Khóa luận nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme tyrosinase của vỏ rễ cây dâu (morus alba l)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC ĐẶNG THỊ TÂM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA VỎ RỄ CÂY DÂU (Morus alba L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC HÀ NỘI – 2023 LỜI CẢM ƠN Được làm hoàn thành khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học, em cảm thấy vơ may mắn có hội làm nghiên cứu lĩnh vực em yêu thích Và hồn thành khóa luận, em thấy học hỏi nhiều điều Trong trình thực khóa luận tốt nghiệp em nhận nhiều giúp đỡ quý báu thầy cô giáo, bạn bè người thân Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Nguyễn Thị Huyền, ThS Đặng Kim Thu – hai giảng viên quan tâm, giúp đỡ, tận tình hướng dẫn em suốt trình thực khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Trường Đại Học Y Dược tạo điều kiện tốt cho em học tập suốt thời gian ngồi ghế nhà trường cho phép em thực khóa luận Đồng thời, em xin cảm ơn thầy cô giáo môn Dược lý, Bào chế, Dược cổ truyền, Hóa Dược nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện cho em suốt thời gian nghiên cứu thực khóa luận Em xin cảm ơn Trung tâm thông tin – thư viện, Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp cho em tài liệu cần thiết bổ ích q trình làm khóa luận Lời cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ln sát cánh, ủng hộ, động viên, góp ý để em hồn thành khóa luận Trong q trình thực hồn thành khóa luận, dù cố gắng khó tránh khỏi sai sót Em mong nhận ý kiến đóng góp thầy để khóa luận hồn thiện Hà Nội, ngày 24 tháng năm 2023 Sinh viên Đặng Thị Tâm DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ CÁI VIẾT TẮT M.alba Morus alba L DMSO Dimethyl sulfoxid MIC Minimum Inhibitory Concentration n-BuOH n-Butanol EtOH Etanol EtOAc Etyl acetate L-DOPA 3,4-Dihydroxy-L-phenylalanine IC50 Inhibitory concentration 50% DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ biểu diễn đường sinh tổng hợp melanin Hình 1.2 Q trình oxy hóa phenol thơng qua enzym tyrosinase Hình 1.3 Các dạng oxi hóa enzym tyrosinase Hình 1.4 Đồ thị Lineweaver – Burk Hình 1.5 Cơ chế ức chế cạnh tranh Hình 1.6 Đồ thị Lineweaver – Burk trường hợp ức chế cạnh tranh Hình 1.7 Cơ chế ức chế khơng cạnh tranh Hình 1.8 Đồ thị Lineweaver – Burk trường hợp ức chế khơng cạnh tranh Hình 1.9 Hình 1.10 Cơ chế ức chế hỗn hợp Đồ thị Lineweaver – Burk trường hợp ức chế 9 hỗn hợp Hình 1.11 Hình 1.12 Cây dâu tằm Việt Nam Vỏ rễ dâu tằm (tang bạch bì) 13 13 Hình 1.13 Các flavonoid phân lập từ dâu 16 Hình 1.14 Các chất phân lập từ dâu 17 Hình 1.15 Các chất phân lập từ vỏ rễ dâu 18 Hinh 2.1 Hinh 2.2 Vỏ rễ dâu Quy trình chiết phân đoạn vỏ rễ dâu 23 26 Hinh 2.3 Đồ thị Lineweaver – Burk 26 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym tyrosinase phân đoạn 31 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym tyrosinase acid kojic 32 Hình 3.3 Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết EtOAc Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết EtOAc 33 Hình 3.4 34 DANH MỤC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 2.1 Các thuốc thử hóa chất cần thiết 23 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro 27 Bảng 3.1 Khả ức chế enzym tyrosinase phân đoạn vỏ rễ dâu 30 Bảng 3.2 Khả ức chế enzym tyrosinase acid kojic 31 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan melanin 1.2 Tổng quan enzym tyrosinase 1.2.1 Enzym tyrosinase 1.2.2 Cơ chế ức chế tyrosinase 1.2.3 Các chất ức chế enzym tyrosinase 1.3 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase in vitro 12 1.4 Cây dâu (Morus alba L.) 13 1.4.1 Đặc điểm thực vật 14 1.4.2 Phân bố