TỔNG QUAN
Tổng quan về melanin
1.1.1 Melanin và vai trò trong cơ thể
Sắc tố là một đặc điểm kiểu hình quan trọng trong tự nhiên, được định nghĩa là chất tạo màu phản xạ và hấp thụ sóng ánh sáng cụ thể trong tế bào động vật và thực vật Trong số các sắc tố sinh học, melanin là loại phổ biến nhất, hiện diện từ vi sinh vật đến động vật, bao gồm cả con người Ở con người, melanin chủ yếu tập trung ở da, tóc và võng mạc, được sản xuất bởi các tế bào sắc tố nằm ở lớp đáy của biểu bì.
Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím UVB bằng cách hấp thụ và tán xạ ánh sáng mặt trời, đồng thời loại bỏ các gốc oxy hóa tự do Sự tích tụ quá mức sắc tố ở biểu bì có thể dẫn đến các rối loạn da khác nhau Tăng sắc tố có thể xuất phát từ việc gia tăng số lượng tế bào tạo sắc tố hoặc tăng cường hoạt động của các enzym liên quan đến hình thành sắc tố.
Các tế bào biểu bì tạo sắc tố của động vật có vú sản xuất hai loại melanin chính: eumelanin và pheomelanin Eumelanin có màu sắc từ nâu đến đen, không tan trong hầu hết các dung môi và liên kết chặt chẽ với protein qua các liên kết đồng hóa trị Ngược lại, pheomelanin có màu từ vàng đến đỏ, với cấu trúc được hình thành từ các tiểu đơn vị benzothiazin, cũng liên kết chặt chẽ với protein thông qua các liên kết đồng hóa trị.
Tỷ lệ về số lượng và mật độ của hai melanin này sẽ quyết định màu sắc của da, mắt và tóc[9]
1.1.2 Quá trình tổng hợp sắc tố melanin trong da
Bước đầu tiên trong quá trình hình thành sắc tố là oxy hóa tyrosin thành dopaquinon, đây là bước giới hạn tốc độ trong sinh tổng hợp tyrosin Dopaquinon sau đó chuyển thành leukodopachrom và tiếp tục thành dopachrom Cuối cùng, eumelanin được hình thành thông qua các phản ứng oxy hóa từ 5,6-dihydroxyindol (DHI) và acid 5,6-dihydroxyindol-2-cacboxylic (DHICA).
4 của cystein hoặc glutathion, dopaquinon sẽ được chuyển hóa thành cysteyldopa hoặc glutathionyldopa Cysteinyldopa hoặc glutathionyldopa tiếp tục trải qua một loạt các phản ứng để tạo thành pheomelanin [10, 11]
Hình 1.1: Sơ đồ biểu diễn con đường sinh tổng hợp melanin
Tổng quan về enzym tyrosinase
Enzym tyrosinase (EC 1.14.18.1), còn được gọi là enzym polyphenol oxidase (PPO), là một enzym monooxygenase phổ biến trong nấm, động vật và thực vật Enzym này chứa đồng và tham gia vào hai phản ứng chính trong quá trình chuyển hóa melanin: hydroxyl hóa monophenol thành O-diphenol và oxi hóa O-diphenol thành O-quinon Sau đó, O-quinon sẽ tham gia vào một loạt các phản ứng để hình thành melanin.
Hình 1.2: Quá trình oxy hóa phenol thông qua enzym tyrosinase
Enzym tyrosinase tồn tại dưới ba dạng: oxy, deoxy và met-tyrosinase Cả met-tyrosinase và oxy-tyrosinase đều có hoạt tính diphenolase, nhưng chỉ oxy-tyrosinase mới có hoạt tính monophenolase Dạng deoxy-tyrosinase là dạng yếu, không ổn định và phản ứng với oxy để chuyển thành oxy-tyrosinase.
Hình 1.3: Các dạng oxi hóa của enzym tyrosinase
1.2.2 Cơ chế ức chế tyrosinase
Enzym tyrosinase thường bị ức chế qua ba cơ chế chính: ức chế cạnh tranh, ức chế không cạnh tranh và ức chế hỗn hợp Ngoài ra, cơ chế ức chế phi cạnh tranh cũng được coi là một trường hợp đặc biệt của ức chế hỗn hợp Để xác định cơ chế ức chế của enzym, người ta thường sử dụng phương trình Lineweaver – Burk, dựa trên dạng đường thẳng của phương trình Michaelis-Menten.
Mô hình động học Michaelis-Menten là một công thức đơn giản thể hiện mối quan hệ giữa tốc độ phản ứng của enzym và nồng độ cơ chất Phương trình Michaelis-Menten cung cấp cái nhìn rõ ràng về cách enzym hoạt động trong các phản ứng sinh hóa.
