị chuyển hóa và không ức chế chọn lọc một HDAC nhất định [12], [19], [46]

Hình 1.3 Phân loại các chất ức chế HDAC theo cấu trúc

1.2.3 Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC

Nhìn chung, các HDACi gây chết tế bào ung thư bằng một số cơ chế như ức chế chu kỳ tế bào, thúc đẩy sự chết tế bào theo chu trình (apoptosis), ức chế sự hình thành mạch… [27]

6 Hoạt động của các HDAC có liên quan đến sự ức chế biểu hiện gen CDKN1A mã hóa protein p21, vì vậy, ức chế HDAC sẽ làm tăng cường mã hóa p21 dẫn tới ngăn chặn quá trình dimer hóa của các cyclin và các kinase phụ thuộc cyclin (cyclin dependent kinase – CDK) [39] Việc loại bỏ một số HDAC (HDAC1, HDAC3…) trong tế bào khối u dẫn tới sự ức chế chuyển pha G1/S và G2/M làm ức chế sự phát triển tế bào bằng cách hạn chế quá trình phân bào và tăng tỷ lệ tế bào chết theo chương trình [27]

Các HDACi hoạt hóa quá trình apoptosis theo cả hai con đường nội sinh và ngoại sinh Chúng liên kết với các receptor gây chết như FASL, TNF, TRAIL… làm tăng biểu hiện của các receptor này và kích hoạt con đường ngoại sinh Con đường nội sinh được hoạt hóa thông qua việc làm giảm biểu hiện của các protein ức chế apoptosis như Bcl-

2, Bcl-XL… và tăng biểu hiện của các protein hoạt hóa apoptosis như Bax, BMF… [27]

Sự phát triển của khối u phụ thuộc vào sự hình thành mạch và lên trong tình trạng thiếu hụt oxy Hoạt động của HDAC1 được chứng minh là nguyên nhân gây tăng hiểu hiện của yếu tố HIF-1α và yếu tố tăng trưởng nội mạch VEGF Các HDACi giúp điều hòa các yếu tố này và hạn chế sự hình thành mạch của khối u [27], [39]

Bên cạnh các cơ chế đã được đề cập, các HDACi cũng thể hiện tác dụng thông qua một số cơ chế khác như: làm thay đổi cấu trúc chromatin, tác động lên cơ chế gây đột biến và sửa chữa ADN, chống sự di căn, hoạt hóa các gốc tự do ROS, giảm chuyển hóa protein… [27].

CÁC DẪN CHẤT 1,2,3–TRIAZOL VÀ TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ

Vòng 1,2,3-triazol là một trong những dị vòng chứa nitơ quan trọng nhất trong nghiên cứu phát triển các thuốc chống ung thư mới Nó có khả năng hình thành nhiều loại tương tác với đích phân tử như tương tác kỵ nước, liên kết hydro, liên kết van der Waals và liên kết lưỡng cực [53]

Hình 1.4 Cấu trúc hóa học của Tazobactam, Cefatrizin, Carboxyamidotriazol

7 Nhiều các hợp chất chứa dị vòng 1,2,3-triazol được sử dụng làm thuốc cho các mục đích điều trị như kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống ung thư… [1] Ví dụ như, Tazobactam và Cefatrizin được ứng dụng nhiều trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn [1]; Carboxyamidotriazol có tác dụng chống ung thư thông qua ức chế hoạt động chuỗi hô hấp tế bào và làm chậm sự phát triển của khối u [24]

Rất nhiều các nghiên cứu đã chỉ ra rằng vòng 1,2,3-triazol là hợp phần quan trọng trong các hợp chất ức chế các protein mục tiêu như IDO1 (indoleamin 2,3-dioxygenase 1), VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor), EGFR (epidermal growth factor receptor), HDAC… [1], [45]

Hình 1.5 Cấu trúc hóa học chất I

Con đường kynurenin trong chuyển hóa tryptophan đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế miễn dịch do khối u gây ra IDO1 và TDO (tryptophan 2,3-dioxygenase) là

2 enzym xúc tác cho sự khởi phát và giới hạn tốc độ của quá trình này Các nghiên cứu in vivo cho thấy rằng việc sử dụng thuốc ức chế IDO1 và TDO giúp cải thiện hiệu quả điều trị ung thư Năm 2016, Rửhrig cựng cỏc cộng sự đó tổng hợp thành cụng một số hợp chất mang vòng 1,2,3-triazol có hoạt tính ức chế IDO1 mạnh Trong đó, chất I có hoạt tính ức chế IDO1 nổi bật nhất và độc tính yếu hơn trên tế bào thường với giá trị

Hình 1.6 Cấu trúc hóa học chất II

Sự hoạt động quá mức của yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEGF) trong khối u rắn thúc đẩy sự hình thành các mạch máu mới gây mất cân bằng trao đổi chất và đẩy nhanh quá trình xâm lấn của khối u VEGF receptor 2 (VEGFR-2) là yếu tố quan trọng trong hoạt động của VEGF Vì vậy, sự ức chế VEGFR-2 có tác dụng ngăn chặn sự phát triển và di căn của khối u [48] Năm 2013, nhóm nghiên cứu của Shaphania đã tiến hành sàng lọc, tổng hợp và đánh giá tác dụng của một số hợp chất mang vòng 1,2,3- triazol trên một số dòng tế bào ung thư Kết quả cho thấy, chất II có tác dụng ức chế VEGFR-2 mạnh nhất với IC50 = 0,56 àM Chất này cũn được đỏnh giỏ thờm về tỏc dụng chống tạo mạch Trên dòng tế bào EA.hy926 (dòng tế bào lai giữa 2 dòng tế bào HUVEC

8 và A431), thường được sử dụng để thử nghiệm hình thành mạch in vitro, chất II thể hiện khả năng ức chế tương đối mạnh với IC50 = 4 àM [40]

Hình 1.7 Cấu trúc hóa học chất III

Receptor yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa và tăng sinh khối u Rối loạn điều hòa EGFR là một cơ chế phổ biến dẫn tới hình thành khối u, đặc biệt là ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC) Do đó, việc ức chế EGFR có thể là một phương pháp điều trị ung thư tiềm năng [5] Năm 2018, Banerji cùng các cộng sự đã tổng hợp thành công và đánh giá tác dụng ức chế một số tế bào ung thư của 20 hợp chất mang vòng 1,2,3-triazol Trong số các chất này, chất III có tác dụng ức chế dòng tế bào MCF-7 (dòng tế bào ung thư vú ở người) mạnh nhất với giá trị IC50