phận dùng 14 1.4.3 Thành phần hóa học 15 1.4.4 Tác dụng dược lý 18 1.4.5 Công dụng cổ truyền 20 1.4.6 Một số nghiên cứu giới tác dụng ức chế enzyme tyrosinase dâu 21 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu 23 2.2 Nguyên vật liệu thí nghiệm 23 2.3 Nội dung nghiên cứu 25 2.4 Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1 Xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu 25 2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ dâu 26 2.4.3 Xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 32 3.1 Kết chiết xuất Dược liệu 32 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro 32 3.3 Kết xác định đặc điểm động học ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết vỏ rễ dâu 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 38 4.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ dâu 38 4.2 Về kết xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt 39 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41 ĐẶT VẤN ĐỀ Cuộc sống ngày phát triển nên nhu cầu có da sáng, đẹp, khỏe mạnh khơng giới hạn phụ nữ mà nam giới, đặc biệt nước châu Á có Việt Nam Cơng nghiệp mỹ phẩm ước đốn có giá trị 170 tỉ la mỹ hàng năm cịn tiếp tục tăng [1] Melanin có vai trò quan trọng bảo vệ thể khỏi tia UV từ mặt trời, chống ung thư da đồng thời tạo nên vẻ đẹp thẩm mỹ khỏe khoắn cho da Melanin sắc tố tạo nên màu da, tóc, màu mắt người tạo tế bào biểu bì tạo hắc tố (melanocyte) Tuy nhiên, việc tổng hợp tích tụ nhiều melanin gây rối loạn da da đổi màu, sạm da, thâm mắt, tàn nhang, nguy ung thư da Sự tăng hàm lượng melanin chủ yếu hoạt động enzym tyrosinase tế bào [2] [3] Hiện nay, hoạt chất ức chế enzym tyrosinase sử dụng mỹ phẩm làm kem bôi, thuốc uống kojic acid, hydroquinon, arbutin Các chất có nguồn gốc tổng hợp nên sử dụng lâu dài gây tác dụng phụ tiềm ẩn nhiều rủi ro Vì vậy, việc tìm kiếm hoạt chất từ thiên nhiên có tác dụng làm sáng da, giảm thâm nám an toàn hiệu ngày trở nên cần thiết [4] Cây dâu tằm (Morus alba L.) sách cổ Trung Quốc coi loài q, có nhiều cơng dụng người, vừa làm thuốc trị bệnh, vừa làm thực phẩm bồi bổ thể Trong vỏ rễ dâu biết đến không vị thuốc giúp lợi tiểu, chữa ho lâu ngày, hen phế quản, chữa cao huyết áp, tiểu đường mà cịn dùng với cơng dụng làm đẹp da, trắng da Trên giới nghiên cứu cho thấy vỏ rễ dâu có nhóm chất flavonoid, terpenoid, acid béo có tác dụng chống oxy hóa, chống viêm, trắng da ức chế enzym tyrosinase hạ huyết áp [5] Cho đến nay, công trình nghiên cứu cơng bố thành phần hóa học tác dụng sinh học dâu Việt Nam cịn Để góp phần cung cấp sở tiền đề cho việc ứng dụng nguyên liệu vỏ rễ dâu chăm sóc sức khỏe nói chung, xây dựng sở khoa học để bào chế mỹ phẩm làm trắng da từ cao chiết vỏ rễ dâu tằm tiến hành thực đề tài: “ Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase vỏ rễ dâu (Morus alba L.)” với mục tiêu nghiên cứu sau: Đánh giá hoạt tính ức chế enzym tyrosinase dịch chiết vỏ rễ dâu Xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan melanin 1.1.1 Melanin vai trò thể Sắc tố đặc điểm kiểu hình rõ ràng giới tự nhiên Trong tế bào động vật thực vật, sắc tố định nghĩa chất tạo màu chúng phản xạ hấp thụ số sóng ánh sáng đặc hiệu [6] Trong sắc tố sinh học đó, melanin phân bố rộng rãi tìm thấy suốt q trình phát sinh lồi, từ vi sinh vật động vật, có người [7] Ở người, melanin tìm thấy chủ yếu da, tóc, võng mạc [8] Melanin tiết tế bào sắc tố phân bố lớp đáy biểu bì Vai trị melanin bảo vệ da khỏi tác hại tia tử ngoại, đặc biệt tia cực tím UVB cách hấp thụ tán xạ ánh sáng mặt trời loại bỏ gốc oxy hóa tự Các rối loạn khác da kết tích tụ mức sắc tố biểu bì Tăng sắc tố tăng tế bào tạo sắc tố tăng hoạt động enzym hình