Trong đó: Vo: là tốc độ phản ứng ban đầu
Vmax::tốc đô phản ứng cực đại khi toàn bộ enzym liên kết cơ chất
Km: là hằng số Michelis Menten đặc trưng cho mỗi enzym {S}: nồng độ của cơ chất
Phương trình Michaelis-Menten có thể được biến đổi để phù hợp với dữ liệu thực nghiệm, và một trong những phương pháp đơn giản là nghịch đảo cả hai vế của phương trình.
Phương trình Lineweaver-Burk, hay còn gọi là phương trình nghịch đảo, mô tả mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và vận tốc phản ứng thông qua đồ thị Lineweaver-Burk, một đường thẳng thể hiện sự tương quan này.
Hình 1.4: Đồ thị Lineweaver-Burk
Đồ thị Lineweaver-Burk là một công cụ quan trọng trong việc thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng trong các cơ chế ức chế khác nhau.
* Ức chế cạnh tranh (Competitive inhibition)
Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, cả cơ chất lẫn chất ức chế đều tác động lên trung tâm hoạt động của enzym Chất ức chế sẽ gắn vào vị trí của cơ chất trên enzym, dẫn đến việc giảm khả năng hoạt động của enzym.
Hình 1.5: Cơ chế ức chế cạnh tranh
Khi nồng độ cơ chất dư thừa và nồng độ chất ức chế thấp, tác dụng của chất ức chế có thể bị giảm hoặc mất hoàn toàn Ngược lại, khi nồng độ cơ chất thấp và nồng độ chất ức chế cao, tác dụng ức chế sẽ diễn ra hoàn toàn Điều này được thể hiện qua phương trình và đồ thị Lineweaver-Burk.
Không có chất ức chế
Hình 1.6: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế cạnh tranh [14]
Ức chế không cạnh tranh (Uncompetitive inhibition) là một dạng ức chế đặc trưng, trong đó chất ức chế chỉ gắn kết với phức hợp enzyme-substrate (ES) mà không tương tác với enzyme tự do.
Chất ức chế không cạnh tranh gắn vào enzym cùng với cơ chất, nhưng không tranh chấp vị trí gắn Đồ thị và phương trình Lineweaver-Burk mô tả cơ chế này.
Hình 1.8: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế không cạnh tranh
*Ức chế hỗn hợp (Mixed inhibition)
Không có chất ức chế
Hình 1.9: Cơ chế ức chế hỗn hợp
Chất ức chế không chỉ liên kết với enzym tự do mà còn kết hợp với phức hợp enzym-substrate (ES), tạo thành phức hợp EIS, từ đó ngăn cản quá trình hình thành sản phẩm.
P Hiện tượng ức chế chỉ phụ thuộc vào nồng độ chất ức chế Tốc độ cực đại đo được khi không có mặt chất ức chế là cao hơn khi có mặt chất ức chế Đồ thị và phương trình Lineweaver-Burk như sau:
Hình 1.10: Đồ thị Lineweaver-Burk trong trường hợp ức chế hỗn hợp
Trong ức chế phi cạnh tranh, đây là một dạng đặc biệt của ức chế hỗn hợp, với điểm giao nhau của đồ thị đường thẳng nằm trên trục hoành.
1.2.3 Các chất ức chế enzym tyrosinase
1.2.3.1.Các chất ức chế enzym tyrosinase có nguồn gốc thiên nhiên
Không có chất ức chế
Polyphenol thực vật, đặc biệt là flavonoid, là nhóm hợp chất chứa nhiều nhóm chức phenol Đã có hơn 4000 flavonoid được xác định, phân bố chủ yếu trong lá, hạt, vỏ cây và hoa Các hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ thực vật khỏi tác động của tia cực tím và các tác nhân gây bệnh.
Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzyme tyrosinase in vitro hiện nay
Có hai phương pháp phổ biến để đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase Phương pháp in vitro, sử dụng enzym tyrosinase từ nấm để chuyển hóa L-tyrosin thành L-DOPAquinon và đo mức độ sản phẩm màu L-DOPAquinon, là phương pháp được ưa chuộng nhất Phương pháp thứ hai là đo hoạt tính của tyrosinase thông qua sự tích tụ melanin trong tế bào, tuy nhiên, phương pháp này phức tạp và tốn kém hơn.
Tyrosinase là một enzym quan trọng với nhiều cơ chất như L-tyrosin, L-DOPA, betaxanthin và dopaxanthin Do đó, có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để đánh giá hoạt tính của enzym này, bao gồm phương pháp phóng xạ và phương pháp đo tĩnh điện.
Phương pháp đo phóng xạ là một kỹ thuật nhạy bén, cho phép xác định quá trình oxy hóa của dopaquinon thành dopachrom, đồng thời đo lường số lượng ion H+ được giải phóng từ dopaquinon.
Phương pháp đo tĩnh điện sử dụng quá trình oxy hóa 4-tert-butylcatechol bởi O2, được xúc tác bởi enzym tyrosinase, để tạo ra 4-tert-butyl-o-benzoquinon Quá trình này tiêu thụ một lượng oxy xác định, cho phép đánh giá hoạt tính của tyrosinase thông qua phép đo stoichiometry.