= 20,71 àM So với chất chứng dương là erlotinib (IC50 = 11,57 àM), dẫn chất này cú hoạt tính ức chế tế bào ung thư yếu hơn, tuy nhiên, độc tính trên các dòng tế bào thường cũng yếu hơn [5]

Bảng 1.1 Nồng độ ức chế 50% sự phỏt triển của tế bào GI50 (àM) của chất IV, V và SAHA

Hela BGC823 A549 HT1080 A431 HUVEC Du145

SAHA 3,36 3,09 1,78 4,87 4,48 8,13 6,86 Năm 2013, nhóm của Qiao Sun đã báo cáo một loạt các dẫn chất chứa vòng 1,2,3- triazol được tổng hợp với mục đích ức chế chọn lọc HDAC1 Các chất này đều thể hiện hoạt tính ức chế HDAC1 tương đối mạnh với IC50 ở mức micromol Đồng thời, khi các dẫn chất được thử nghiệm tác dụng trên một số dòng tế bào ung thư cụ thể, chất IV và

V thể hiện hoạt tính ức chế mạnh các dòng tế bào thử nghiệm với giá trị GI50 đều ở mức tương đương hoặc mạnh hơn SAHA [44].

HÓA HỌC CLICK VÀ PHẢN ỨNG CuAAC

9 Khái niệm hóa học Click lần đầu tiên được công bố vào năm 2001 bởi Sharpless cùng các cộng sự của ông Hóa học Click ra đời hướng tới mục tiêu phát triển công nghiệp dược phẩm Sự phát triển của Click trong thời gian tiếp theo đó đã vượt ngoài mong đợi, nó nhanh chóng trở thành một công nghệ phù hợp trong nhiều lĩnh vực khoa học phân tử [6], [23], [41] Hóa học Click từ đó đã trở thành một trong những phương pháp tổng hợp quan trọng để tạo ra kết nối giữa các phân tử thông qua sự hình thành liên kết giữa các nguyên tử carbon và các nguyên tử khác [6]

Theo Sharpless cùng các cộng sự, phản ứng Click có thể được phân loại thành 4 nhóm là phản ứng cộng, phản ứng mở vòng ái nhân, phản ứng ngưng tụ carbonyl, phản ứng cộng đóng vòng [41]

Chủ yếu là phản ứng cộng hợp Michael như phản ứng amin-en, thiol-en, thiol-yn Trong đó, sự kết hợp giữa thiol và vinyl (phản ứng thiol-en) thông qua trung gian gốc tự do là một phản ứng đặc biệt phổ biến để biến đổi và tổng hợp các polymer Các gốc tự do được hình thành dưới tác dụng của nhiệt độ hoặc ánh sáng, sau đó, chúng tương tác với nhau để hình thành thioether [25], [41]

Phản ứng mở vòng ái nhân

Là các phản ứng mở vòng của các dị vòng như aziridin, epoxid… dưới tác động của các tác nhân ái nhân Các phản ứng này thường được tiến hành trong hỗn hợp dung môi cồn và nước Sản phẩm của phản ứng có thể được phân lập với hiệu suất cao nhờ các quy trình xử lý đơn giản [25], [41]

Phản ứng ngưng tụ carbonyl Được ứng dụng trong việc tổng hợp các hợp chất như hydrazon, oxim, amid hoặc dị vòng thơm Do sự ảnh hưởng không gian của mạch carbon, so với các ceton có cùng công thức phân tử, các aldehyd có khả năng thực hiện phản ứng ngưng tụ mạnh hơn với các amin [41], [52]

Phản ứng cộng đóng vòng

Gồm các phản ứng đóng vòng azid-alkyn và Diels-Alder Phản ứng cộng đóng vòng Diels-Alder được sử dụng rộng rãi trong tổng hợp hữu cơ và trong hóa học polyme như tổng hợp khối copolyme, hình thành mạng lưới liên kết chéo cao và vật liệu tự phục hồi Phản ứng này được mô tả lần đầu tiên bởi Otto Diels và Kurt Alder vào năm 1928, là phản ứng cộng vòng [4+2] giữa một dien và một dienophil để tạo thành cyclohexen [41], [52]

Khi mới được phát triển, phản ứng đóng vòng azid-alkyn đơn thuần diễn ra chậm, đòi hỏi nhiệt độ cao và tạo ra cả đồng phân thế 1,4 và 1,5 trên vòng 1,2,3-triazol Năm

2002, phản ứng cộng hợp đóng vòng với xúc tác đồng (I) của alkyn và azid (CuAAC – copper (I) catalyzed azid alkyn cycloaddition) được mô tả độc lập bởi hai nhóm nghiên

10 cứu của Sharpless và Meldal Xúc tác đồng (I) cho phép phản ứng chỉ tạo ra một đồng phân duy nhất là sản phẩm thế 1,4 Một chất xúc tác được phát triển cùng Cu(I) cho phản ứng cộng vòng azid-alkyl là Ruthenium (II) Khi sử dụng xúc tác Ru(II), sản phẩm duy nhất tạo thành là đồng phân thế 1,5 [52]

1.4.2 Phản ứng cộng hợp đóng vòng với xúc tác đồng (I) của alkyn và azid

Phản ứng cộng hợp đóng vòng với xúc tác đồng (I) CuAAC là một trong những phản ứng phổ biến nhất trong hóa học Click Phản ứng này trở thành nguồn cảm hứng cho một loạt các phương pháp tổng hợp các cấu trúc phức tạp bằng các phép biến đổi hóa học đơn giản Quy trình phản ứng CuAAC bao gồm các điều kiện phản ứng tương đối dễ dàng cho sản phẩm với hiệu suất cao và quá trình tinh chế đơn giản [2], [23], [29] Tốc độ phản ứng đóng vòng 1,3 – lưỡng cực của azid và alkyn tăng mạnh khi có chất xúc tác thích hợp như các ion kim loại chuyển tiếp, đồng thời có tính đặc hiệu lập thể cao [7], [25] Bên cạnh đó, phản ứng CuAAC tồn tại một số hạn chế như độ an toàn in vivo của các chất xúc tác, một số azid kim loại nặng có thể gây nổ (đặc tính này có nguy cơ lớn trong nghiên cứu trên quy mô lớn) …