thành sắc tố Các tế bào biểu bì tạo sắc tố động vật có vú sản xuất hai loại melanin eumelanin pheomelanin Eumelanin có màu từ nâu đến đen, không tan hầu hết dung môi, liên kết chặt chẽ với protein thông qua liên kết đồng hóa trị Pheomelanin có màu từ vàng đến đỏ, có khung tạo tiểu đơn vị benzothiazin liên kết chặt chẽ với protein thơng qua liên kết đồng hóa trị Tỷ lệ số lượng mật độ hai melanin định màu sắc da, mắt tóc[9] 1.1.2 Q trình tổng hợp sắc tố melanin da Bước bước bắt buộc trình hình thành sắc tố oxy hóa tyrosin thành dopaquinon Đây bước giới hạn tốc độ trình sinh tổng hợp tyrosin chuỗi phản ứng cịn lại tự diễn giá trị pH sinh lý định Dopaquinon sinh chuyển thành leukodopachrom, sau chuyển thành dopachrom Cuối eumelanin hình thành thơng qua loạt phản ứng oxy hóa từ sản phẩm chuyển hóa dopachrom 5,6-dihydroxyindol (DHI) acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA) Trong trường hợp có có mặt CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 3.1 Kết chiết xuất Dược liệu Sau tiến hành chiết xuất 2kg dược liệu vỏ rễ dâu EtOH 70%, kết thu 152,8g cao khô với hiệu suất chiết 7,64% Tiếp theo, tiến hành chiết phân đoạn cao EtOH thu kết phân đoạn n- Hexan, EtOAc, n- BuOH sau: 9,41g; 26,49g; 14,31g hiệu suất chiết phân đoạn tương ứng 6,16%; 17,34%; 9,37% 3.2 Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro Kết đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase cao toàn phần ethanol vỏ rễ dâu, phân đoạn n-hexan, ethylacetat, n-butanol acid kojic trình bày bảng 3.1 Bảng 3.1: Khả ức chế enzym tyrosinase phân đoạn vỏ rễ dâu Phần trăm ức chế (%) IC50 Nồng độ (g/ml) 10 20 50 100 150 200 30,19 40,41 63,85 72,98 81,61 88,41 25,95 EtOH ± 0,54 ±0,67 ±0,86 ±1,02 ± 0,85 ± 1,39 ± 1,49 nHexan 25,78 33,65 46,56 67,27 74,83 82,96 51,55 ±0,74 ±0,53 ±0,74 ±1,64 ±1,31 ±1,20 ± 1,23 45,85 57,54 72,34 83,93 91,14 96,68 12,68 ± 0,35 ± 0,63 ± 1,34 ± 0,59 ± 0,98 ± 1,80 ± 1,64 35,23 41,87 55,78 62,23 66,65 72,42 30,25 ± 0,61 ± 0,71 ± 0,83 ± 1,16 ± 1,44 ± 1,72 ± 2,34 (g/ml) EtOAc nBuOH 32 Cắn nước - 5,65 7,98 14,89 25,97 45,79 223 ± 0,52 ± 0,67 ± 0,31 ± 0,62 ± 0,59 ± 4,86 Bảng 3.2: Khả ức chế enzym tyrosinase acid Kojic Phần trăm ức chế Nồng độ (%) (µg/mL) Acid 8,07 ± 16,06 kojic 0,09 ± 0,18 IC50 (µg/mL) 20 40 80 27,87 69,01 88,07 97,07 ± 1,26 ± 0,23 ± 0,09 ± 0,28 33 13,94 ± 0,30 Nồng độ μg/ml Nồng độ μg/ml Nồng độ μg/ml Nồng độ μg/ml Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn khả ức chế enzym tyrosinase phân đoạn 34 Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym tyrosinase acid kojic Giá trị phần trăm ức chế I (%) cao chiết phân đoạn vỏ rễ dâu acid kojic trình bày bảng 3.1, bảng 3.2 Theo tăng dần nồng độ từ 10 đến 200 g/ml, phần trăm ức chế enzym tyrosinase cao chiết tăng dần Chứng tỏ, tác dụng ức chế enzym tyrosinase cao toàn phần cao phân đoạn vỏ rễ dâu tỉ lệ thuận với nồng độ cao chiết Trong cao chiết phân đoạn, phân đoạn EtOAc có giá trị IC50 thấp 12,68 ±1,64 g/ml, thể tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh cao chứng dương acid kojic, phân đoạn EtOH (IC50: 25,95 ± 1,49 g/ml) phân đoạn n-BuOH (IC50: 30,25 ± 2,34 g/mL) ,phân đoạn n-Hexan (IC50: 51,55±2,34 g/mL) thấp cắn nước (IC50: 223 ± 4,86 g/mL) Thứ tự tác dụng ức chế enzym tyrosinase phân đoạn tăng sau: cắn nước < n-Hexan< n-BuOH < EtOH < EtOAc Song song với mẫu thử, tiến hành tương tự với mẫu chứng dương acid kojic cho kết IC50 13,94 ± 0,3 µg/mL, thể tác dụng ức chế enzym tyrosinase cao phân đoạn EtOH, n-BuOH, n-Hexan, cắn nước 3.3 Kết xác định đặc điểm động học ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết vỏ rễ dâu Phân đoạn EtOAc có tác dụng ức chế enzym tyrosinase cao