Gần đây, phương pháp sắc ký lớp mỏng đã được đề xuất như một công cụ hiệu quả để đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase Đây là một phương pháp sàng lọc nhanh chóng, giúp phát hiện các chất ức chế tiềm năng trong nghiên cứu và phát triển sản phẩm.
Có 13 chất ức chế enzym tyrosinase, với ưu điểm là phương pháp này nhanh chóng và dễ thực hiện mà không cần máy quang phổ Một nghiên cứu khác đã áp dụng phương pháp huỳnh quang để sàng lọc các chất ức chế tyrosinase, cho phép xác định hiệu quả ức chế dựa trên đặc tính và cường độ bức xạ Phương pháp này hiệu quả trong việc sàng lọc các chất phân tử nhỏ nhưng khó thực hiện hơn so với sắc ký lớp mỏng.
Cây dâu (Morus alba L.)
Hình 1.11: Cây dâu tằm ở Việt Nam
Hình 1.12: Vỏ rễ cây dâu tằm (tang bạch bì)
Cây dâu tằm (Morus alba L.) được coi là loài cây quý trong sách cổ Trung Quốc nhờ vào nhiều công dụng cho con người Nó không chỉ được sử dụng làm thuốc trị bệnh mà còn là thực phẩm bổ dưỡng Trong y học cổ truyền Trung Quốc, lá, quả và vỏ cây M alba đã được áp dụng để điều trị sốt, bảo vệ gan, cải thiện thị lực, tăng cường khớp và hạ huyết áp Tại Hàn Quốc và Nhật Bản, lá dâu tằm được bệnh nhân tiểu đường sử dụng như một chất bổ sung để kiểm soát lượng đường trong máu.
Cây có thể đạt chiều cao lên tới 15m, nhưng thường chỉ cao từ 2-3m do việc hái lá Lá cây mọc so le, có hình bầu dục, nguyên hoặc chia thành 3 thùy, với đầu lá nhọn hoặc hơi tù và mép có răng cưa to Từ cuống lá tỏa ra 3 gân rõ rệt Hoa cây là đơn tính, khác gốc, trong đó hoa đực mọc thành bông với 4 đài và 4 nhị (có thể có 3 nhị), trong khi hoa cái cũng mọc thành bông hoặc khối hình cầu với 4 lá đài Quả của cây được bao bọc trong các lá đài, có dạng mọng nước, tạo thành một phức quả màu đỏ, sau đó chuyển sang đen sẫm, và có thể ăn được cũng như dùng làm thuốc.
Giới (regnum) Ngành (divisio) Lớp (class)
Họ (familia) Chi (genus) Loài (species)
Plantae Ngọc lan (Magnoliophyta) Ngọc lan (Magnoliopsida) Gai (Urticales)
1.4.2 Phân bố và bộ phận dùng
Cây dâu tằm, có nguồn gốc từ Trung Quốc, đã được trồng tại Việt Nam từ lâu và hiện nay được trồng rộng rãi để lấy lá nuôi tằm Ngoài ra, một số bộ phận của cây như lá, vỏ rễ và quả dâu cũng được khai thác để làm thuốc.
Dược liệu dâu tằm bao gồm nhiều bộ phận của cây:
Lá (tang diệp), dùng loại lá bánh tẻ (lá cho tằm ăn), phơi hay sấy nhẹ
Quả (tang thâm) thu hái khi quả chín
Cành (tang chi) thu hái quanh năm, thái mỏng, phơi khô
Vỏ rễ (tang bạch bì) phơi hay sấy khô
Tầm gửi cây dâu (tang kí sinh) là cây mọc ký sinh trên cây dâu
Tổ trứng bọ ngựa trên cây (tang phiêu tiêu) hình trứng nâu vàng, nâu đen, dùng tổ trứng chưa nở, trước khi dùng phải phơi khô
Ba flavonol glycoside, quercetin 3-(6-malonylglucoside), rutin và isoquercitrin, được xác định là các hợp chất chống oxy hóa chính trong chiết xuất ethanol từ lá của
Yang Yang và các cộng sự đã phát hiện 4 dẫn xuất 2-arylbenzofuran mới, được đặt tên là moracins V - Y, cùng với hai hợp chất đã biết là moracin N và moracin P Những hợp chất này được phân lập từ dịch chiết lá dâu tằm trong ethanol.
Từ chiết xuất lá butanol, 2 prenylflavanes mới và 1 glycoside, cùng với 6 hợp chất đã biết, isoquercitrin, astragalin, scopolin, skimin, roseoside II và benzyl D- glucopyranoside được phân lập [41]
Từ chiết xuất lá ethanol của M alba, morachalcones B và C đã được phân lập Chúng là những chalcone khác thường có vòng furan 5 cạnh có 1 nguyên tử O [42]
Từ dịch chiết lá metanol, một loại flavonoid mới và mười loại đã biết được phân lập [43]
Hình 1.13: Các flavonoid được phân lập từ lá dâu
Chiết xuất từ quả của M alba đã cho thấy sự hiện diện của 5 anthocyanin Qua quá trình chiết phân đoạn dựa trên hoạt tính sinh học từ chiết xuất ethanol của M alba, lần đầu tiên 25 hợp chất phenolic đã được phân lập thành công.