Sơ đồ 1.1 Sơ đồ phản ứng Click

Xúc tác đồng (I) không ổn định về mặt nhiệt động và bị oxy hóa thành đồng (II) hoặc chuyển thành hỗn hợp đồng (II) và đồng kim loại Vì vậy, bên cạnh thành công mà phản ứng click CuAAC đã đạt được, các nhà khoa học vẫn đang tìm kiếm chất xúc tác tốt hơn và ổn định hơn để thực hiện phản ứng đóng vòng triazol Tuy nhiên, cho đến nay, đồng (I) vẫn đang là xúc tác tốt nhất cho phản ứng này [9] Các loại Cu(I) tương đối ổn định trong các loại dung môi hữu cơ và trong điều kiện không có nước và oxy Các muối Cu(I) như CuI, CuBr, CuOTf-C6H6 được cho là các chất xúc tác hiệu quả trong dung môi hữu cơ [25] Phản ứng CuAAC có thể được thực hiện với Cu(I) được tạo thành ngay trong phản ứng hoặc dưới dạng muối Cu(I) mà không cần có bất kỳ phối tử nào Tuy nhiên, các phối tử được đưa vào có thể làm tăng tốc độ cho phản ứng hoặc làm giảm lượng Cu(I) cần sử dụng cho phản ứng [9] Trong khóa luận này, nhóm sử dụng xúc tác Cu(I) vì sự sẵn có và các ưu điểm của phản ứng CuAAC cũng như sự phù hợp với hướng thiết kế vòng 1,2,3-triazol thế 1,4

Dung môi được sử dụng cho phản ứng Click được lựa chọn dựa trên các tiêu chí như là tính sẵn có, giá thành thấp, không tương tác với các chất tham gia và sản phẩm của phản ứng Các dung môi cổ điển có thể được sử dụng cho phản ứng là THF, toluen, DCM, MeCN, DMF, DMSO Bên cạnh đó, một số dung môi “xanh” đã được sử dụng

11 để thay thế các dung môi truyền thống vì chúng ít độc hại hơn và tương đối thân thiện với môi trường Các dung môi “xanh” có thể được kể đến như là nước, glycerol, acid lactic, polyetylen gycol… Chúng đã nhận được sự quan tâm các nhà khoa học và được sử dụng rộng rãi trong các phản ứng Click [25]

Sơ đồ 1.2 Sơ đồ cơ chế phản ứng Click CuAAC

Trong phản ứng CuAAC, các chất tham gia không tương tác với nhau cho đến khi xúc tác Cu(I) được thêm vào hỗn hợp phản ứng [2] Các nghiên cứu nhiệt động học cho thấy rằng phản ứng CuAAC diễn ra theo cơ chế từng bước Xúc tác Cu(I) giúp giảm năng lượng hoạt hóa của các giai đoạn trung gian và gia tăng đáng kể tốc độ phản ứng tổng [25] Cơ chế chung (không sử dụng phối tử cho xúc tác đồng) do nhóm của Anand đưa ra bao gồm 6 giai đoạn được thể hiện trong sơ đồ 1.2 [2] Ở giai đoạn đầu tiên, một phần tử đồng (a) kết hợp với alkyn VI tạo thành chất trung gian acetylid B Sự phối hợp này làm tăng tính acid của proton acetylen và giúp cho chất trung gian B dễ dàng trải qua quá trình khử proton với sự có mặt của một phần tử đồng (b) khác tạo thành phức hợp dicuprat C Tiếp theo, azid VII tương tác với phức hợp C thu được trung gian D Bước quan trọng là sự hình thành liên kết C-N diễn ra giữa carbon ái nhân của phần Cu-acetylid và nitơ ái điện tử của azid, cùng với đó, N ái nhân của hợp phần azid tương tác với 2 phần tử đồng của Cu-acetylid tạo thành trung gian E 6 cạnh N ái nhân này sau đó thực hiện chuyển vị để tạo liên kết C-N thứ hai Quá trình này tách loại đi 1 phần tử đồng hình thành vòng 5 cạnh (trung gian F) Cuối

12 cùng là quá trình proton hóa tạo ra sản phẩm cuối cùng là sản phẩm thế 1,4 trên vòng 1,2,3-triazol VIII và tái sinh chất xúc tác Cu(I) [2], [25].

HƯỚNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

Dựa trên cấu trúc pharmacophore gồm 4 phần cơ bản, nhận thấy tiềm năng của các nhóm cấu trúc tương ứng với các phần của 1 chất ức chế HDAC, nhóm nghiên cứu đã thiết kế, tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất N- hydroxyhexanamid (hình 1.8)

Hình 1.8 Thiết kế các dẫn chất mục tiêu của đề tài Nhóm gắn kẽm: Hiện nay, 3 trên 4 thuốc ức chế HDAC được FDA cấp phép sử dụng trong điều trị ung thư mang cấu trúc nhóm ZBG là acid hydroxamic Vì vậy, đề tài sử dụng nhóm hydroxamic là nhóm gắn kẽm của các dẫn chất mới

Vùng cầu nối: Độ dài tối ưu của vùng cầu nối đã được chứng minh trong khoảng

5-6 carbon [34] Do đó, đề tài sử dụng vùng cầu nối là một mạch no gồm 5 carbon để tối ưu hoạt tính của các dẫn chất mới

Nhóm CU: Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vòng 1,2,3-triazol giữ vai trò quan trọng trong các hợp chất hướng ức chế các đích phân tử trong điều trị ung thư Ngoài ra, cũng có nghiên cứu đã chỉ ra rằng vòng triazol có thể đóng vai trò là nhóm CU trong cấu trúc của một chất ức chế HDAC [8]

Vùng nhận diện bề mặt: Khung quinazolin được sử dụng trong nhiều phân tử có hoạt tính với tác dụng đa dạng như kháng sinh [33], [35], điều trị sốt rét [47]… và kháng tế bào ung thư Nhiều dẫn chất mang khung này đã được chứng minh có tác động lên các enzym quan trọng có tham gia vào sự phát triển của ung thư [14], [22], [51], [54]

Vì vậy, khung quinazolin được đề tài sử dụng với vai trò vùng nhận diện bề mặt Để khảo sát ảnh hưởng của các thay đổi trên vùng nhận diện bề mặt, đề tài đã thay đổi loại, vị trí và kích thước của nhóm thế trên khung

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

Các hóa chất, dung môi dùng trong tổng hợp: đạt tiêu chuẩn dùng cho tổng hợp hóa dược (tinh khiết phân tích Analytical Reagent – AR) và chủ yếu có nguồn gốc xuất xứ từ hãng Merck và Sigma-Aldrich Một số dung môi dùng để chiết tách, phân lập được mua từ các nhà cung cấp Trung Quốc Các hóa chất này được sử dụng trực tiếp, không trải qua bất kỳ quá trình tinh chế nào Bao gồm:

- Propargyl bromid (dung dịch 80% trong toluen)

- Hydroxylamin hydroclorid (NH2OH.HCl)