nên phân đoạn lựa chọn sử dụng để xác định động học ức chế enzym tyrosinase Phương pháp xác định động học enzym dựa thay đổi nồng độ chất L-DOPA nồng 35 độ dung dịch thử EtOAc Do giá trị IC50 phân đoạn dịch chiết EtOAc 12,68 ±1,64 g/mL nên ta tiến hành đo nồng độ gần sát giá trị IC50 0;7,5;15;30 g/mL Kết đánh giá đặc điểm động học ức chế enzym tyrosinase Động học ức chế enzym tyrosinase mô tả đồ thị Lineweaver-Burk xây dựng từ đồ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng chất L-DOPA nồng độ khác Tác dụng ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết EtOAc vỏ rễ dâu thể hình 3.3 (Đồ thị Lineweaver-Burk plot) Từ đồ thị Lineweaver-Burk ta xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết EtOAc ức chế hỗn hợp Hình 3.3: Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết EtOAc nồng độ 0; 7,5;15;30 g/mL Nồng độ chất L-DOPA 0,5;1;2 mg/mL Đồ thị động học Dixon phân đoạn dịch chiết EtOAc xây dựng độ thị biểu diễn mối tương quan giá trị độ hấp thụ quang với thời gian phản ứng phân đoạn dịch chiết EtOAc nồng độ 0; 7,5;15;30 g/mL hình 3.4 36 Hình 3.4: Đồ thị Dixon cho phân đoạn dịch chiết EtOAc để xác định số ức chế Ki Nồng độ chất L-DOPA 0,5;1;2 mg/mL Đồ thị động học Dixon hình 3.4 đoạn dịch chiết EtOAc có tính chất đặc trưng chất ức chế cạnh tranh [67], số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ giao điểm đường trục Ox đồ thị 8,25 ± 0,04 µg/mL Giá trị Ki nhỏ chứng tỏ dịch chiết EtOAc vỏ rễ dâu có tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh 37 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 4.1 Về kết đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ dâu Melanin có vai trò quan trọng bảo vệ thể khỏi tia UV từ mặt trời, chống ung thư da đồng thời tạo nên vẻ đẹp thẩm mỹ khỏe khoắn cho da Melanin sắc tố tạo nên màu da, tóc, màu mắt người tạo tế bào biểu bì tạo hắc tố (melanocyte) Tuy nhiên, việc tổng hợp tích tụ nhiều melanin gây rối loạn da da đổi màu, sạm da, thâm mắt, tàn nhang, nguy ung thư da Sự tăng hàm lượng melanin chủ yếu hoạt động enzym tyrosinase tế bào Hiện nay, hoạt chất ức chế enzym tyrosinase sử dụng mỹ phẩm làm kem bôi, thuốc uống kojic acid, hydroquinon, arbutin Các chất có nguồn gốc tổng hợp nên sử dụng lâu dài gây tác dụng phụ tiềm ẩn nhiều rủi ro Acid kojic chất sử dụng làm chất chứng cho thí nghiệm tác dụng ức chế enzym tyrosinase hợp chất khác Trong nghiên cứu acid kojic sử dụng làm chứng dương cho thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase vỏ rễ dâu Trong cao chiết phân đoạn, phân đoạn EtOAc có giá trị IC50 thấp 12,68 ±1,64 g/ml, thể tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh Như chất có tác dụng ức chế enzym tyrosinase chủ yếu nằm phân đoạn EtOAc Kết tương đồng với nghiên cứu Jui Hung Hsu cộng (2022) phân đoạn EtOAc ức chế enzym tyrosinase với IC50 11,27 ± 2,75 Nghiên cứu giải thích vỏ rễ dâu có chứa hợp chất phenolic (maclurin, rutin, isoquercitrin, resveratrol morin), flavonoid, oxyresveratrol, kuwanon H, mulberroside A chứng minh hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh [68] Nguyễn Thị Mỹ Hạnh cộng (2017) tiến hành nghiên cứu hoạt tính ức chế enzym tyrosinase cao chiết phân đoạn vỏ rễ dâu thu kết IC50 cao nHexan (44,26 ±9,34), cao EtOH (55,35± 0,96) [69] Kết có khác biệt so với nghiên cứu làm, điều giải thích ảnh hưởng dung mơi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu, địa điểm thu hái Do nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất, khảo sát mẫu dược liệu khác cần thiết để có địa điểm thu hái dược liệu Do đó, nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất, khảo sát 38 mẫu dược liệu khác cần thiết để có thêm chứng