Đỗ thị thanh lam nghiên cứu tác dụng ức chế virus dengue in vitro của một số dược liệu khóa luận tốt nghiệp dược sĩ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH LAM NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VIRUS DENGUE IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2023 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ THANH LAM Mã sinh viên: 1801352 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VIRUS DENGUE IN VITRO CỦA MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Hồng Quỳnh Hoa Nơi thực hiện: Bộ mơn Thực vật Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương HÀ NỘI - 2023 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội nói chung, thầy mơn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội nói riêng giảng dạy, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm cho em suốt năm học qua, đồng thời giúp đỡ, tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn biết ơn sâu sắc tới TS Hồng Quỳnh Hoa – Trưởng Bộ mơn Thực vật, Phó trưởng khoa Dược liệu-Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hướng dẫn, tận tình bảo, góp ý hết lịng hỗ trợ em suốt q trình thực khóa luận mơn Em xin gửi lời cảm ơn TS Nguyễn Thị Thu Thủy – Phịng thí nghiệm ARBOKhoa Virus học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương nhiệt tình dẫn, giúp đỡ em hồn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn tới ThS Phạm Thị Linh Giang – Bộ môn Thực vật hết lòng hỗ trợ, bảo giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu Nhân dịp này, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới thầy cô anh chị kĩ thuật viên môn Thực vật môn Dược học cổ truyền – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ, bảo tạo điều kiện tốt phòng thí nghiệm dụng cụ, thiết bị để em hoàn thành tốt việc nghiên cứu, thực nghiệm mơn Lời cuối cùng, em xin cảm ơn gia đình, bạn bè bạn sinh viên K73 nghiên cứu Bộ môn Thực vật đồng hành em Đặc biệt em xin cảm ơn DS Trần Ngọc Ánh, DS.Nguyễn Thị Vân Anh bạn Vương Thị Ngân Hà, người tham gia nghiên cứu khoa học Bộ môn Thực vật, chia sẻ giúp đỡ em nhiều Do thời gian nghiên cứu hạn hẹp, kiến thức cịn hạn chế nên em khơng thể tránh khỏi thiếu sót q trình thực khóa luận Em kính mong nhận ý kiến, góp ý q báu thầy để đề tài khóa luận hồn thiện Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 22 tháng 05 năm 2020 Sinh viên Lam Đỗ Thị Thanh Lam MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC DANH MỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sốt xuất huyết Dengue 1.1.1 1.1.2 Sơ lược bệnh sốt xuất huyết Dengue Nguyên nhân gây bệnh 1.1.3 Dịch tễ học bệnh sốt xuất huyết Dengue 1.2 Cơ chế bệnh sinh sốt xuất huyết Dengue 1.3 Các đích tác dụng dược lý tiềm ức chế virus Dengue 1.3.1 1.3.2 NS2B/NS3 protease NS3 Helicase 1.3.3 Protein vỏ E 1.3.4 NS5-RNA phụ thuộc polymerase NS5-methyltransferase 1.4 Phương pháp điều trị bệnh sốt xuất huyết Dengue 1.4.1 Các phương pháp điều trị 1.4.2 Triển vọng điều trị tương lai 10 1.5 Sử dụng dược liệu điều trị sốt xuất huyết Dengue 10 1.5.1 Sử dụng dược liệu điều trị sốt xuất huyết Dengue giới 10 1.5.2 Sử dụng dược liệu điều trị sốt xuất huyết Việt Nam 12 1.6 Một số dược liệu tiềm điều trị sốt xuất huyết Dengue 13 1.6.1 Cỏ sữa nhỏ 13 1.6.2 Diệp hạ châu đắng 13 1.6.3 Đu đủ 14 1.6.4 Hoàng kỳ 14 1.6.5 Trinh nữ hoàng cung 14 1.6.6 Xuyên tâm liên 15 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.1 Nguyên vật liệu – thiết bị 16 2.2 Nội dung nghiên cứu 18 2.3 Phương pháp nghiên cứu 18 2.3.1 Chuẩn bị cao dược liệu 18 2.3.2 Đánh giá in vitro tác dụng ức chế Dengue typ DENV 1-4 20 2.3.3 Định tính thành phần hóa học cao dược liệu 24 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26 3.1 Kết thực nghiệm nhận xét 26 3.1.1 Đánh giá sàng lọc in vitro tác dụng ức chế type virus Dengue số dược liệu thu hái Việt Nam 26 3.1.2 Định tính thành phần hố học DHCĐ thăm dò tác dụng ức chế Dengue phân đoạn chiết từ dược liệu 27 3.2 Bàn luận 33 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ Tiếng Anh Thuật ngữ Tiếng Việt ADE Antibody-dependent enhancement Hiện tượng tăng nặng phụ thuộc kháng thể MEM Minimal Essential Medium Môi trường thiết yếu tối thiểu DENV Dengue Virus Virus Dengue DHCĐ IC50 MC PRNT Diệp hạ châu đắng Half maximal inhibitory Nồng độ ức chế tối đa concentration Methylcellulose Plaque Reduction Neutralisation Test Rf Retardation factor RNA Ribonucleic Acid SXHD WHO nửa Trung hòa giảm đám hoại tử Hệ số lưu giữ Sốt xuất huyết Dengue World Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Thông tin mẫu nghiên cứu 16 Bảng 2.2 Lượng dung môi EtOH 960 sử dụng chiết cao toàn phần dược liệu .18 Bảng 3.1 Khối lượng mẫu cao dược liệu toàn phần 26 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính cao tồn phần dược liệu chủng virus Dengue 1-4 26 Bảng 3.3 Khối lượng mẫu cao phân đoạn DHCĐ 28 Bảng 3.4 Một số thành phần hóa học Diệp hạ châu đắng 28 Bảng 3.5 Thăm dò tác dụng ức chế DENV-1 cao phân đoạn DHCĐ .32 Bảng 3.6 Đĩa ni thăm dị tác dụng ức chế DENV-1 cao phân đoạn DHCĐ 32 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vịng đời virus Dengue .4 Hình 1.2 Bản đồ tỷ lệ mắc SXHD 12 tháng tính 100000 dân từ 02/2022 đến 03/2023 [69] Hình 1.3 Cơ chế bệnh sinh nhiễm virus Dengue [42] Hình 2.1 Sơ đồ chiết cao toàn phần 19 Hình 2.2 Sơ đồ chiết cao phân đoạn 20 Hình 2.3 Sơ đồ cho hỗn hợp virus-mẫu vào giếng tế bào giai đoạn xác định khả ức chế DENV mẫu cao toàn phần 23 Hình 2.4 Sơ đồ cho hỗn hợp virus-mẫu vào giếng tế bào giai đoạn thăm dò tác dụng cao phân đoạn type DENV-1 23 Hình 3.1 Đĩa ni cấy in vitro typ virus Dengue với mẫu cao DHCĐ 27 Hình 3.2 Sắc ký đồ cao toàn phần cao phân đoạn DHCĐ với hệ dung môi toluen:ethyl acetat:axit formic (5:3,5:0,5) 29 Hình 3.3 Sắc ký đồ cao tồn phần cao phân đoạn DHCĐ với hệ dung môi toluen:ethyl acetat:axit formic (5:3,5:0,5) 30 Hình 3.4 Sắc ký đồ cao tồn phần cao phân đoạn DHCĐ 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Sốt xuất huyết Dengue (SXHD) bệnh truyền nhiễm cấp tính virus Dengue gây Virus truyền từ người bệnh sang người lành muỗi đốt, vecto truyền bệnh quan trọng muỗi Aedes aegypti Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), bệnh xuất 100 quốc gia nửa dân số giới có nguy mắc SXHD [1] Bệnh lưu hành phổ biến vùng khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới Việt Nam nằm vùng lưu hành dịch sốt xuất huyết, ca mắc SXHD phát nước, tập trung nhiều tỉnh đồng sông Cửu Long, đồng Bắc Bộ vùng ven biển