Quercetin 3-O-(6′′-O-acetyl)-β-D-glucopyranoside (R1 = H, R2 = (6′′-O- acetyl)-β-D-glc)
Quercetin 3,7-di-O-β-D-glucopyranoside (R1 = β-D-glc, R2 = β-D-glc) b
Hình 1.14: Các chất được phân lập được từ quả dâu
Rễ và vỏ rễ cây
Từ vỏ rễ của M alba, các ankaloid polyhydroxyl hóa đã được phân lập, bao gồm 1-deoxynojirimycin (DNJ) và các dẫn xuất của nó [46]
Các hợp chất khác được xác định từ rễ và vỏ rễ bao gồm terpenoid, flavonoid, stilbenoid và coumarin [47]
Hình 1.15: Các hợp chất được phân lập từ vỏ rễ cây dâu
Quả dâu chín chứa nhiều anthocyanin, một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, có khả năng loại bỏ gốc tự do vượt trội hơn vitamin C Tuy nhiên, nghiên cứu cho thấy dịch chiết lá methanol của cây M alba có giá trị chống oxy hóa cao hơn đáng kể so với quả Cụ thể, hoạt tính chống oxy hóa cao nhất được tìm thấy ở lá dâu đang trưởng thành, tiếp theo là lá non, lá trưởng thành, và cuối cùng là quả chín.
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Kuwanon G, một hợp chất được chiết xuất từ dịch vỏ rễ cây M alba trong metanol, đã được nghiên cứu và xác nhận có khả năng kháng khuẩn hiệu quả đối với các bệnh lý liên quan đến đường miệng.
Streptococcus mutans, Streptococcus sanguis, Streptococcus sobrinus và Porphyromonas gingivalis, với nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) là 8 àg/mL [49]
Từ chiết xuất vỏ rễ, phân lập được mulberrofuran G và albanol B ức chế mạnh
Salmonella typhimurium, Staphylococcus và Staphyloccoccus aureus, với MIC là 5,0 àg/mL 7,5 àg/m L[50]
Chiết xuất từ lá của M alba có hoạt tính kháng nấm Ở nồng độ 20, 40, 60, 80 àg/mL, chiết xuất từ lỏ trong methanol, cloroform và petroleum ether ức chế mạnh
Candida albicans và Aspergillus niger với vùng ức chế rộng 12-28 mm [51]
Trong nghiên cứu về các flavonoid được chiết xuất từ vỏ rễ của cây M alba, leachianone G đã thể hiện hoạt tính kháng vi-rút mạnh mẽ với giá trị IC50 là 1,6 µg/mL, trong khi mulberroside C chỉ cho thấy hoạt tính yếu với IC50 là 75 µg/mL đối với vi-rút herpes simplex loại 1.
Khả năng làm trắng da
Mulberroside F, được chiết xuất từ lá cây M alba bằng methanol, cho thấy hoạt tính chống tyrosinase mạnh gấp 4,5 lần so với axit kojic, giúp ức chế sự hình thành melanin trong tế bào.
Oxyresveratrol exhibits a powerful inhibitory activity that is 32 times stronger than kojic acid Among 15 flavonoids isolated from the ethanol extract of M alba leaves, norartocarpetin, euchrenone, and quercetin demonstrate significantly greater antityrosinase activity compared to kojic acid.
Khả năng gây độc tế bào
Một flavanone có tên 7, 2′, 4′, 6′-tetrahydoroxy-6-geranylflavanone đã được phân lập từ chiết xuất etyl axetat của vỏ rễ cây M alba Chất này cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ đối với tế bào dRLh84 của khối u gan chuột, với giá trị IC50 đạt 53 µg/mL.
Một flavanone glycoside mới đã được phân lập từ vỏ rễ, cho thấy khả năng chống tăng sinh với giá trị IC50 đối với tế bào ung thư buồng trứng ở người HO-8910 lần lượt là 3,7 μmol/L sau 48 giờ và 1,9 μmol/L sau 72 giờ tiếp xúc.
Albanol, được chiết xuất từ vỏ rễ của cây M alba, đã được chứng minh có khả năng gây độc tế bào và kích thích quá trình chết theo chương trình trong tế bào ung thư bạch cầu HL-60 của con người Hợp chất này thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh mẽ với giá trị IC50 là 1,7 μmol/L.
Morusin, một hợp chất được chiết xuất từ vỏ rễ dâu tằm, đã chứng minh khả năng gây ra quá trình chết theo chương trình và ức chế hoạt động của NF-κB trong các tế bào ung thư đại trực tràng HT-29 ở người.