- Các dung môi và hóa chất khác như: đồng (I) iodid (CuI), natri hydroxyd (NaOH), kali carbonat (K2CO3), kali iodid (KI), natri sulfat khan (Na2SO4), sắt (III) clorid (FeCl3), natri hydrocarbonat (NaHCO3), natri carbonat (Na2CO3), nước cất, dicloromethan (DCM), ethyl acetat (EA), N,N-dimethylformamid (DMF), n-hexan, aceton, methanol, ethanol, acetonitril, acid hydroclorid

- Các dụng cụ thủy tinh: bình cầu đáy tròn dung tích 50 ml, 100 ml, 250 ml, bình nón dung tích 100 ml, 250 ml, bình chiết 50 ml, 125 ml, ống nghiệm, ống đong các loại, pipet các loại, phễu thủy tinh, cốc có mỏ các loại

- Bình sắc ký Camag, đèn tử ngoại Vilber bước sóng 254 nm và 365 nm, bản mỏng silicagel F254 (Merck)

- Cân phân tích Shimazu, cân kỹ thuật Shimazu

- Tủ lạnh Memmert, tủ sấy Memmert

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

- Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Máy đo phổ khối lượng Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AC-500 MHz tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Tổng hợp và tinh chế bảy dẫn chất N-hydroxyhexanamid:

• N-Hydroxy-6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1- yl)hexanamid (7a)

• N-Hydroxy-6-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanamid (7b)

• N-Hydroxy-6-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanamid (7c)

• 6-(4-((6-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyhexanamid (7d)

• 6-(4-((7-Fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyhexanamid (7e)

• 6-(4-((6-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyhexanamid (7f)

• 6-(4-((7-Bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)-N- hydroxyhexanamid (7g)

Hình 2.1 Cấu trúc hóa học 7 dẫn chất cần tổng hợp

- Kiểm tra độ tinh khiết của các dẫn chất tổng hợp được bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng

- Khẳng định cấu trúc dựa trên phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR)

2.2.2 Thử tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

15 Thử hoạt tính kháng tế bào in vitro của các dẫn chất tổng hợp được trên một dòng tế bào thường: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi (MRC-5) và hai dòng tế bào ung thư người: ung thư đại tràng (SW620), ung thư vú (MDA-MB-231).

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học

- Dựa trên nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất Các phản ứng được sử dụng bao gồm:

+ Phản ứng đóng vòng tạo khung quinazolin [4]

+ Phản ứng N-alkyl hóa với tác nhân bromid [4]

+ Phản ứng tạo vòng 1,2,3-triazol [26]

+ Phản ứng tạo acid hydroxamic sử dụng hydroxylamin hydroclorid (NH2OH.HCl) với sự có mặt của kiềm mạnh [4]

- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC)

- Tinh chế sản phẩm bằng phương pháp phù hợp

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất sau khi tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng 2 cách:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC):

+ Pha tĩnh là bản mỏng silicagel 60 F254 được hoạt hóa ở 110℃ trong 30 phút + Pha động là hệ dung môi DCM:MeOH với tỷ lệ khác nhau tùy thuộc vào chất phân tích

+ Chất phân tích được hòa tan trong dung môi thích hợp và đưa lên bản mỏng với thể tớch khoảng 2 àl

+ Quan sát kết quả dưới đèn tử ngoại bước sóng 254 nm

- Đo nhiệt độ nóng chảy: xác định bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện Electrothermal digital

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc

Các dẫn chất sau khi được tổng hợp, tinh chế và đánh giá sơ bộ là tinh khiết được khẳng định cấu trúc bằng các phương pháp phổ: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và phổ cộng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR)

- Phổ hồng ngoại (IR): được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr Cách tiến hành như sau:

+ Mẫu sau khi sấy khô ở dạng rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ 1:200, sử dụng áp lực cao nén hỗn hợp thành dạng film mỏng, đồng thời hút chân không để loại bỏ hơi ẩm

+ Quét phổ trong vùng 4000-400 cm -1 và ghi phổ ở độ phân giải 4 cm -1

- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS): được ghi bằng máy khối phổ Agilent

6530 Accurate-Mass QTOF LC/MS (United States) - Viện Hóa Sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng phương pháp ion hóa phun bụi điện từ ESI, dung môi là MeOH, chế độ ESI(+)-HR-MS

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR và 13 C-NMR): được ghi bằng máy Bruker AV-500 tại Khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội với các thông số máy được cài đặt như sau:

+ Phổ 1 H-NMR đo ở tần số 500 MHz, phổ 13 C-NMR đo ở tần số 125 MHz

+ Độ dịch chuyển hóa học (δ) được biểu thị bằng đơn vị phần triệu (ppm), lấy mốc là pic của chất chuẩn nội tetramethylsilan (TMS)

+ Nhiệt độ ghi phổ khoảng 300K

2.3.4 Phương pháp thử tác dụng ức chế tế bào ung thư in vitro

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư (độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại

Khoa Dược, trường Đại học Chungbuk, Cheongju, Hàn Quốc theo phương pháp Sulforhodamin B (SRB) và giá trị IC50 được tính theo phương pháp Probits

Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào sống dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamin B (SRB) Giá trị OD máy đo được tỷ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào sống càng nhiều thì giá trị OD càng lớn

Các dòng tế bào thử nghiệm và chất đối chiếu dương tính

- Thử hoạt tính ức chế tế bào trên một dòng tế bào thường và hai dòng tế bào ung thư gồm:

+ SW620: tế bào ung thư đại tràng người

+ MDA-MB-231: tế bào ung thư vú người

+ MRC-5: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi

Các dòng tế bào này được mua từ Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ sinh học Hàn Quốc (KRIBB) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) có bổ sung một số thành phần cần thiết

- Chất đối chiếu dương tính: SAHA (Vorinostat), ADR (Adriamycin)

Các bước tiến hành Độc tính tế bào của các chất được thực hiện thông qua phương pháp SRB theo các bước sau [3]:

+ Các tế bào ung thư ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán vào hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM được bổ sung 5% FBS Đếm trong buồng đếm để điều

17 chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm (thường là 3 x 10 4 tế bào/ml) Thêm vào mỗi giếng trờn đĩa 96 giếng 180 àL dịch tế bào, rồi đem ủ trong 24 giờ ở 37℃ trong điều kiện 5% CO2

+ Hòa tan chất thử trong DMSO và pha loãng thành các dải nồng độ thích hợp bằng môi trường nuôi cấy Cho chất thử đã pha vào các giếng của đĩa 96 giếng đã ủ trên Giếng không có chất thử nhưng có dịch tế bào ung thư được sử dụng làm đối chứng ngày 0

+ Cố định tế bào và nhuộm màu: Các giếng được ủ thêm 48 giờ ở 37℃ trong điều kiện 5% CO2 Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng dung dịch TCA lạnh trong 1 giờ Tiếp đó, tất cả các giếng được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37℃, rửa 3 lần bằng acid acetic rồi để khô ở nhiệt độ phòng

