Khóa luận nghiên cứu tác động ức chế tế bào ung thư in vitro của cao chiết vỏ quả xuyên tiêu (zanthoxylum simulans hance)

TỔNG QUAN

Tổng quan về ung thư

Ung thư là một bệnh phức tạp, xuất phát từ những biến đổi di truyền như đột biến gene và thay đổi biểu sinh của các gene Những biến đổi này liên quan đến các vùng nhiễm sắc thể có thể kích thích sự phát triển của ung thư hoặc làm giảm khả năng ức chế ung thư.

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ung thư có thể khởi phát từ hầu hết mọi cơ quan hoặc mô trong cơ thể Khi các tế bào bất thường phát triển không kiểm soát, chúng xâm lấn các bộ phận lân cận và có thể lan sang các cơ quan khác, hiện tượng này được gọi là di căn Di căn là nguyên nhân chính gây tử vong do ung thư.

1.1.2 Dịch tễ học bệnh ung thư

Theo thống kê của GLOBOCAN năm 2020, tình hình mắc và tử vong do ung thư trên toàn cầu đang gia tăng Cụ thể, có hơn 19 triệu ca mắc mới, trong đó ung thư vú chiếm tỷ lệ lớn nhất với 11,7%, tiếp theo là ung thư phổi với 11,4% Về số ca tử vong, hơn 9 triệu ca được ghi nhận, trong đó ung thư phổi là nguyên nhân hàng đầu với 18%, và ung thư trực tràng đứng thứ hai với 9,4%.

Tình hình mắc mới và tử vong do ung thư đang gia tăng ở nhiều quốc gia, bao gồm cả các nước phát triển như Anh, Pháp, Ý, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Hoa Kỳ Dù vậy, tỷ lệ tử vong do ung thư tại những quốc gia này lại có xu hướng giảm.

Hình 1.1 Biểu đồ thống kê số ca mắc mới ung thư trên thế giới năm 2020

Hình 1.2 Biểu đồ thống kê số ca tử vong do ung thư trên thế giới năm 2020

Theo báo cáo GLOBOCAN 2020, tình hình ung thư toàn cầu đang gia tăng, với Việt Nam ghi nhận 182.563 ca mắc mới và 122.690 ca tử vong Tỷ lệ mắc ung thư là 159 ca trên 100.000 người, trong khi tỷ lệ tử vong là 106 ca trên 100.000 người.

Hình 1.3 Biểu đồ thống kê số ca mắc mới ung thư năm 2020 tại Việt Nam

Các loại ung thư phổ biến ở nam giới bao gồm ung thư gan, phổi, dạ dày, đại trực tràng và tiền liệt tuyến, chiếm khoảng 65,8% tổng số ca ung thư Ở nữ giới, các loại ung thư phổ biến nhất là ung thư vú, phổi, đại trực tràng, dạ dày và gan, chiếm khoảng 59,4% tổng số ca ung thư Cả hai giới đều có chung những loại ung thư phổ biến như gan, phổi, vú, dạ dày và đại trực tràng.

Hình 1.4 Biểu đồ thống kê số ca mắc mới ung thư năm 2020 ở nam giới tại

Hình 1.5 Biểu đồ thống kê số ca mắc mới ung thư năm 2020 ở nữ giới tại

1.1.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư

Các cơ chế phát sinh ung thư đã được nghiên cứu kỹ lưỡng, bao gồm sự mất kiểm soát trong chu kỳ phân chia tế bào và sự thay đổi trong các con đường tín hiệu như Apoptosis, Notch, EGFR và PI3K.

Các tác nhân gây đột biến như hóa chất độc hại, tia phóng xạ và virus ung thư có thể làm thay đổi gen hoặc nhiễm sắc thể của tế bào bình thường, dẫn đến mất khả năng kiểm soát sự phân chia và liên kết tế bào Khi vật liệu di truyền bị hư hỏng, các tế bào “lỗi” sẽ tăng sinh một cách vô tổ chức, hình thành các tế bào ung thư Những tế bào ung thư này không chết theo chương trình apoptosis mà tiếp tục nhân lên một cách mất kiểm soát, tạo thành khối u.

Đột biến gen gây ra mất kiểm soát chu kỳ tế bào là một trong những cơ chế chính gây bệnh ung thư Trong cơ thể, có hai nhóm gen quan trọng là gen quy định yếu tố sinh trưởng và gen ức chế khối u Ở các tế bào bình thường, hai nhóm gen này hoạt động hài hòa để kiểm soát sự phát triển tế bào Tuy nhiên, khi xảy ra đột biến, cơ chế này bị phá hủy, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát của tế bào và hình thành khối u.

1.1.4 Nguyên nhân gây ung thư

Việc sử dụng thuốc lá là nguyên nhân gây ra 22% số ca tử vong vì ung thư, trong khi 10% khác liên quan đến béo phì, chế độ ăn uống kém, lười vận động và tiêu thụ rượu quá mức Ngoài ra, ung thư còn do phơi nhiễm với bức xạ và ô nhiễm môi trường Tại các nước đang phát triển, gần 20% trường hợp ung thư xuất phát từ sự tiếp xúc với vi khuẩn hoặc virus như Helicobacter pylori và viêm gan.