Chiết xuất vỏ rễ cây M alba bằng metanol chứa kuwanons C và G cùng oxyresveratrol, được biết đến với hoạt tính chống viêm Cơ chế này có thể liên quan đến việc ức chế hóa trị liệu thông qua trung gian CXCR-4 và con đường MEK/ERK trong các tế bào T và tế bào miễn dịch khác.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, đối tượng nghiên cứu
Vỏ rễ cây Dâu - tang bạch bì (Cortex Mori Radicis) là nguyên liệu chính, được thu hái tại Hà Nội, sau đó rửa sạch và phơi khô đến khi đạt khối lượng không đổi Cuối cùng, nguyên liệu này được bảo quản cẩn thận trong túi nilon.
Mẫu nghiên cứu về Morus alba (L.) được giám định bởi Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Trường Đại Học Y Dược Hiện tại, mẫu tiêu bản này đang được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, thuộc Đại học Quốc Gia Hà Nội.
Hình 2.1: Vỏ rễ cây dâu
Nguyên vật liệu thí nghiệm
Bảng 2.1 Các thuốc thử và hóa chất cần thiết
STT Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc, xuất xứ Ghi chú
4 Na2HPO4 12H2O Sigma Aldrich MW: 177,99 g/mol
5 KH2PO4 Sigma Aldrich MW: 136,08 g/mol
MW: 46,07 g/mol Dung tích: 500 mL
9 Ethyl acetat Ghtech, Trung Quốc
2.2.2 Máy móc, thiết bị, dụng cụ
- Cân kĩ thuật Sartorius PRACTUM612 – 1S (Đức)
- Cân phân tích Sartorius QUINTIX224 – 1S (Đức)
- Máy đo hàm ẩm MB 45 (Ohaus- Mỹ)
- Máy siêu âm Elmasonic S100H (Đức)
- Máy quang phổ miễn dịch Epoch 2C
- Micro pipet đa kờnh 30-300àL, 100-1000àL
- Micro pipet đơn kờnh 20-200àL, 100-1000àL
Trong thực nghiệm, một số dụng cụ quan trọng bao gồm cốc có mỏ, đũa thủy tinh, ống đong, bình định mức, bình chiết, đầu côn, ống falcon, ống eppendorf và đĩa 96 giếng Những dụng cụ này hỗ trợ đắc lực trong việc đo lường, pha trộn và lưu trữ các mẫu thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung sau:
Nội dung 1: Đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các phân đoạn cao chiết từ vỏ rễ cây dâu
Nội dung 2: Xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase của phân đoạn có tác dụng tốt nhất
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Xây dựng quy trình chiết xuất dược liệu
- Dược liệu vỏ rễ cây dâu (2kg) khô được tiến hành chiết xuất bằng dung môi ethanol 70 % (5 lít x 3 lần) ở nhiệt độ phòng, mỗi lần 24 giờ
Gộp các dịch chiết ethanol, sau đó tiến hành lọc hút chân không Tiếp theo, cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không và sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 50°C cho đến khi đạt khối lượng không đổi, thu được cao chiết ethanol 70%.
Cao chiết toàn phần được hòa tan trong nước cất và tiến hành chiết phân đoạn bằng n-hexan, ethylacetat và n-butanol Sau đó, các dịch chiết n-hexan, ethylacetat, n-butanol cùng phần nước còn lại được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, tạo ra các cắn n-hexan, cắn ethyl acetat, cắn n-butanol và cắn nước.
Hình 2.2: Quy trình chiết xuất phân đoạn vỏ rễ cây dâu
2.4.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ cây dâu
Khả năng ức chế enzym tyrosinase có thể được thực hiện thông qua việc sử dụng L-DOPA làm cơ chất Để thực hiện thí nghiệm, cần chuẩn bị dung dịch tyrosinase với nồng độ 125 Units/mL từ Sigma Chemical, dung dịch L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) với nồng độ 1mg/ml, acid kojic và các phân đoạn dịch chiết có nồng độ từ 1µg/ml đến 500µg/ml.
L-DOPA Dopachrome Định lượng Dopachrom được thực hiện ở bước sóng 475 nm bằng đo quang
Chuẩn bị hóa chất cần thiết:
- Enzym Tyrosinase 125 U/ml pha trong đệm pH 6,5
- Cơ chất L-DOPA 1mg/ml
- Chứng dương: Acid kojic được hũa tan trong nước cất với nồng độ 80 àg/ml;
40 àg/ml; 20 àg/ml; 20 àg/ml; 8 àg/ml; 4 àg/ml; 2 àg/ml;
Mẫu thử được chiết xuất hòa tan trong DMSO và sau đó pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat 50mM với pH 6.5 Tiếp theo, mẫu được pha với đệm để đạt các nồng độ 200 àg/mL, 150 àg/mL, 100 àg/mL, 50 àg/mL, 20 àg/mL và 10 àg/mL phục vụ cho thí nghiệm.