việc lựa chọn dược liệu tốt phục vụ việc phát triển thực phẩm chức thuốc tương lai Như vậy, với kết ghi nhận được, vỏ rễ dâu thể khả ức chế enzyme tyrosinase, điều góp phần cung cấp dẫn liệu khoa học cho nghiên cứu y học sau Bởi việc tích tụ q nhiều melanin gây bệnh da ảnh hưởng nhiều đến thẩm mỹ Vì vậy, việc tìm kiếm hoạt chất từ thiên nhiên làm đẹp da, nâng cao sức khỏe da, an toàn hiệu tiếp tục ngày trở nên cần thiết 4.2 Về kết xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt Động học ức chế enzym tyrosinase dịch chiết vỏ rễ dâu chưa nghiên cứu trước Ngồi phân đoạn dịch chiết EtOAc có giá trị IC50 thấp phân đoạn (tác dụng ức chế cao nhất) nên sử dụng phân đoạn dịch chiêt để nghiên cứu động học enzym tyrosinase Đồ thị Lineweaver-Burk mô tả động học ức chế enzym phân đoạn EtOAc Đồ thị động học hình 3.3 có tính chất trung gian kiểu ức chế cạnh tranh không cạnh tranh, cho thấy kiểu ức chế phân đoạn dịch chiết EtOAc kiểu ức chế hỗn hợp [70] Đồ thị động học Dixon hình 3.4 có tính chất đặc trưng ức chế cạnh tranh Hằng số ức chế Ki xác định giá trị tuyệt đối từ giao điểm đường trục Ox đồ thị Dixon vẽ theo 1/ tốc độ phản ứng theo nồng độ phân đoạn dịch chiết EtOAc Giá trị Ki xác định theo đồ thị Dixon hình 3.4 8,25 ± 0,04 µg/mL Ki số ức chế enzym cho phép đánh giá độ mạnh yếu chất ức chế Ki gọi số phân ly phức hợp Enzym – chất ức chế (E-I) không hoạt động biểu tác dụng ức chế Nếu phức hợp E-I có khuynh hướng dễ tách (Ki cao) enzym tự hoạt động bình thường, hiệu ức chế yếu Nếu Ki nhỏ, chất ức chế bị liên kết chặt với enzym nên lượng enzym hoạt động nhỏ, tác dụng ức chế mạnh[71] Phân đoạn EtOAc dịch chiết vỏ rễ dâu có giá trị số Ki tương đối nhỏ chứng tỏ tác dụng ức chế enzym tyrosinase tương đối mạnh Kiểu ức chế hỗn hợp kiểu ức chế đặc trưng dược liệu, nguyên nhân thành phần dịch chiết có chứa loạt hợp chất có nhiều chế tác dụng 39 khác [67] Cơ chế ức chế cho thấy hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết EtOAc cạnh tranh với L-DOPA để gắn vào trung tâm hoạt động – vị trí liên kết với chất enzym tyrosinase kết hợp với enzym tyrosinase kết hợp với phức hợp tyrosinase-L-DOPA Trong trường hợp L-DOPA nồng độ cao, hợp chất có hoạt tính phân đoạn dịch chiết liên kết vào vùng định (không phải trung tâm hoạt động) enzym tyrosinase, làm biến đổi cấu hình phân tử enzym khiến enzym khơng liên kết với chất Điều khẳng định quan sát đồ thị thấy giá trị Kmax tăng Vmax giảm nồng độ phân đoạn dịch chiết EtOAc tăng 40 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT KẾT LUẬN Trong phạm vi đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế enzyme tyrosinase vỏ rễ dâu (Morus alba L)”, thu kết sau: Về nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro dược liệu vỏ rễ dâu Đã đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro phân đoạn dịch chiết vỏ rễ dâu Trong cao chiết phân đoạn, phân đoạn EtOAc có giá trị IC50 thấp 12,68 ±1,64 g/ml, thể tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh nhất, phân đoạn EtOH (IC50: 25,95 ± 1,49 g/ml) phân đoạn n-BuOH (IC50: 30,25 ± 2,34 g/mL) ,phân đoạn n-Hexan (IC50 :51,55 ± 2,34 g/mL) thấp cắn nước (IC50: 223 ± 4,86 g/mL) Thứ tự tác dụng ức chế enzym tyrosinase phân đoạn tăng sau: cắn nước < n-Hexan< n-BuOH < EtOH < EtOAc So sánh với mẫu chứng dương acid kojic cho kết IC50 13,94 ± 0,3 µg/mL Về xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt Tác dụng ức chế enzym tyrosinase thoe kiểu động học enzym ức chế hỗn hợp, kiểu ức chế đặc biệt dược liệu Phân đoạn có tác dung ức chế enzym tyrosinase mạnh với số ức chế Ki phân đoạn dịch chiết nhỏ ( Ki = 8,25 ± 0,04 µg/mL) ĐỀ XUẤT Đề tài nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase vỏ rễ dâu (Morus alba L)” Tuy nhiên để khai thác sử dụng dược liệu hiệu việc phát triển sản phẩm làm trắng da có nguồn gốc từ thiên nhiên, xin đề xuất số nội dung nghiên cứu tiếp theo: Phân lập chất, xác định hoạt tính chế ức chế enzym tyrosinase in vitro Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase phận khác dâu 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 Mukherjee, P.K., et al., Validation of medicinal herbs for anti-tyrosinase potential Journal of Herbal medicine, 2018 14: p 1-16 Miyazawa, M and N Tamura, Inhibitory compound of tyrosinase activity from the sprout of Polygonum hydropiper L.(Benitade) Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2007 30(3): p 595-597 Sánchez-Ferrer, A., Tyrosinase: acomprehensive review of its mechanism Biochimica et Biophysica Acta (BBA), 1995 1247: p 1-11 Couteau, C and L Coiffard, Overview of Skin Whitening Agents: Drugs and Cosmetic Products Cosmetics 2016 3(3) Bae, S.-H., H.-J.J.L.-F.S Suh, and Technology, Antioxidant activities of five different mulberry cultivars in Korea 2007 40(6): p 955-962 McQuarrie, D.A and J.D Simon, Physical chemistry: a molecular approach Vol 1997: University science books Sausalito, CA Prota, G.J.M.R.R., Progress in the chemistry of melanins and related metabolites 1988 8(4): p 525-556 Meyer zum Gottesberge, A.J.P.c.r., Physiology and pathophysiology of inner ear melanin 1988 1(4): p 238-249 Quevedo Jr, W.C., T.B Fitzpatrick, and K.J.J.o.H.E Jimbow, Human skin color: origin, variation and significance 1985 14(1): p 43-56 Chang, T.-S.J.I.j.o.m.s., An updated review of tyrosinase inhibitors 2009 10(6): p 2440-2475 Kim, Y.-J., H.J.C Uyama, and m.l.s CMLS, Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources: structure, inhibition mechanism and perspective for the future 2005 62: p 1707-1723 Khan, M.T.H.J.P and A Chemistry, Molecular design of tyrosinase inhibitors: A critical review of promising novel inhibitors from synthetic origins 2007 79(12): p 2277-2295 Kanteev, M., M Goldfeder, and A.J.P.S Fishman, Structure–function correlations in tyrosinases 2015 24(9): p 1360-1369 Lehninger D N and Michael M C, Principle of biochemistry Fourth ed, W.H Freeman and Company, New York, 2005: p 202-213 Hammerstone, J.F., S.A Lazarus, and H.H.J.T.J.o.n Schmitz, Procyanidin content and variation in some commonly consumed foods 2000 130(8): p 2086S-2092S 42 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Badria, F.J.B.c.f., A new type of tyrosinase inhibitors from natural products as potential treatments for hyperpigmentation 2001 140(4): p 267-271 Kubo, I and I.J.P.M Kinst-Hori, 2-Hydroxy-4-methoxybenzaldehyde: a potent tyrosinase inhibitor from African medicinal plants 1999 65(01): p 019-022 Conrad, J.S., et al., Inhibitor binding to the binuclear active site of tyrosinase: temperature, pH, and solvent deuterium isotope effects 1994 33(19): p 5739-5744 Goetghebeur, M and S Kermasha, Inhibition of polyphenol oxidase by copper-metallothionein from Aspergillus niger Phytochemistry 1996 42(4): p 935-940 Huang, X.-H., et al., Inhibition of the activity of mushroom tyrosinase by alkylbenzoic acids 2006 94(1): p 1-6 Criton, M., V.J.B Le Mellay-Hamon, and m.c letters, Analogues of Nhydroxy-N ′ -phenylthiourea and N-hydroxy-N ′ -phenylurea as inhibitors of tyrosinase and melanin formation 2008 18(12): p 36073610 Kahn, V and A.J.P Andrawis, Inhibition of mushroom tyrosinase by tropolone 1985 24(5): p 905-908 Frankos, V.H., et al., Generally recognized as safe (GRAS) evaluation of 4-hexylresorcinol for use as a processing aid for prevention of melanosis in shrimp 1991 14(2): p 