B, viêm gan C, virus Epstein–Barr, nhiễm virus papilloma (HPV virus) và HIV (Human Immunodeficiency Virus) [9, 12] Các nhân tố này tác động bằng cách, ít nhất là góp phần, làm thay đổi các gen trong tế bào Thông thường, tế bào cần tích lũy một lượng không nhỏ những biến đổi về gen trước khi phát triển thành ung thư Cũng có khoảng 5 – 10% bệnh ung thư là do di truyền các khuyết tật về gen từ trong gia đình [16]

1.1.5 Phương pháp phổ biến sử dụng trong điều trị ung thư

Cắt bỏ khối u b Tác dụng phụ:

+ Cảm giác đau sau mổ

+ Các tác dụng phụ khác tùy thuộc vào khối u ở khu vực nào và loại phẫu thuật thực hiện [17]

Sử dụng chùm tia năng lượng cao để tiêu diệt và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư, bao gồm tia xạ ngoài và tia xạ áp sát Tuy nhiên, phương pháp này cũng có thể gây ra một số tác dụng phụ không mong muốn.

Mệt mỏi là triệu chứng phổ biến mà hầu hết người bệnh trải qua sau vài tuần xạ trị, do quá trình này tiêu diệt không chỉ các tế bào ung thư mà còn cả một số tế bào khỏe mạnh.

8 bào ung thư Mức độ mệt mỏi thường nặng lên khi điều trị tiếp tục [17-

Da ở khu vực điều trị bức xạ có thể xuất hiện các triệu chứng như đỏ, mẫn cảm, sưng, nổi mụn nước, cháy nắng hoặc rám Sau vài tuần, bệnh nhân có thể gặp tình trạng da khô, nứt nẻ, ngứa hoặc bong tróc.

Rụng tóc là một tác dụng phụ thường gặp sau khi tiếp xúc với tia xạ, dẫn đến việc tóc và lông có thể bị rụng ở vùng điều trị Mặc dù tóc có thể mọc trở lại sau khi kết thúc liệu trình, nhưng thường sẽ mỏng hơn hoặc có kết cấu khác so với trước đây.

+ Giảm hồng cầu, bạch cầu hoặc tiểu cầu: Xạ trị có thể gây ra những thay đổi về công thức máu [17-23]

Tổng quan về chi Zanthoxylum

1.2.1 Vị trí phân loại chi Zanthoxylum

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan (2009), chi Zanthoxylum có vị trí phân loại như sau [25]:

Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida) Phân lớp: Hoa Hồng (Rosidae) Bộ: Cam (Rutales)

Họ: Cam (Rutaceae) Phân họ: Cửu lý hương (Rutoideae) Chi: Xuyên tiêu (Zanthoxylum)

1.2.2 Đặc điểm thực vật chi Zanthoxylum

Cây gỗ, cây bụi hoặc dây leo thường xanh quanh năm hoặc rụng lá, với chiều cao trung bình từ 5 – 15 m, mặc dù một số cây gỗ lớn có thể đạt tới 35 m, đường kính thân ngang ngực lên tới 60 cm Thân và cành của cây thường có nhiều gai nhọn hoặc sần sùi, với màu xám hoặc màu nâu nhạt Lá cây thường mọc so le, là lá kép lông chim lẻ, có cuống và không có lá kèm, với bề mặt có thể không có lông hoặc có lông nhung.

15 đôi lá chét có thể mọc cách hoặc mọc đối, với mép lá nguyên hoặc có răng nhỏ Giữa các khe răng cưa thường xuất hiện tuyến tinh dầu tương đối lớn.

Cụm hoa thường mọc ở nách hoặc ngọn, có dạng chùm, xim hoặc chùy, hiếm khi đơn độc Hoa có thể lưỡng tính hoặc đơn tính, bao hoa gồm hai lớp với đài tràng rời và tràng hoa có 4-5 cánh Bộ nhị gồm 4-10 nhị, thường thoái hóa ở hoa cái, trong khi bầu thượng chứa 1-5 lá noãn rời với mỗi lá noãn chứa 1-2 noãn, có cuống bầu Ở hoa đực, bầu và nhụy thường thoái hóa.

Quả nang có vỏ ngoài điểm dầu, khi chín, vỏ trong rời nhau, mỗi mảnh quả chứa 1-2 hạt gắn trên cuống noãn phình to Rốn hạt có dạng sợi ngắn, phẳng; hạt có hình bầu dục hoặc hình trứng, vỏ hạt tròn, màu nâu hoặc đen, bóng Phôi nhũ nạc rất ngắn, phôi có thể thẳng hoặc hơi cong, với lá mầm mỏng và dẹt.