+ Đo độ hấp thụ màu: Các đĩa sau khi được để khô ở nhiệt độ phòng, phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bằng 100 ml dung dịch chứa 10 mM tris(hydroxymethyl)aminomethan 21 không đệm (pH 10,5), đồng thời đặt đĩa trong máy lắc khoảng 10 phút Độ hấp thụ được đo ở bước sóng 510 nm

- Bước 3: Xử lý số liệu

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (mẫu trắng là giếng chỉ thêm môi trường nuôi cấy) Giá trị này được tính bằng phần mềm GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA, Hoa Kỳ) theo phương pháp Probits và kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 lần thử nghiệm độc lập với độ lệch chuẩn không quá 10%

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN

HÓA HỌC

Các dẫn chất N-hydroxyhexanamid mục tiêu (7a-g) được tổng hợp qua 5 bước như mô tả trong sơ đồ dưới đây:

Sơ đồ 3.1 Quy trình tổng hợp chung của các dẫn chất 7a-g 3.1.1.1 Tổng hợp chất trung gian methyl 6-azidohexanoat (2)

Sơ đồ 3.2 Phản ứng tổng hợp chất trung gian 2 Tiến hành phàn ứng

Hòa tan khoảng 3135 mg (15 mmol) methyl 6-bromhexanoat vào 50 ml methanol, thêm khoảng 4875 mg (5 đương lượng) natri azid vào bình phản ứng Khuấy ở 100℃ trong 8h

Hỗn hợp phản ứng được cô quay dưới áp suất giảm ở 50℃ để loại bỏ methanol Hỗn hợp sau khi cô quay được phân tán vào nước cất rồi chiết phân bố lỏng lỏng với DCM (3 lần x 30 ml), thu dịch DCM Quy trình chiết được lặp lại 2 lần Dịch chiết DCM được làm khan bằng Na2SO4, sau đó chuyển vào bình cầu và cô quay dưới áp suất giảm ở 35℃ để loại bỏ dung môi Sản phẩm của phản ứng được lưu lại để làm nguyên liệu cho bước tiếp theo

- Cảm quan: chất lỏng màu vàng nhạt

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7a) a Tổng hợp chất trung gian quinazolin-4(3H)-on (4a)

Sơ đồ 3.3 Phản ứng tổng hợp chất trung gian 4a Tiến hành phản ứng

Cho 274 mg (2 mmol) acid 2-aminobenzoic (3a) và lượng dư formamid (3 ml) vào bình cầu 100 ml Khuấy hỗn hợp này ở 120℃ trong 6 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 15:1 cho đến khi phản ứng kết thúc

Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp thu được được xử lý bằng cách rót vào dung dịch NaHCO3 5%, chất rắn màu nâu nhạt được hình thành Chất rắn được lọc, rửa và sấy khô để thu được dẫn xuất quinazolinon tương ứng

- Cảm quan: chất rắn màu nâu nhạt

- R f = 0,40 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất trung gian 3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5a)

Cho khoảng 20 ml aceton và 250 mg kali carbonat vào bình cầu chứa 264,3 mg (1,81 mmol) chất trung gian 4a, khuấy hỗn hợp ở 60℃ trong khoảng 1h Sau đó thêm khoảng 271,5 mg dung dịch propargyl brommid 80% trong toluen (tương ứng với 1,81 mmol propargyl bromid) và 20 mg KI vào bình phản ứng, tiếp tục khuấy ở 60℃ trong 5-6 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là DCM:MeOH = 15:1 cho đến khi phản ứng kết thúc

20 Hỗn hợp phản ứng được làm nguội sau đó cô quay dưới áp suất giảm thu cắn Phân tán đều cắn trong bình vào nước cất rồi tiến hành chiết phân bố lỏng lỏng với DCM (3 lần, mỗi lần 30 ml), thu pha DCM Dịch DCM được làm khan bằng Na2SO4 khan, sau đó cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ DCM thu sản phẩm

- Cảm quan: chất rắn màu vàng nhạt

- R f = 0,72 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanoat (6a)

Hòa tan 324,0 mg (1,76 mmol) chất trung gian 5a trong 20 ml acetonitril, thêm khoảng 301,2 mg (1,76 mmol) chất trung gian 2 Thêm vào bình phản ứng khoảng 20 mg CuI Khuấy hồi lưu ở 50℃ trong khoảng 3-4h Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động DCM:MeOH = 15:1

Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ acetonitril thu cắn Phân tán toàn bộ cắn thu được vào 30 ml EA sau đó kiềm hóa bằng 30 ml dung dịch Na2CO3 bão hòa Lọc hỗn hợp thu được qua phễu Buchner với chất trợ lọc Celite để loại chất rắn không tan Gạn lấy lớp EA phía trên, pha nước được tiếp tục chiết phân bố lỏng lỏng với EA (2 lần, mỗi lần 30 ml) Dịch chiết EA được gộp lại rồi làm khan bằng Na2SO4 khan sau đó cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ EA thu sản phẩm là chất rắn màu vàng

- Cảm quan: chất rắn màu vàng

- R f = 0,49 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanamid (7a)

Sơ đồ 3.6 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 7a Tiến hành phản ứng

Hòa tan 553,9 mg (1,56 mmol) chất trung gian 6a trong khoảng 10 ml methanol, thêm khoảng 1000 mg (10 đương lượng) hydroxylamin hydrochlorid vào bình phản ứng Khuấy hỗn hợp ở 0-5℃ trong 15 phút, thêm từ từ dung dịch natri hydroxid bão hòa vào bình phản ứng đến khi pH của hỗn hợp trong bình đạt 11-12 và duy trì pH này trong suốt quá trình phản ứng

Theo dõi phản ứng bằng thuốc thử sắt (III) clorid và TLC, tiến hành như sau:

• Lấy 0,05 ml hỗn hợp từ bình phản ứng cho vào ống eppendorf 5 ml, pha loãng bằng 0,5 ml nước cất

• Acid hóa hỗn hợp bằng dung dịch hydrochlorid 5%, thêm ethyl acetat để chiết lấy sản phẩm

• Chấm pha dung môi hữu cơ lên bản TLC, tiến hành khai triển sắc ký với pha động là DCM:MeOH = 9:1 Sản phẩm được phát hiện bằng dung dịch FeCl3 5%

Sau khi phản ứng kết thúc, thêm vào bình phản ứng 20 mL nước cất lạnh Sau đó, trung hòa hỗn hợp bằng dung dịch HCl 5%, để trong điều kiện lạnh để kết tủa sản phẩm Lọc lấy tủa, rửa tủa bằng nước cất lạnh cho đến khi dịch lọc trung tính Kết tinh lại sản phẩm bằng hỗn hợp dung môi methanol – nước Sấy khô tủa ở 60℃