- Mẫu đối chứng: Dung dịch đệm phosphat 50 mM, pH 6,5
Nghiên cứu tại Bộ môn Dược lý, Đại Học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tiến hành thử nghiệm đánh giá khả năng ức chế enzym Tyrosinase in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ cây dâu.
Để tiến hành thử nghiệm, thêm 20 μL dung dịch mẫu cần thử nghiệm và 50 μL enzym tyrosinase 125U/mL vào đĩa 96 giếng với thể tích đệm pH 6,5 phù hợp Ủ hỗn hợp trong bóng tối trong 10 phút, sau đó thêm 50 μL dung dịch L-DOPA và tiếp tục ủ trong 30 phút trong bóng tối để phản ứng xảy ra Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang ở 475 nm bằng máy quang phổ miễn dịch Epoch 2C.
Để đảm bảo tính chính xác trong thí nghiệm, cần thực hiện các mẫu đối chứng dương, mẫu chứng, mẫu trắng thử và mẫu trắng chứng Các thành phần của những mẫu này được bố trí theo bảng đã chỉ định, nhằm đảm bảo rằng kết quả thu được phản ánh đúng thực tế.
Bảng 2.2 Bố trí thử nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các mẫu thử
1mg/mL 50 50 50 50 Đệm phosphat pH 6,5 80 130 100 150
+ Tỷ lệ ức chế hoạt độ của enzym tyrosinase:
Trong đó: OD: Độ hấp thụ quang
2.4.3 Xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase của phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt nhất
Dựa trên kết quả đánh giá khả năng ức chế enzym tyrosinase, các phân đoạn dịch chiết có tác dụng ức chế cao nhất được lựa chọn để nghiên cứu động học ức chế enzym này Đánh giá động học được thực hiện ở nồng độ IC50, nhằm phân tích sự thay đổi nồng độ cơ chất L-DOPA và nồng độ dung dịch mẫu thử.
Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro, với sự thay đổi nồng độ cơ chất Cụ thể, quy trình được tiến hành như sau:
Để tiến hành ủ, đầu tiên trộn 50 μL enzym tyrosinase với 20 μL mẫu thử nghiệm hoặc acid kojic trong đĩa 96 giếng ở nhiệt độ 37C trong 10 phút Tiếp theo, thêm 50 μL dung dịch L-DOPA với các nồng độ khác nhau (0,5mg; 1mg; 2mg) và ủ tiếp ở 37C trong 30 phút để thực hiện phản ứng Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 475 nm.
Song song với mẫu thử và mẫu chứng làm các mẫu trắng thử và mẫu trắng chứng nhưng không có enzym tyrosinase mà thay bằng 50 μL dung dịch đệm phosphat 0,05 M
Cách xây dựng phương trình và đồ thị
Kết quả đo mật độ quang từ mẫu thử và mẫu chứng ở các nồng độ cơ chất khác nhau cho phép vẽ đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng Tốc độ phản ứng được biểu thị thông qua mật độ quang, giúp phân tích sự tương quan giữa các yếu tố này.
Đồ thị cho phép xác định phương trình đường thẳng thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng, từ đó tính được giá trị Km, hằng số Michelis-Menten đặc trưng cho từng loại enzym.
Dựa vào điểm giao nhau của đồ thị đường thẳng thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng, có thể xác định cơ chế ức chế tyrosinase Khi có mặt chất ức chế, nếu điểm giao nhau thay đổi, cho thấy cơ chế ức chế là cạnh tranh, không cạnh tranh, hỗn hợp hoặc phi cạnh tranh Việc phân tích này giúp hiểu rõ hơn về tác động của chất ức chế đối với enzym tyrosinase.
Hình 2.3 Đồ thị Lineweaver – Burk
Trong trường hợp ức chế cạnh tranh, đồ thị đường thẳng thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng của mẫu có chất ức chế sẽ giao nhau với mẫu không có chất ức chế tại một điểm trên trục tung.
Trong trường hợp ức chế không cạnh tranh, đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ cơ chất và tốc độ phản ứng của mẫu có chất ức chế sẽ song song với mẫu không có chất ức chế.
KẾT QUẢ
Kết quả chiết xuất Dược liệu
Sau khi chiết xuất 2kg vỏ rễ cây dâu bằng EtOH 70%, thu được 152,8g cao khô với hiệu suất chiết đạt 7,64% Tiếp theo, quá trình chiết phân đoạn cao EtOH cho kết quả với các phân đoạn n-Hexan, EtOAc, n-BuOH lần lượt là 9,41g, 26,49g và 14,31g, với hiệu suất chiết phân đoạn tương ứng là 6,16%, 17,34% và 9,37%.