1.2.3 Đặc điểm phân bố chi Zanthoxylum

Chi Zanthoxylum, thuộc họ Rutaceae, là chi lớn nhất với khoảng 250 loài được phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đới trên toàn cầu, đặc biệt tập trung nhiều nhất ở Nam Mỹ Đông Nam Á cũng có khoảng hơn 20 loài, trong khi chỉ một số ít loài xuất hiện ở các khu vực ôn đới ẩm như Đông Á, Bắc Mỹ, quần đảo Thái Bình Dương và Australia.

Tại Việt Nam, có 14 loài thuộc chi Zanthoxylum [26]:

12 Zanthoxylum usitatim Pierre ex Laness

Tổng quan về loài Zanthoxylum simulans

Cây bụi có thể cao từ 3 đến 7 mét, với thân và cành có gai cùng vỏ cây mang mùi thơm đặc trưng Lá kép của cây mọc so le, có rãnh cánh với các gai cong, trong khi lá chét không cuống, mọc đối, có hình trái xoan với kích thước từ 2,5 đến 7 cm chiều dài và 1,8 đến 4,0 cm chiều rộng, màu xanh lá cây và có sọc dọc.

Hoa nhỏ, màu vàng lục, mọc ở nách lá hoặc đầu chùy dài 1 – 5 cm, có bao hoa xếp thành 1 hoặc 2 loạt với 5 – 8 lá đài không phân biệt Hoa đực có 5 – 8 nhị, trong khi hoa cái có 2 – 3 lá noãn kiểu vòng lại Quả hình cầu, màu đỏ, đường kính 4 – 5 mm, với vỏ sần sùi chứa tinh dầu và mặt trong màu trắng, nhẵn Hạt có hình cầu hoặc gần cầu, màu đen bóng, đường kính 3 – 4 mm.

Hình 1.6 Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum simulans Hance.) [8]

1.3.2 Phân bố và thu hái

Cây Xuyên tiêu, một loại cây mọc hoang ở vùng khí hậu nhiệt đới, phân bố rộng rãi tại các tỉnh miền Bắc Việt Nam như Lào Cai, Hòa Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, và khu vực miền Trung gồm Nghệ An, Hà Tĩnh, Đăk Lăk Cây thường xuất hiện ở độ cao dưới 600 mét, chủ yếu tại các vùng núi thấp và trung du Ngoài Việt Nam, cây cũng được tìm thấy nhiều ở phía Đông Trung Quốc, Đài Loan, Triều Tiên, Campuchia và Lào.

Rễ, cành và lá có thể thu hái quanh năm, trong khi phần vỏ của thân cây được thu hái vào mùa xuân Quả được thu hái khi chưa chín từ tháng 5 đến tháng 6, và khi chín thường từ tháng 8 đến tháng 9.

Zanthoxylum simulans Hance chứa nhiều loại hợp chất hóa học, bao gồm terpen, alcol, ester, alkaloid, phenolic và các hợp chất dễ bay hơi, chủ yếu là tinh dầu [7, 31-40]

Trong quả của Zanthoxylum simulans, đã xác định được 43 hợp chất thuộc nhóm chất dễ bay hơi, bao gồm 20 terpen, 10 alcol, 8 ester và 5 thành phần khác Các hợp chất dễ bay hơi chính, chiếm hơn 10%, bao gồm β-myrcene, limonene, 1,8-cineole và (Z)-β-ocimene Ngoài ra, một số thành phần nhỏ khác như isobutyl axetat, isoamyl axetat và α-terpinene cũng được phát hiện Một nghiên cứu khác cho thấy có tới 108 hợp chất tinh dầu dễ bay hơi trong màng ngoài quả.

Zanthoxylum simulans contains essential oil components primarily found in its rind, including 1,8-cineole (17.91%), limonene (12.66%), β-elemene (9.81%), (-)-α-terpineol (7.61%), β-selinene (4.81%), and α-selinene (3.79%) The seeds are rich in various fatty acids, notably 9-hexadecenoic acid (35.89%), hexadecanoic acid (17.70%), oleic acid (11.68%), linoleic acid (4.72%), and methyl ester of 9,12,15-octadecatrienoic acid (4.72%).

Từ quả của Zanthoxylum simulans, sáu hợp chất không thuộc nhóm tinh dầu đã được phân lập, trong đó hai hợp chất quan trọng là trielaidin và arbutin Từ rễ của cây, mười một hợp chất đã được tách ra, bao gồm bảy hợp chất đã được xác định, như glyceryl trilinoleate, -eudesmol, -sitosterol, -amyrin, des-N-methyc-helerythrine, heptacosane và nodakenetin.

The primary alkaloid found in Zanthoxylum simulans is chelerythrine, along with smaller amounts of dihydro-chelerythrine, oxy-chelerythrine, N-acetylanomine, skimmianine, fagarine, sitosterol, and sesamine Several alkaloids have been identified from the bark and roots of Z simulans, as reported by researchers Wu, Chen, Yang, and colleagues.