- Các giá trị R f , hiệu suất toàn phần, nhiệt độ nóng chảy được trình bày cụ thể ở bảng 3.1 và 3.2

3.1.1.3 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((6-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7b) a Tổng hợp chất trung gian 6-methylquinazolin-4(3H)-on (4b)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự chất trung gian 4a, sử dụng

302 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-5-methylbenzoic (3b)

- R f = 0,42 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1)

Sơ đồ 3.7 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7b b Tổng hợp chất trung gian 6-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5b)

291,8 mg (1,82 mmol) chất trung gian 4b

- R f = 0,75 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanoat (6b)

344,9 mg (1,74 mmol) chất trung gian 5b

- R f = 0,52 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H-1,2,3- triazol-1-yl)hexanamid (7b)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7b, sử dụng 559,9 mg (1,52 mmol) chất trung gian 6b

3.1.1.4 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7c)

Sơ đồ 3.8 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7c a Tổng hợp chất trung gian 7-methylquinazolin-4(3H)-on (4c)

302 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-4-methylbenzoic (3c)

- R f = 0,42 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất trung gian 7-methyl-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5c)

288,3 mg (1,80 mmol) chất trung gian 4c

- R f = 0,75 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanoat (6c)

350,4 mg (1,77 mmol) chất trung gian 5c

- R f = 0,52 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-methyl-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7c)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7a, sử dụng 583,8 mg (1,58 mmol) chất trung gian 6c

3.1.1.5 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7d)

Sơ đồ 3.9 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7d a Tổng hợp chất trung gian 6-fluoroquinazolin-4(3H)-on (4d)

310 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-5-fluorobenzoic (3d)

25 b Tổng hợp chất trung gian 6-fluoro-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5d)

286,7 mg (1,75 mmol) chất trung gian 4d

- R f = 0,73 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanoat (6d)

339,0 mg (1,68 mmol) chất trung gian 5d

- R f = 0,50 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((6-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7d)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7a, sử dụng 558,9 mg (1,50 mmol) chất trung gian 6d

3.1.1.6 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7e) a Tổng hợp chất trung gian 7-fluoroquinazolin-4(3H)-on (4e)

310 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-4-fluorobenzoic (3e)

- R f = 0,41 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất trung gian 7-fluoro-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5e)

281,4 mg (1,72 mmol) chất trung gian 4e

Sơ đồ 3.10 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7e c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanoat (6e)

330,3 mg (1,64 mmol) chất trung gian 5e

- R f = 0,50 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-fluoro-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)-1H- 1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7e)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7a, sử dụng 531,9 mg (1,43 mmol) chất trung gian 6e

- Cảm quan: chất rắn màu trắng

3.1.1.7 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7f)

Sơ đồ 3.11 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7f a Tổng hợp chất trung gian 6-bromoquinazolin-4(3H)-on (4f)

432 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-5-bromobenzoic (3f)

- R f = 0,44 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất trung gian 6-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5f)

412,2 mg (1,83 mmol) chất trung gian 4f

- R f = 0,77 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanoat (6f)

469,3 mg (1,78 mmol) chất trung gian 5f

28 d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((6-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7f)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7a, sử dụng 701,6 mg (1,62 mmol) chất trung gian 6f

3.1.1.8 Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)- yl)methyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7g)

Sơ đồ 3.12 Quy trình tổng hợp dẫn chất 7g a Tổng hợp dẫn chất của chất trung gian 7-bromoquinazolin-4(3H)-on (4g)

432 mg (2,0 mmol) acid 2-amino-4-bromobenzoic (3g)

- R f = 0,44 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) b Tổng hợp chất trung gian 7-bromo-3-(prop-2-yn-1-yl)quinazolin-4(3H)-on (5g)

408,2 mg (1,81 mmol) chất trung gian 4g

- R f = 0,77 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) c Tổng hợp chất trung gian methyl 6-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanoat (6g)

459,4 mg (1,75 mmol) chất trung gian 5g

- R f = 0,53 (hệ dung môi DCM:MeOH = 15:1) d Tổng hợp dẫn chất N-hydroxy-6-(4-((7-bromo-4-oxoquinazolin-3(4H)-yl)methyl)- 1H-1,2,3-triazol-1-yl)hexanamid (7g)

Quy trình tổng hợp và xử lý được tiến hành tương tự dẫn chất 7a, sử dụng 668,7 mg (1,54 mmol) chất trung gian 6g

Bảng 3.1 Cảm quan và hiệu suất toàn phần quá trình tổng hợp dẫn chất 7a-g

Chất R Cảm quan Hiệu suất toàn phần (%)

7a H Chất rắn màu vàng nhạt 50,1

7b 6-CH3 Chất rắn màu vàng nhạt 51,6

7c 7-CH3 Chất rắn màu vàng nhạt 53,2

7d 6-F Chất rắn màu vàng nhạt 46,4

7f 6-Br Chất rắn màu vàng nhạt 55,6

7g 7-Br Chất rắn màu vàng nhạt 50,9

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Các dẫn chất 7a-g sau khi tổng hợp và tinh chế được kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) Phương pháp này được thực hiện trên bản mỏng Silica gel F254 với các hệ dung môi pha động là DCM:MeOH (9:1), DCM: MeOH:AcOH (90:5:1) và EA:n-hexan (1:1) Các chất đã tổng hợp được hòa tan bằng dung môi thích hợp, sau đó chấm lên bản mỏng và tiến hành triển khai sắc ký Sau khi kết thúc, sắc ký đồ được quan sát dưới đèn tử ngoại có bước sóng 254 nm Kết quả cho thấy các dẫn chất 7a-g đều có vết tròn, gọn, rõ, không có vết phụ Giá trị R f của các chất trong hệ dung môi DCM:MeOH (9:1) được tổng hợp trong bảng 3.2

Các sản phẩm cuối cùng thu được sau tinh chế đều ở thể rắn Vì vậy, có thể tiến hành đo nhiệt độ nóng chảy bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện để kiểm tra độ tinh khiết Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 3.2

Kết quả cho thấy: các dẫn chất 7a-g có điểm chảy xác định (khoảng dao động hẹp, khoảng 1-2℃)

Bảng 3.2 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các dẫn chất 7a-g

Chất R R f (DCM:MeOH = 9:1) Nhiệt độ nóng chảy (℃)

Như vậy, dữ liệu về sắc ký lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy cho thấy tất cả các chất tổng hợp được đều tinh khiết và đủ điều kiện để xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ

3.1.3 Khẳng định cấu trúc Để khẳng định cấu trúc các chất đã tổng hợp được, các phương pháp: phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon ( 13 C-NMR) đã được sử dụng Kết quả được trình bày dưới đây và trong phần phụ lục

Phổ IR được ghi bằng máy Shimadzu FTIR Affinity-1S tại khoa Hóa học – Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với kỹ thuật viên nén KBr Các phổ đồ được ghi lại ở các phụ lục 1-7 Kết quả phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại được thể hiện trong bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả phổ IR của các dẫn chất 7a-g

Chất R Số sóng ứng với dao động hóa trị của các liên kết (cm -1 ) ν O-H ν C-H (sp2) ν C-H (sp3) ν C=O ν C=C ν N=N

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG SINH HỌC

Các dẫn chất 7a-g được đánh giá khả năng kháng tế bào ung thư in vitro trên 2 dòng tế bào ung thư là tế bào ung thư đại tràng (SW620) và tế bào ung thư vú (MDA- MB-231) cùng 1 dòng tế bào thường MRC-5 (dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi) với chất chứng dương là acid suberoylanilid hydroxamic (SAHA) và adriamycin (ADR) Kết quả được trình bày ở bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả đánh giá độc tính trên một số dòng tế bào (IC50)

Hợp chất R LogP 1 Độc tính tế bào (IC 50 2

, àM)/ Dũng tế bào 3 SW620 MDA-MB-231 MRC-5

Chỳ thớch: 1 Tớnh toỏn bằng phần mềm Chemdraw 20.1.1; 2 Nồng độ (àM) ức chế 50% sự phỏt triển của tế bào thử nghiệm, được biểu diễn bằng giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập; 3 Dòng tế bào thử nghiệm: SW620: ung thư đại tràng, MDA-MD-231: ung thư vú, MRC-5: dòng tế bào nguyên bào sợi phổi ở thai nhi; 4 SAHA (suberoylanilid hydroxamic acid): chất đối chiếu dương tính; 5 ADR (adriamycin): chất đối chiếu dương tính

Nhận xét: Dựa vào bảng 3.7, có thể nhận thấy các chất tổng hợp được đều có khả năng ức chế ít nhất 1 dòng tế bào thử nghiệm.

BÀN LUẬN

3.3.1.1 Phản ứng đóng vòng quinazolin

Phản ứng đóng vòng giữa các dẫn chất của acid 2-aminobenzoic với formamid được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ cao Formamid là chất tham gia đồng thời là dung môi cho phản ứng, nó được dùng với lượng tối thiểu với mục đích giúp xử lý phản ứng dễ dàng hơn Ngoài ra, formamid có khả năng hòa tan trong nước nên dễ dàng loại đi khỏi hỗn hợp phản ứng khi tủa sản phẩm trong nước Phản ứng được tiến hành ở nhiệt độ 120℃ Ở nhiệt độ này, các acid 2-aminobenzoic hòa tan vào formamid giúp tăng khả năng tiếp xúc của các phân tử 2 chất, do đó làm tăng tốc độ phản ứng Nhiệt độ phản ứng cao hơn nhiệt độ sôi của nước (100℃) làm bay hơi nước và giảm lượng nước sinh ra trong hỗn hợp phản ứng Điều này thúc đẩy phản ứng chuyển dịch về chiều thuận theo nguyên lý Le Chatelier

Sơ đồ 3.13 Cơ chế đề xuất cho phản ứng đóng vòng tạo dẫn chất quinazolin-4(3H)-on

Phản ứng trải qua nhiều giai đoạn với sự tạo thành một chất trung gian có thể được phát hiện trên sắc ký lớp mỏng (TLC) Cơ chế của phản ứng được trình bày ở sơ đồ 3.13 Phản ứng bắt đầu bằng sự tấn công ái nhân của cặp điện tử tự do trên nguyên tử N của amin thơm vào nguyên tử C trong nhóm C=O của formamid, sau đó một phân tử nước được loại đi để tạo thành trung gian 3’ Giả thuyết này phát triển dựa trên sự phát hiện

37 vết sản phẩm phụ trên bản mỏng silica gel Chất này dễ dàng bị loại bỏ khi phân tán hỗn hợp phản ứng trong NaHCO3 để tinh chế sản phẩm Trung gian 3’ sau đó tiếp tục ngưng tụ nội phân tử và loại đi phân tử nước thứ 2 để tạo thành các dẫn xuất quinazolin-4(3H)- on 4 Phản ứng sau khi hoàn thành được xử lý bằng cách kết tủa trong dung dịch

NaHCO3 bão hòa Hỗn hợp phản ứng khi nguội đi sẽ chuyển thành trạng thái rắn, gây khó khăn cho việc xử lý, vì vậy, sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp phản ứng sẽ được đổ vào cốc chứa dung dịch NaHCO3 bão hòa ngay khi còn nóng Môi trường base giúp acid ban đầu dư và trung gian 3’ (nếu còn) tan vào dung dịch và không kết tủa cùng sản phẩm là dẫn xuất quinazolin-4(3H)-on

3.3.1.2 Phản ứng N-alkyl hóa a Phản ứng N-alkyl hóa của N trên vòng quinazolin

Phản ứng N-alkyl hóa giữa các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on và tác nhân propargyl bromid trong điều kiện xúc tác K2CO3 và KI, dung môi aceton dưới tác dụng của nhiệt độ được diễn ra dễ dàng với hiệu suất cao (trên 90%) Dung môi được sử dụng trong phản ứng này là aceton, một dung môi phổ biến được được sử dụng nhiều trong phản ứng N-alkyl hóa bên cạnh các dung môi khác như DMF, MeCN [26]

Sơ đồ 3.14 Cơ chế đề xuất cho phản ứng thế ái nhân giữa các dẫn xuất quinazolin-

4(3H)-on và propargyl bromid với xúc tác K 2 CO 3 và KI

N-3 của khung quinazolin có tính ái nhân yếu do sự hiện diện của nhóm carbonyl liền kề, vì vậy, để tăng tính ái nhân của nitơ này, các dẫn chất quinazolin-4(3H)-on được hoạt hóa bằng base nhằm chuyển dạng phân tử sang dạng anion Một số base thường được sử dụng như: các muối carbonat (Na2CO3, K2CO3, Cs2CO3), các hydrid (LiH, NaH, CaH2), triethylamin (TEA), LiOH [21] Khóa luận chọn sử dụng K2CO3 do tính sẵn có của hóa chất này Cơ chế xúc tác của phản ứng được đề xuất trong sơ đồ 3.14 Giai đoạn hoạt hóa được tiến hành ở 60℃ để tăng tốc độ phản ứng