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase của cao toàn phần ethanol từ vỏ rễ cây dâu, cùng với các phân đoạn n-hexan, ethylacetat, n-butanol và acid kojic, được trình bày chi tiết trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Khả năng ức chế enzym tyrosinase ở các phân đoạn của vỏ rễ cây dâu
Bảng 3.2: Khả năng ức chế enzym tyrosinase của acid Kojic
Nồng độ μg/ml Nồng độ μg/ml
Nồng độ μg/ml Nồng độ μg/ml
Hình 3.1 : Đồ thị biểu diễn khả năng ức chế enzym tyrosinase của các phân đoạn
Hình 3.2 : Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym tyrosinase của acid kojic
Giá trị phần trăm ức chế I (%) của cao chiết phân đoạn vỏ rễ cây dâu và acid kojic được thể hiện trong bảng 3.1 và bảng 3.2, cho thấy sự tăng dần của nồng độ từ 10 đến 200.
Nồng độ cao chiết tăng dần dẫn đến phần trăm ức chế enzym tyrosinase cũng tăng theo, cho thấy tác dụng ức chế của cao toàn phần và các cao phân đoạn từ vỏ rễ cây dâu tỷ lệ thuận với nồng độ chiết xuất Trong số các cao chiết phân đoạn, phân đoạn EtOAc đạt giá trị IC50 thấp nhất là 12,68 ± 1,64 µg/ml, thể hiện khả năng ức chế enzym tyrosinase mạnh mẽ hơn cả acid kojic.
EtOH (IC50: 25,95 ± 1,49 g/ml) và phân đoạn n-BuOH (IC50: 30,25 ± 2,34
g/mL) ,phân đoạn n-Hexan (IC50: 51,55±2,34 g/mL) thấp nhất là cắn nước (IC50:
Các phân đoạn có tác dụng ức chế enzym tyrosinase được sắp xếp theo thứ tự như sau: cắn nước < n-Hexan < n-BuOH < EtOH < EtOAc, với nồng độ 223 ± 4,86 µg/mL Mẫu chứng dương acid kojic cho kết quả IC50 là 13,94 ± 0,3 µg/mL, cho thấy khả năng ức chế enzym tyrosinase cao hơn so với các phân đoạn EtOH, n-BuOH, n-Hexan và cắn nước.
3.3 Kết quả xác định đặc điểm động học ức chế enzym tyrosinase của phân đoạn dịch chiết vỏ rễ cây dâu
Phân đoạn EtOAc cho thấy khả năng ức chế enzym tyrosinase mạnh mẽ, vì vậy nó được chọn để nghiên cứu động học ức chế enzym này Phương pháp xác định động học enzym dựa vào sự biến đổi nồng độ của cơ chất L-DOPA.
Nồng độ dung dịch thử EtOAc được xác định là 36 độ Giá trị IC50 của phân đoạn dịch chiết EtOAc là 12,68 ± 1,64 µg/mL Do đó, các nồng độ được đo gần sát giá trị IC50 là 0, 7,5, 15 và 30.
Kết quả đánh giá động học ức chế enzym tyrosinase được thể hiện qua đồ thị Lineweaver-Burk, cho thấy mối quan hệ giữa giá trị độ hấp thụ quang và thời gian phản ứng của cơ chất L-DOPA ở các nồng độ khác nhau Hình 3.3 minh họa tác dụng ức chế enzym tyrosinase của các phân đoạn dịch chiết EtOAc từ vỏ rễ cây dâu Phân tích đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy kiểu ức chế enzym tyrosinase của phân đoạn dịch chiết EtOAc là ức chế hỗn hợp.
Đồ thị Lineweaver-Burk cho phân đoạn dịch chiết EtOAc được trình bày ở hình 3.3, với các nồng độ 0; 7,5; 15; 30 μg/mL và nồng độ cơ chất L-DOPA là 0,5; 1; 2 mg/mL Hình 3.4 thể hiện đồ thị động học Dixon, mô tả mối tương quan giữa giá trị độ hấp thụ quang và thời gian phản ứng của phân đoạn dịch chiết EtOAc ở các nồng độ nêu trên.
Đồ thị Dixon trong hình 3.4 cho phân đoạn dịch chiết EtOAc được sử dụng để xác định hằng số ức chế Ki Nồng độ cơ chất L-DOPA là 0,5; 1; và 2 mg/mL Đặc điểm của đồ thị động học Dixon cho thấy đây là một chất ức chế cạnh tranh Hằng số ức chế Ki được xác định là 8,25 ± 0,04 µg/mL từ giao điểm của ba đường trên trục Ox của đồ thị.
Ki nhỏ chứng tỏ dịch chiết EtOAc vỏ rễ cây dâu có tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh
BÀN LUẬN
Về kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ vỏ rễ cây dâu
Melanin đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể khỏi tác hại của tia UV từ mặt trời, đồng thời giúp ngăn ngừa ung thư da và mang lại vẻ đẹp khỏe khoắn cho làn da Là sắc tố quyết định màu sắc của da, tóc và mắt, melanin được sản xuất bởi các tế bào hắc tố (melanocyte) trong biểu bì Tuy nhiên, việc tổng hợp và tích tụ melanin quá mức có thể dẫn đến các rối loạn da như đổi màu, sạm da, thâm quầng mắt, tàn nhang và tăng nguy cơ ung thư da Sự gia tăng hàm lượng melanin chủ yếu do hoạt động của enzym tyrosinase trong tế bào.