+ Một pyrrole alkaloid là pyrrolezanthine có công thức hóa học là 5- hydroxymethyl-1-[2-(4-hydroxyphenyl)-ethyl]-1H-pyrrole-2- carbaldehyd;

+ Một lignan là (−)-simulanol có công thức hóa học là 4-[3- hydroxymetyl-5-((E)-3-hydroxypropenyl)-7-methoxy-2,3- dihydrobenzofuran-2-yl]-2,6-dimethoxy-phenol;

+ Một γ-pyrone đơn vòng là zanthopyranone có công thức hóa học 3,5- dimethoxy-2-methyl-pyran-4-one;

+ Hai hợp chất thuộc nhóm alkaloid benzo[c]phenanthridine là 6-metyl dihydro chelerythrine và 6-metyl norchelerythrine;

+ Các hợp chất thuộc nhóm pyranoquinoline alkaloid là zanthosimuline, huajiaosimuline, simulenoline, peroxysimulenoline, benzosimuline và zanthodioline;

+ Một alkaloid 2-quinolone dimeric là zanthobisquinolone có công thức hóa học bis-(4-hydroxy-2-keto-1-methyl-3-quinolinyl) methylene;

Nhà khoa học Chang và các cộng sự đã phân lập thành công skimmianine, edulinine, (±) ribalinine, và (±) araliopsine từ rễ và vỏ rễ của cây Zanthoxylum simulans Đồng thời, Peng và các cộng sự cũng đã xác định được các lignan như zanthoxylumin A, zanthoxylumin B, (2)-magnolin, và (2)-pinoresinol-di-3,3-dimethylallyl ether có trong vỏ cây.

Hình 1.7 Công thức cấu tạo của một số hợp chất hóa học có trong loài

1.3.4 Công dụng theo Y học cổ truyền Ở Trung Quốc, Zanthoxylum simulans là một trong những cây thảo dược phổ biến nhất, có thể dùng quả lá và rễ để làm thuốc:

Vỏ quả có vị cay và tính ấm, được sử dụng để giảm đau, tiêu diệt giun, bổ trợ cho tỳ vị, điều trị chứng ẩm thấp, ngứa ngoài da và đau răng hoại tử.

Hạt có vị đắng, hăng và tính mát, giúp lợi tiểu và giảm phù thũng Trong khi đó, rễ cây có vị cay nồng và tính hơi ấm, có tác dụng chữa các bệnh liên quan đến tiêu hóa và điều trị rắn cắn.

Quả Xuyên tiêu có tác dụng tống hơi, lợi tiểu, và kích thích ra mồ hôi, thường được sử dụng trong điều trị đau dạ dày, khó tiêu do lạnh, kèm theo nôn mửa, tiêu chảy và giun đũa Ngoài ra, quả này còn được áp dụng để gây tê cục bộ và diệt sán dây lợn.

+ Lá được sử dụng để tống hơi, chống viêm và lợi tiểu [32, 41]

Tại Việt Nam, Xuyên tiêu cũng được sử dụng trong nhiều bài thuốc Đông y và trong dân gian với các công dụng tương tự:

+ Dùng 6 – 12 g rễ cây dạng sắc hoặc ngâm rượu để chữa sốt, sốt rét, thấp khớp

Quả Xuyên tiêu có nhiều công dụng như tán hàn, trừ thấp, ôn trung, trợ hỏa, giúp trục giun đũa và kích thích tiêu hóa Đặc biệt, quả xanh được sử dụng để thanh nhiệt, giảm đau và giải độc.

Nghiên cứu dược lý cho thấy Xuyên tiêu có nhiều tác dụng quan trọng, bao gồm khả năng chống viêm, kháng khuẩn, tiêu diệt ấu trùng, ngăn ngừa vi khuẩn, chống ung thư và chống tăng sinh, gây độc tính đối với tế bào khối u, cũng như tác dụng chống kết tập tiểu cầu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu sử dụng vỏ quả Xuyên tiêu, được thu mua tại Hà Nội vào tháng 12 năm 2022 Nguyên liệu này đã được sấy khô và bảo quản trong túi nilon kín để đảm bảo chất lượng.

Mẫu nghiên cứu được giám định bởi Bộ môn Dược liệu và Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN, có tên khoa học là Zanthoxylum simulans Hance, thuộc họ Rutaceae Mẫu vật hiện đang được lưu giữ tại Trường Đại học Y Dược, ĐHQGHN.

Hình 2.1 Vỏ quả Xuyên tiêu khô thu mua tại Hà Nội

2.1.1.2 Các dòng tế bào ung thư sử dụng trong nghiên cứu

Các dòng tế bào do GS.TS J.M.Pezzuto, Trường Đại học Long-Island,

US và GS Jeanette Maier, Trường Đại học Milan, Italia cung cấp, bao gồm:

+ MKN-7: Ung thư dạ dày ở người (Human gastric carcinoma)

+ SK-LU-1: Ung thư phổi ở người (Human lung carcinoma)

+ HepG2: Ung thư gan ở người (Human hepatocellular carcinoma) + Hela: Ung thư cổ tử cung ở người (Human cervical carcinoma)

+ Dung môi chiết xuất toàn phần: Ethanol 70% (EtOH 70%)

+ Dung môi chiết phân đoạn: n-Hexan, Ethyl acetat (EtOAc), Butanol (BuOH)

The cell culture environment typically utilizes DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) or MEME (Minimum Essential Medium with Eagle salts), enriched with essential components such as L-glutamine, sodium pyruvate, NaHCO3, and penicillin/streptomycin Additionally, the medium is supplemented with 10% Fetal Bovine Serum (FBS) and 0.05% Trypsin-EDTA to support optimal cell growth and maintenance.