Tác nhân alkyl bromid được lựa chọn thay vì clorid, iodid hay fluorid do alkyl bromid bền hơn, khả năng phản ứng tốt, phổ biến và có giá thành rẻ Bên cạnh đó, do khả năng phản ứng của alkyl bromid kém hơn so với alkyl iodid, một lượng nhỏ KI được thêm vào hỗn hợp phản ứng để tạo phản ứng trao đổi halogen tại chỗ, giúp tăng tốc độ

38 và hiệu suất phản ứng Tỷ lệ mol của chất tham gia phản ứng ảnh hưởng đến mức độ tinh khiết của sản phẩm, việc dùng quá thừa tác nhân có thể gây khó khăn cho việc tinh chế sản phẩm, do vậy, khóa luận lựa chọn tỷ lệ mol là 1 mol dẫn chất quinazolin-4(3H)- on với 1 mol propargyl bromid để tránh lãng phí hóa chất cũng như hạn chế tạp chất sinh ra b Phản ứng N-alkyl hóa tạo dẫn chất azid

Phản ứng tạo dẫn chất azid của methyl 6-bromohexanoat sử dụng tác nhân natri azid trong dung môi là methanol ở 100℃ sau khoảng 8 giờ Do không theo dõi được quá trình phản ứng diễn ra, khóa luận lựa chọn dùng dư tác nhân azid hóa NaN3 (tỷ lệ đương lượng mol là 1:5), đồng thời liên tục khuấy trộn và cấp nhiệt để phản ứng đạt hiệu suất tốt nhất

Sơ đồ 3.15 Cơ chế đề xuất cho phản ứng azid hóa

Phản ứng xảy ra với cơ chế tương đối đơn giản với sự tấn công của cặp điện tử tự do trên nguyên tử N âm điện trong ion N3 - và tách loại nguyên tử brom trên phân tử methyl 6-bromohexanoat Hỗn hợp phản ứng được xử lý bằng cách cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ dung môi MeOH, sau đó chiết phân bố lỏng lỏng (DCM, nước cất) để loại bỏ các tạp tan trong nước như NaN3 còn dư Dịch chiết DCM được thu lại, làm khan bằng Na2SO4 khan sau đó cô quay dưới áp suất giảm để loại DCM và thu lấy sản phẩm

Phản ứng đóng vòng 1,2,3-triazol giữa alkyn và sản phẩm azid hóa với xúc tác đồng (I) iodid trong dung môi acetonitril ở 50℃ Acetonitril được sử dụng làm dung môi cho phản ứng vì khả năng hòa tan tốt cả 2 chất tham gia và dễ dàng tách loại bằng phương pháp cô quay dưới áp suất giảm Cơ chế chung của phản ứng sử dụng xúc tác đồng (I) iodid đã được trình bày sơ đồ 1.2 Sự có mặt của Cu(I) trong hỗn hợp giúp phản ứng xảy ra và định hướng phản ứng chọn lọc tạo thành dẫn chất thế 1,4 trên vòng 1,2,3- triazol [2] Phản ứng được tiến hành dưới nhiệt độ khoảng 50℃ nhằm tăng tốc độ và hiệu suất của phản ứng

Bước đầu của quá trình xử lý phản ứng là cô quay dưới áp suất giảm để loại bỏ acetonitril thu cắn Các muối của đồng (II) tan trong nước được loại bỏ bằng phương pháp chiết phân bố lỏng lỏng với 2 pha là EA và dung dịch Na2CO3 bão hòa, thu pha

EA Đồng (I) không tan trong cả 2 pha dung môi trong quá trình chiết được loại đi bằng cách lọc qua phễu Buchner với Celite trợ lọc Cuối cùng, dịch chiết được làm khan bằng

Na2SO4 khan rồi cô quay dưới áp suất giảm để thu hồi dung môi và thu sản phẩm

39 Phản ứng tạo acid hydroxamic được thực hiện giữa ester và hydroxylamin hydroclorid trong dung môi MeOH [49] Theo nhóm nghiên cứu của Reddy, NaOH là một tác nhân thích hợp dùng để tạo pH phù hợp (11-12) cho phản ứng hydroxamic hóa giữa hydroxylamin với ester [36] Đồng thời, NaOH cũng chuyển dạng muối hydroxylamin hydroclorid thành hydroxylamin tự do để phản ứng có thể xảy ra và tạo muối với sản phẩm hydroxamic tạo thành Tuy nhiên, trong môi trường kiềm mạnh, các ester có thể bị thủy phân tạo thành tạp acid carboxylic khó loại bỏ Để khắc phục hạn chế này, phản ứng được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp (0-5℃) và thêm từ từ dung dịch NaOH bão hòa đã được làm lạnh để tránh tăng pH và nhiệt độ cục bộ tại một vị trí trong bình phản ứng Cơ chế đề xuất của phản ứng hydroxamic hóa được trình bày trong sơ đồ 3.16 Sau khi phản ứng kết thúc, hỗn hợp được trung hòa bằng dung dịch HCl 5% đến pH gần trung tính để thu lấy sản phẩm hydroxamic hóa kết tủa dưới dạng phân tử

Sơ đồ 3.16 Cơ chế đề xuất của phản ứng hydroxamic hóa trong môi trường kiềm/MeOH, nước

Phổ hồng ngoại IR được xác định dựa trên sự hấp thụ bức xạ IR của mẫu chất nghiên cứu Phương pháp này ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết giữa các nguyên tử Trong vùng từ 4000-400cm -1 , phổ IR được chia làm hai vùng nhỏ hơn: vùng nhóm chức 4000-1500cm -1 và vùng vân tay 1500-400cm -1 Vùng nhóm chức thường cung cấp được thông tin về các dải hấp thụ đặc trưng của các liên kết trong nhóm chức Trong khi đó, vùng vân tay thường xuất hiện nhiều pic chồng chéo lên nhau do mức năng lượng tương ứng của vùng này có thể được hấp thụ bởi nhiều liên kết với các dao động khác nhau [10] Do vậy, khóa luận sẽ tập trung biện giải kết quả vùng nhóm chức, từ đó đưa ra kết luận về cấu trúc của các dẫn chất vừa tổng hợp được

Tiêu đề	Tổng hợp và thử tác dụng ức chế tế bào ung thư của một số dẫn chất N-hydroxyhexanamid mới mang dị vòng triazol
Tác giả	Nguyễn Đức Tú
Người hướng dẫn	TS. Dương Tiến Anh, PGS. TS. Phan Thị Phương Dung
Trường học	Trường Đại học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Dược Sĩ
Thể loại	Khóa luận tốt nghiệp
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	93
Dung lượng	5,22 MB