Hiện nay, các hoạt chất ức chế enzym tyrosinase như kojic acid, hydroquinon và arbutin được sử dụng phổ biến trong mỹ phẩm và thuốc uống Tuy nhiên, các chất này có nguồn gốc tổng hợp và có thể gây ra tác dụng phụ khi sử dụng lâu dài Acid kojic, một trong những chất này, không chỉ được sử dụng trong các sản phẩm làm đẹp mà còn là chất chứng trong các thí nghiệm nghiên cứu tác dụng ức chế enzym tyrosinase của các hợp chất khác Trong nghiên cứu cụ thể, acid kojic được sử dụng làm chứng dương để đánh giá tác dụng ức chế enzym tyrosinase từ vỏ rễ cây dâu.
Phân đoạn EtOAc trong cao chiết có giá trị IC50 thấp nhất là 12,68 ±1,64 g/ml, cho thấy khả năng ức chế enzym tyrosinase mạnh nhất, tương đồng với nghiên cứu của Jui Hung Hsu và cộng sự (2022) với IC50 là 11,27 ± 2,75 Điều này có thể được giải thích bởi sự hiện diện của các hợp chất phenolic và flavonoid trong vỏ rễ cây dâu, như maclurin, rutin, isoquercitrin, resveratrol và morin, đã được chứng minh có hoạt tính ức chế tyrosinase mạnh Nghiên cứu của Nguyễn Thị Mỹ Hạnh và cộng sự (2017) cho thấy IC50 của các phân đoạn n-Hexan và EtOH lần lượt là 44,26 ±9,34 và 55,35± 0,96, cho thấy sự khác biệt có thể do ảnh hưởng của dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu và địa điểm thu hái Do đó, cần thiết phải tiến hành các nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện chiết xuất và khảo sát các mẫu dược liệu khác nhau.
Việc lựa chọn dược liệu chất lượng cho sự phát triển của thực phẩm chức năng và thuốc trong tương lai cần đến 39 mẫu dược liệu khác nhau để có thêm bằng chứng xác thực.
Vỏ rễ cây dâu đã chứng minh khả năng ức chế enzyme tyrosinase, cung cấp cơ sở khoa học cho các nghiên cứu y học trong tương lai Việc tích tụ melanin quá mức có thể gây ra các vấn đề về da, ảnh hưởng đến thẩm mỹ Do đó, việc tìm kiếm các hoạt chất thiên nhiên để làm đẹp da và nâng cao sức khỏe làn da một cách an toàn và hiệu quả ngày càng trở nên cần thiết.
Về kết quả xác định kiểu ức chế enzym tyrosinase của phân đoạn dịch chiết có tác dụng tốt nhất
Dịch chiết vỏ rễ cây dâu cho thấy tác dụng ức chế enzym tyrosinase với động học chưa được nghiên cứu trước đây Phân đoạn dịch chiết EtOAc có giá trị IC50 thấp nhất, cho thấy tác dụng ức chế cao nhất, được chọn để nghiên cứu động học enzym tyrosinase Đồ thị Lineweaver-Burk cho thấy kiểu ức chế hỗn hợp, thể hiện tính chất trung gian giữa ức chế cạnh tranh và không cạnh tranh Đồ thị Dixon biểu thị đặc trưng của ức chế cạnh tranh, với hằng số ức chế Ki được xác định là 8,25 ± 0,04 àg/mL, thể hiện độ mạnh yếu của chất ức chế Ki, hay hằng số phân ly của phức hợp Enzym – chất ức chế (E-I), cho biết khả năng tách rời của phức hợp; nếu Ki cao, enzym sẽ hoạt động bình thường, dẫn đến hiệu quả ức chế yếu.
Ki nhỏ cho thấy chất ức chế liên kết chặt với enzym, dẫn đến lượng enzym hoạt động thấp và tác dụng ức chế mạnh Phân đoạn EtOAc từ dịch chiết vỏ rễ cây dâu có hằng số Ki tương đối nhỏ, chứng minh tác dụng ức chế enzym tyrosinase mạnh mẽ.
Kiểu ức chế hỗn hợp là đặc trưng của dược liệu, xuất phát từ sự hiện diện của nhiều hợp chất trong dịch chiết, mỗi hợp chất này có cơ chế tác dụng khác nhau.
Các hợp chất có hoạt tính trong phân đoạn dịch chiết EtOAc có khả năng cạnh tranh với L-DOPA để gắn vào trung tâm hoạt động của enzym tyrosinase Khi L-DOPA có nồng độ cao, các hợp chất này có thể liên kết vào một vùng khác của enzym, làm thay đổi cấu hình phân tử và ngăn enzym liên kết với cơ chất Điều này được chứng minh qua sự gia tăng giá trị Kmax và giảm giá trị Vmax khi nồng độ phân đoạn dịch chiết EtOAc tăng.