202-212 Laksmiani, N.P.L., I.W.A Widiantara, and A.B.S Pawarrangan, Potency of moringa (Moringa oleifera L.) leaves extract containing quercetin as a depigmentation agent inhibiting the tyrosinase enzyme using in-silico and in-vitro assay Pharmacia, 2021 69(1): p 85-92 An Nisaa Nurzak, et al., Skin Brightening Cream Formulation and Tyrosinase Inhibition Assay of Moringa Leaf Extract International Journal of Pharmaceutical and Bio-Medical Science 2022 2(7): p 187190 Hashim, F.J., et al., Alternative approach for specific tyrosinase inhibitor screening: Uncompetitive inhibition of tyrosinase by Moringa oleifera Molecules, 2021 26(15): p 4576 Lee, K., et al., Biological screening of 100 plant extracts for cosmetic use (I): inhibitory activities of tyrosinase and DOPA auto ‐ oxidation International journal of cosmetic science, 1997 19(6): p 291-298 43 28 29 Lo, Y.-H., et al., Active constituents from Sophora japonica exhibiting cellular tyrosinase inhibition in human epidermal melanocytes Journal of Ethnopharmacology, 2009 124(3): p 625-629 Lai, J.-S., C Lin, and T.-M Chiang, Tyrosinase inhibitory activity and thermostability of the flavonoid complex from Sophora japonica L (Fabaceae) Tropical Journal of Pharmaceutical Research 2014 13(2): p 243-247 30 Cho, S.J and H.S Kwon, Tyrosinase Inhibitory Activities of Safrole from Myristica fragrans Houtt Journal of Applied Biological Chemistry 2015 58(4): p 295-301 31 Suguna, P., H Lai, and K Kasipathy, Antioxidant, antibacterial and tyrosinase inhibiting activities of extracts from Myristica fragrans Houtt European Journal of Medicinal Plants 2015 8(1): p 39-49 32 Shim, E., et al., Inhibitory effect of Gastrodia elata Blume extract on alpha-melanocyte stimulating hormone-induced melanogenesis in murine B16F10 melanoma Nutrition Research Practice 2017 11(3): p 173-179 33 Mayer, A., E Harel, and R Ben-Shaul, Assay of catechol oxidase—a critical comparison of methods Phytochemistry 1966 5(4): p 783-789 34 Rodriguez-López, J., et al., Calibration of a Clark-type oxygen electrode by tyrosinase-catalyzed oxidation of 4-tert-butylcatechol Analytical biochemistry, 1992 202(2): p 356-360 Pomerantz, S.H., A sensitive new assay for the oxidation of 3, 4dihydroxy-L-phenylalanine by tyrosinase Analytical Biochemistry 1976 75(1): p 86-90 35 36 Wangthong, S., et al., Post TLC developing technique for tyrosinase inhibitor detection Biomedical Chromatography 2007 21(1): p 94-100 37 Germanas, J.P., et al., Discovery of small-molecule inhibitors of tyrosinase Bioorganic medicinal chemistry letters 2007 17(24): p 68716875 38 Katsube, T., et al., Antioxidant flavonol glycosides in mulberry (Morus alba L.) leaves isolated based on LDL antioxidant activity 2006 97(1): p 25-31 Lợi, Đ.T., Những thuốc vị thuốc Việt Nam 2006, Nhà xuất Y học Yang, Y., et al., Four new 2-arylbenzofuran derivatives from leaves of Morus alba L 2010 58(2): p 257-260 39 40 44 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 Doi, K., et al., Studies on the constituents of the leaves of Morus alba L 2001 49(2): p 151-153 Yang, Y., et al., Two new chalcones from leaves of Morus alba L 2010 81(6): p 614-616 Dat, N.T., et al., Cytotoxic prenylated flavonoids from Morus alba 2010 81(8): p 1224-1227 Du, Q.-Z., et al., Composition of anthocyanins in mulberry and their antioxidant activity 2008 21(5): p 390-395 Wang, Y., et al., Antidiabetic and antioxidant effects and phytochemicals of mulberry fruit (Morus alba L.) polyphenol enhanced extract 2013 8(7): p e71144 Asano, N., et al., N-containing sugars fromMorus alba and their glycosidase inhibitory activities 1994 259(2): p 243-255 Yang, Z.