Essential chemicals used in assessing the cytotoxic activity of cancer cells include Dimethyl sulfoxide (DMSO), Trichloroacetic acid (TCA), Tris base, Phosphate Buffered Saline (PBS), Ellipticine, Sulforhodamine B (SRB), and Acetic acid.

+ Kính hiển vi ngược: Axiovert 40 CFL

+ Buồng đếm tế bào: Fisher, Hoa Kỳ

+ Máy quang phổ: ELISA Plate Reader, BioTek

+ Dụng cụ thí nghiệm: pipet, ống nghiệm, bình chiết, cốc có mỏ, bình gạn, đũa thủy tinh, cốc có mỏ, bình thủy tinh,…

+ Các thiết bị khác: tủ hotte, cân phân tích, máy đo pH,

Nội dung nghiên cứu

Nhằm đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế thực hiện với các nội dung dưới đây:

Nội dung 1: Chiết xuất cao dược liệu toàn phần và phân đoạn

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của dịch chiết toàn phần vỏ quả Xuyên tiêu

Nội dung 3: Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư của các phân đoạn dịch chiết vỏ quả Xuyên tiêu.

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu

Dựa trên các phương pháp chiết xuất dược liệu đã được nghiên cứu trước đây, chúng tôi thực hiện quy trình chiết xuất theo các bước chính.

+ Bước 1: Chuẩn bị nguyên liệu

+ Bước 2: Tạo cao chiết toàn phần với dung môi EtOH 70%

+ Bước 3: Tạo các phân đoạn cao chiết với ba loại dung môi có độ phân cực tăng dần: n-Hexan, EtOAc và BuOH

2.2.2 Phương pháp đánh giá tác động ức chế tế bào ung thư dịch chiết vỏ quả Xuyên tiêu

Phép thử độ độc tế bào in vitro theo phương pháp của Skehan và cộng sự (1990) được thực hiện để xác định hàm lượng protein tổng số trong tế bào Hàm lượng protein này được đo bằng mật độ quang học (OD) sau khi tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB).

Giá trị OD của máy đo tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn kết với phân tử protein Do đó, khi số lượng tế bào tăng lên, lượng protein cũng sẽ gia tăng, dẫn đến giá trị OD cao hơn.

Để tiến hành thí nghiệm, bước đầu tiên là trypsin hóa tế bào để tách rời chúng, sau đó đếm số lượng tế bào trong buồng đếm nhằm điều chỉnh mật độ cho phù hợp Cuối cùng, đưa 190 µL tế bào vào đĩa 96 giếng để thực hiện thử nghiệm.

Mẫu thử được hòa tan trong DMSO 100% với nồng độ ban đầu 20 mM Sau đó, mẫu được pha loãng trên đĩa 96 giếng bằng môi trường nuôi cấy tế bào không có FBS, tạo thành 4 dãy nồng độ từ cao đến thấp.

Chất thử được pha loãng với nồng độ 100 – 20 – 4 – 0,8 g/mL và 10 L của dung dịch này được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng đã chuẩn bị sẵn tế bào Đồng thời, các giếng đối chứng không có chất thử nhưng có chứa TBUT (190 L) và DMSO 1%.

(10 L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0 Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%

Bước 3: Ủ mẫu trong tủ ấm trong 72 giờ Sau thời gian này, tế bào sẽ được cố định bằng TCA trong 1 giờ, sau đó nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở nhiệt độ 37 độ C Cuối cùng, rửa 3 lần bằng axit acetic và để khô ở nhiệt độ phòng.

Để hòa tan lượng SRB, thêm dung dịch 10 mM unbuffered Tris base và lắc nhẹ trong 10 phút Sau đó, đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm bằng máy ELISA Plate Reader (BioTek).

Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác

Ellipticine ở các nồng độ 10 – 2 – 0,4 – 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương tham khảo

DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm (nồng độ cuối cùng trong giếng thử là 0,05%)

Cách đánh giá kết quả:

Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

% Ức chế = 100% − OD (mẫu) − OD (ngày0)

Hoạt tính gây độc đối với tế bào ung thư được đánh giá thông qua giá trị

IC50 là nồng độ ức chế tối đa 50% tế bào

2.2.3 Phương pháp xử lý số liệu

Giá trị IC50 (nồng độ ức chế tối đa 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4

Số liệu được biểu diễn dưới dạng X  SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn)

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả chiết xuất dược liệu

Hình 3.1 Quy trình chiết xuất dược liệu và kết quả thu được

Hình 3.2 Bã dược liệu sau khi ngâm

Vỏ quả Xuyên tiêu khô (500 g) được ngâm lạnh với dung môi EtOH 70% ở nhiệt độ phòng, ngâm 3 lần (mỗi lần trong 24 giờ) Tỷ lệ dược liệu/dung môi là 1:10 (kg/L)

Sau thời gian ngâm, bã dược liệu được lọc bỏ như Hình 3.2, dịch chiết

3 lần được gộp lại, sau đó lọc qua giấy lọc và cất thu hồi loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm

Phân tán lượng cao toàn phần được thu nhận từ nước nóng với tỷ lệ 1:1 (m/v) Dịch thu được sẽ được chiết bằng phương pháp lỏng – lỏng, sử dụng các dung môi có độ phân cực tăng dần theo tỷ lệ 1:2, bao gồm n-Hexan, EtOAc và BuOH, với mỗi dung môi được chiết 3 lần Sau đó, các dịch chiết sẽ được gộp lại và cất để thu hồi, loại bỏ dung môi dưới áp suất giảm.

Khối lượng và hiệu suất chiết cao tương ứng thu được qua quá trình tiến hành được thể hiện trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Khối lượng và hiệu suất cao chiết toàn phần và phân đoạn vỏ quả

Loại cao Khối lượng (g) Hiệu suất (%)

Kết quả đánh giá tác động ức chế tế bào ung thư

3.2.1 Tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư của cao chiết toàn phần vỏ quả Xuyên tiêu

Cao chiết toàn phần vỏ thể hiện hoạt tính gây độc đáng kể đối với bốn dòng tế bào ung thư, bao gồm tế bào gan HepG2, tế bào cổ tử cung HeLa, tế bào dạ dày MKN-7 và tế bào phổi SK-LU-1 Nghiên cứu này chỉ ra tiềm năng của cao chiết trong việc phát triển các liệu pháp điều trị ung thư hiệu quả.

27 quả Xuyên tiêu được thể hiện lần lượt thông qua giá trị IC50 (g/mL) ở Bảng

Bảng 3.2 trình bày khả năng gây độc của cao chiết toàn phần vỏ quả Xuyên tiêu trên bốn dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư gan, cổ tử cung, dạ dày và phổi ở người.

Cao chiết toàn phần Xuyên tiêu

HepG2 Hela MKN-7 SK-LU-1

%ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD

HepG2 Hela MKN-7 SK-LU-1

%ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD

Thuốc đối chứng dương Ellipticine thể hiện hoạt động ổn định trong thí nghiệm, cho thấy tác dụng gây độc rõ rệt đối với bốn dòng tế bào ung thư gan, cổ tử cung, dạ dày và phổi ở người Giá trị IC50 của Ellipticine lần lượt là 0,320,03; 0,320,04; 0,430,03 và 0,510,05 (g/mL).

Cao chiết toàn phần EtOH 70% với nồng độ 100 g/mL không cho thấy hoạt tính gây độc trên hai dòng tế bào ung thư phổi và cổ tử cung Tuy nhiên, đối với hai dòng tế bào ung thư gan và dạ dày, cao chiết này thể hiện tác dụng độc tính với giá trị IC50 lần lượt là 63,68  3,97 g/mL và 56,08  3,54 g/mL.

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng gây độc tế bào của các phân đoạn vỏ quả Xuyên tiêu trên hai dòng tế bào ung thư gan và dạ dày Kết quả cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư, mở ra triển vọng cho việc phát triển các liệu pháp điều trị mới.

3.2.2 Tác dụng độc tính trên các dòng tế bào ung thư của các phân đoạn cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu

Hoạt tính gây độc của các phân đoạn cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu được đánh giá qua giá trị IC50 đối với hai dòng tế bào ung thư gan và dạ dày.

Bảng 3.3 Tác dụng gây độc của các phân đoạn cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu đối với dòng tế bào ung thư gan HepG2 ở người

%ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD

Bảng 3.4 Tác dụng gây độc của các phân đoạn cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu đối với dòng tế bào ung thư dạ dày MKN-7 ở người

%ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD %ƯC SD

Kết quả ở Bảng 3.3 và Bảng 3.4 cho thấy phân đoạn BuOH và phân đoạn

H2O không cho thấy hoạt tính gây độc đối với hai dòng tế bào ung thư Đối với dòng tế bào ung thư gan, các phân đoạn n-Hexan và EtOAc có hoạt tính gây độc với IC50 lần lượt là 17,12  0,94 và 28,45  2,85 g/mL Trong khi đó, với dòng tế bào ung thư dạ dày, hai phân đoạn này cho giá trị IC50 lần lượt là 23,65  1,75 và 35,61  2,90 g/mL Ngoài ra, mẫu thử Ellipticine cho kết quả IC50 rất thấp, lần lượt là 0,43  0,02 và 0,40  0,03 g/mL, cho thấy khả năng gây độc cao đối với tế bào ung thư.

Hình 3.3 Sự thay đổi mật độ tế bào HepG2 dưới tác dụng của các mẫu nghiên cứu sau 72 giờ tại các nồng độ khác nhau (VK 10X, zoom 5.6)

Hình 3.4 Sự thay đổi mật độ tế bào MKN-7 dưới tác dụng của các mẫu nghiên cứu sau 72 giờ tại các nồng độ khác nhau (VK 10X, zoom 5.6)

Dòng tế bào HepG2 MKN-7

Hình 3.5 Sự thay đổi mật độ tế bào HepG2 và MKN-7 dưới tác dụng của chứng âm sau 72 giờ (VK 10X, zoom 5.6)

Trong Hình 3.3 và Hình 3.4, có thể thấy rằng với phân đoạn n-Hexan và EtOAc, ở nồng độ thấp như 4 μg/mL và 0,8 μg/mL, mật độ tế bào vẫn còn dày đặc và kết tụ thành đám Tuy nhiên, khi nồng độ tăng lên đến 20 μg/mL, sự thay đổi trong mật độ tế bào bắt đầu diễn ra.

Khi nồng độ mẫu thử đạt 100 g/mL, mật độ tế bào giảm rõ rệt, trong khi hai phân đoạn BuOH và H2O vẫn duy trì mật độ tế bào dày đặc ở cùng nồng độ này.

BÀN LUẬN

Về kết quả chiết xuất dược liệu

Từ 500 g vỏ quả Xuyên tiêu khô, quá trình chiết xuất bằng EtOH 70% thu được 23,7 g cao toàn phần khô, đạt hiệu suất 4,74% Sau khi thực hiện chiết lỏng – lỏng với các dung môi phân cực, kết quả thu được là 1,2 g cao n-Hexan, 7,6 g cao EtOAc, 4,7 g cao BuOH và 8,1 g cắn nước, với hiệu suất tương ứng là 5,06%; 32,07%; 19,83% và 34,18%.

Tác giả Chao Wang và cộng sự đã tiến hành chiết xuất 200 g vỏ rễ khô cây Xuyên tiêu thu hái tại Trung Quốc bằng cách ngâm trong dung môi Methanol ở nhiệt độ phòng Quá trình chiết xuất được thực hiện trong bình nón 1 lít gắn trên bàn lắc, với ba lần ngâm, mỗi lần sử dụng 0,6 lít dung môi trong thời gian 4 giờ Kết quả thu được là 18,6 g cao Methanol toàn phần, đạt hiệu suất 9,3%.

Nghiên cứu của nhóm Nguyen Bich Thu về hoạt tính gây độc tế bào của cây thuốc tại Việt Nam đã tiến hành chiết xuất lá và hạt Xuyên tiêu khô Nguyên liệu được ngâm chiết trong dung môi Methanol ở nhiệt độ 25C trong 72 giờ, với hiệu suất chiết xuất đạt 4,3% cho lá và 2,6% cho hạt Kết quả này thấp hơn so với nghiên cứu của Chao Wang và cộng sự, điều này có thể do sự khác biệt về địa điểm thu hái, giống dược liệu, bộ phận sử dụng, điều kiện sinh sống, cũng như phương pháp và quy trình chiết xuất.

Về kết quả đánh giá tác động ức chế tế bào ung thư

Xu hướng ngày càng gia tăng trong việc sử dụng các chất chống ung thư tự nhiên có trong thảo dược, rau, trái cây và hạt.

Thảo dược đang nổi lên như một nguồn tài nguyên quý giá trong việc phát hiện các loại thuốc mới, với nhiều loài cây chứa các thành phần hóa học đã được chứng minh có khả năng gây độc cho tế bào Điều này khẳng định tiềm năng lớn của thảo dược trong ngành dược phẩm.

64] Trong đó, chi Zanthoxylum được đánh giá là nguồn dược liệu tiềm năng

33 khi chứa nhiều loài đã được nghiên cứu chứng minh có tác dụng chống ung thư rõ rệt

Nghiên cứu này đánh giá tác động gây độc tế bào ung thư của cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu thuộc chi Zanthoxylum Hoạt tính gây độc được xác định thông qua phương pháp đo hàm lượng protein tế bào tổng số bằng mật độ quang học (OD) khi sử dụng Sulforhodamine B (SRB) để phân tích khả năng gây độc tế bào ung thư của cao chiết toàn phần và các phân đoạn của nó.

Nghiên cứu cho thấy, trong dòng tế bào ung thư gan HepG2, phân đoạn n-Hexan có khả năng gây độc tế bào mạnh nhất với giá trị IC50 là 17,12  0,94 g/mL Tiếp theo là cao phân đoạn EtOAc và cao toàn phần EtOH 70% với các giá trị IC50 lần lượt là 28,45  2,85 và 63,68  3,97 g/mL Trong khi đó, cao phân đoạn BuOH và cắn nước không cho thấy hoạt tính gây độc tế bào (IC50 > 100) Kết quả tương tự cũng được ghi nhận trên dòng tế bào ung thư dạ dày MKN-7, với phân đoạn n-Hexan cho giá trị IC50 là 23,65  1,75 g/mL, tiếp theo là cao phân đoạn EtOAc và cao toàn phần EtOH.