-G., et al., Inhibitory effects of constituents from Morus alba var multicaulis on differentiation of 3T3-L1 cells and nitric oxide production in RAW264 cells 2011 16(7): p 6010-6022 Chan, E.W.C., et al., Antioxidant and sensory properties of Thai herbal teas with emphasis on Thunbergia laurifolia Lindl 2012 39(4): p 599609 Park, K., et al., Kuwanon G: an antibacterial agent from the root bark of Morus alba against oral pathogens 2003 84(2-3): p 181-185 Sohn, H.-Y., et al., Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Morus alba L., Morus mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai 2004 11(7-8): p 666672 Sj, A and R.J.I.J.P.P.S Mahmood, Anthelmintic and antimicrobial activities in some species of mulberry 2012 4: p 335-338 Du, J., et al., Antiviral flavonoids from the root bark of Morus alba L 2003 62(8): p 1235-1238 Lee, S.H., et al., Mulberroside F isolated from the leaves of Morus alba inhibits melanin biosynthesis 2002 25(8): p 1045-1048 Yang, Z., et al., Bioassay-guided screening and isolation of α-glucosidase and tyrosinase inhibitors from leaves of Morus alba 2012 131(2): p 617625 Hisayoshi, K., et al., A novel cytotoxic prenylated flavonoid from the root of Morus alba 2004 73(3): p 113-116 Zhang, M., et al., A new flavanone glycoside with anti-proliferation activity from the root bark of Morus alba 2009 7(2): p 105-107 45 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 Kikuchi, T., et al., Albanol A from the root bark of Morus alba L induces apoptotic cell death in HL60 human leukemia cell line 2010 58(4): p 568-571 Lee, J.-C., et al., Morusin induces apoptosis and suppresses NF-κB activity in human colorectal cancer HT-29 cells 2008 372(1): p 236-242 Eo, H.J., et al., Anti-inflammatory and anti-cancer activity of mulberry (Morus alba L.) root bark 2014 14(1): p 1-9 Chen, Y.-C., et al., Morus alba and active compound oxyresveratrol exert anti-inflammatory activity via inhibition of leukocyte migration involving MEK/ERK signaling 2013 13(1): p 1-10 Chen, F., et al., Hypoglycemic activity and mechanisms of extracts from mulberry leaves (folium mori) and cortex mori radicis in streptozotocininduced diabetic mice 1995 115(6): p 476-482 Singab, A.N.B., et al., Hypoglycemic effect of Egyptian Morus alba root bark extract: effect on diabetes and lipid peroxidation of streptozotocininduced diabetic rats 2005 100(3): p 333-338 Bích, Đ.H., et al., Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam 2004 Zhang, L., et al., Characterization of a new flavone and tyrosinase inhibition constituents from the twigs of Morus alba L 2016 21(9): p 1130 Chaita, E., et al., Anti-melanogenic properties of Greek plants A novel depigmenting agent from Morus alba wood 2017 22(4): p 514 Loi, V.D., et al., Chemical constituents and tyrosinase inhibitory activity of aqueous fraction of the leaves of Morus alba Liin from Vietnam International Journal of Pharmacognosy 2018 5(7): p 399-403 Bone, K and S Mills, Principles and practice of phytotherapy: modern herbal medicine 2012: Elsevier Health Sciences Hsu, J.-H., C.-S Yang, and J.-J.J.A Chen, Antioxidant, Anti-αGlucosidase, Antityrosinase, and Anti-Inflammatory Activities of Bioactive Components from Morus alba 2022 11(11): p 2222 Hanh, N.T.M., N.K.P Phung, and Q.N.D.J.A.J.o.P.S Phuong, Studying on tyrosinase inhibition activity of some Vietnamese folk plants aims to use in skin-whitening cosmetics 2017 8(06): p 1319 Bisswanger, H., Enzyme kinetics: principles and methods 2017: John Wiley & Sons Liu, W., Introduction to modeling biological cellular control systems Vol 2012: Springer Science & Business Media 46