Cao chiết 70% EtOH cho thấy hoạt tính gây độc tế bào ung thư khác nhau đối với hai dòng tế bào, cụ thể là HepG2 và MKN-7, với giá trị IC50 lần lượt là 35,61  2,90 và 56,08  3,54 g/mL Trong khi đó, các cao phân đoạn BuOH và cắn nước không có hoạt tính gây độc (IC50 > 100) Đặc biệt, cao phân đoạn n-Hexan cho thấy hoạt tính gây độc tốt nhất, chứng tỏ rằng cao chiết vỏ quả Xuyên tiêu có khả năng gây độc với cả hai loại tế bào ung thư này.

Kết quả nghiên cứu về hoạt tính sinh học của cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum nitidum) tương đồng với nghiên cứu trước đó về loài cùng chi, Zanthoxylum simulans Năm 2016, TS Nguyễn Thị Hồng Vân đã thực hiện đề tài nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Xuyên tiêu, nhằm định hướng tạo chế phẩm.

Kết quả nghiên cứu về 34 phương pháp phòng chống ung thư cho thấy cặn chiết từ cây có hoạt tính gây độc mạnh đối với năm dòng tế bào ung thư, bao gồm cả tế bào ung thư gan HepG2.

Năm 2010, nhóm nghiên cứu của Nguyen Bich Thu đã thực hiện một nghiên cứu về tác dụng ức chế tế bào ung thư gan HepG2 từ lá và hạt của cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum simulans) Quá trình chiết xuất được thực hiện trong dung môi Methanol ở nhiệt độ phòng (25C) trong 72 giờ Tác dụng ức chế tế bào ung thư được đánh giá theo phương pháp của Mosmann và Rapid (1983) Tế bào HepG2 được nuôi cấy trong môi trường DMEM chứa 10% FBS, ở 37C trong máy ấp CO2 có độ ẩm, sau đó được đưa vào đĩa 96 giếng để thử nghiệm.

Sau 24 giờ ấp, các nồng độ chiết xuất từ 1 g/mL đến 100 g/mL được thêm vào mỗi giếng Sau 48 giờ, sự sống của tế bào được đo bằng thử nghiệm MTT Kết quả cho thấy chiết xuất Methanol từ lá và hạt Xuyên tiêu có tác dụng ức chế mạnh dòng tế bào ung thư HepG2 với giá trị IC50 lần lượt là 7,1  0,1 g/mL và 28,5  4,3 g/mL Điều này nhấn mạnh sự cần thiết phải tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và khảo sát các mẫu dược liệu khác nhau để có thêm bằng chứng trong việc lựa chọn nguồn dược liệu tốt nhất cho việc phát triển sản phẩm thuốc và thực phẩm bảo vệ sức khỏe trong tương lai.

Nhóm tác giả đã chỉ ra rằng cao chiết từ lá và hạt Xuyên tiêu có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư phổi A549, ung thư gan Huh-7, ung thư biểu mô liên kết HT 1080 và ung thư vú MCF-7.

Tác giả Chao Wang đã chiết xuất các hợp chất acridone alkaloid từ vỏ rễ Xuyên tiêu và đánh giá khả năng ức chế dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt PC-3M và ung thư biểu mô hạch bạch huyết LNCaP, cũng như tác dụng tiêu diệt ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum Kết quả nghiên cứu cho thấy

Five acridone alkaloids, including normelicopidine, normelicopine, melicopine, melicopidine, and melicopicine, have demonstrated significant in vitro activity against cancer cells and malaria parasites.

Nghiên cứu của Yong-Qiang Tian cho thấy hợp chất Chelerythrine trong cây Xuyên tiêu có khả năng ức chế tế bào ung thư dạ dày mạnh mẽ hơn so với Cerdulatinib Chelerythrine không chỉ ức chế sự bám dính, di cư và xâm lấn của các tế bào ung thư dạ dày AGS mà còn kích thích quá trình chết theo chương trình Hợp chất này làm giảm đáng kể biểu hiện của các thụ thể estrogen (ER-α36, ER-α66 và ER-β1) cùng với biểu hiện của proto-oncogene Src.

Cây Xuyên tiêu (Zanthoxylum simulans Hance.) đã được ghi nhận là một nguồn dược liệu tiềm năng với hoạt tính gây độc tốt trên nhiều dòng tế bào ung thư Kết quả này đóng góp quan trọng vào việc cung cấp dẫn liệu khoa học cho các ứng dụng y học, đặc biệt trong việc tìm kiếm các hoạt chất và phát triển sản phẩm thảo dược mới có khả năng phòng ngừa và điều trị ung thư.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN:

Xuất phát từ hai mục tiêu ban đầu, quá trình nghiên cứu và thực nghiệm đã mang lại một số kết quả đáng chú ý.