miền Trung [2] Hiện tại, bệnh sốt xuất huyết Dengue chưa có thuốc điều trị đặc hiệu Các trường hợp mắc bệnh điều trị triệu chứng theo dõi để có phương án xử trí kịp thời Hầu hết trường hợp nhiễm sốt xuất huyết Dengue khơng có triệu chứng diễn biến nhẹ, nhiên số trường hợp diễn biến nặng chí gây tử vong Do vậy, việc tìm thuốc điều trị SXHD để giảm ca bệnh nặng tử vong cần thiết Nhu cầu sử dụng dược chất làm thuốc từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên tăng lên chúng coi an tồn, độc hại tác dụng phụ Do đó, việc tìm kiếm hoạt chất chống sốt xuất huyết Dengue từ dược liệu ngày quan tâm Với nguồn tài nguyên thực vật phong phú, y học cổ truyền lâu đời, Việt Nam có tiềm lớn việc phát triển thuốc điều trị SXHD từ dược liệu Trên giới, có nhiều nghiên cứu đánh giá, sàng lọc tác dụng ức chế virus Dengue in vitro cao chiết dược liệu chất/ nhóm chất phân lập từ dược liệu [7], [27], [40], [46] Tại Việt Nam, thời gian gần nghiên cứu theo hướng quan tâm [61], [62] Dựa kinh nghiệm dân gian nghiên cứu sàng lọc tác dụng ức chế virus Dengue dược liệu trước [11], [52], [45], [57], [30], [59], [15] lựa chọn mẫu dược liệu đưa vào nghiên cứu bao gồm: toàn Diệp hạ châu đắng, Đu đủ, rễ Hoàng kỳ, Trinh nữ hoàng cung, phần mặt đất Xuyên tâm liên, tồn Cỏ sữa nhỏ, Do đó, đề tài “Nghiên cứu tác dụng ức chế virus Dengue in vitro số dược liệu” thực với mục tiêu cụ thể là: - Đánh giá sàng lọc in vitro tác dụng ức chế typ virus Dengue số dược liệu thu hái Việt Nam - Định tính thành phần hố học dược liệu tiềm thăm dò tác dụng ức chế Dengue phân đoạn chiết từ dược liệu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan sốt xuất huyết Dengue Theo Hướng dẫn Giám sát phòng, chống bệnh sốt xuất huyết Dengue Bộ Y tế ban hành, bệnh sốt xuất huyết Dengue (SXHD) bệnh nhiễm virus Dengue (DENV) cấp tính muỗi truyền gây thành dịch lớn [5] 1.1.1 Sơ lược bệnh sốt xuất huyết Dengue Nguồn gốc từ “Dengue” khơng rõ ràng, có giả thuyết cho từ bắt nguồn từ cụm từ tiếng Swahili "Ka-dinga pepo", có nghĩa "cơn co giật giống chuột rút gây quỷ" Từ "dinga" cụm từ "Ka-dinga pepo" cho có liên quan đến từ "dengue" tiếng Tây Ban Nha, có nghĩa khó tính thận trọng, mô tả cách người bị đau xương khớp sốt dengue Ở vùng dịch lưu hành, hầu hết bệnh nhân sốt xuất huyết khơng có triệu chứng có biểu bệnh sốt nhẹ khỏi sau 1-2 tuần Bệnh nhân thường xuất triệu chứng từ 4-10 ngày sau nhiễm bệnh, chủ yếu sốt cao, đau đầu dội, đau khớp, buồn nôn/ nôn mửa, phát ban Các triệu chứng thường khỏi sau 27 ngày, nhiên tỷ lệ nhỏ bệnh nhân xuất triệu chứng nghiêm trọng (thường sau hết sốt), chủ yếu liên quan tới trình trạng huyết tương tăng tính thấm thành mạch, có khơng có kèm theo chảy máu Các trường hợp trở nặng cần nhập viện điều trị sớm tốt Những người tái nhiễm SXHD có nguy xuất triệu chứng nặng [44], [71] 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh Sốt xuất huyết Dengue bệnh gây người nhiễm bốn kiểu huyết virus Dengue (DENV-1 đến DENV-4) lan truyền muỗi [65] Năm 1906, nghiên cứu chứng minh muỗi Aedes tác nhân lây truyền bệnh SXHD [60] Mặc dù đợt bùng phát bệnh phù hợp với lâm sàng sốt xuất huyết Dengue báo cáo nhiều kỷ, đến năm 1943 Nhật Bản năm 1945 Hawaii, hai loại virus sốt xuất huyết phân lập (lần lượt có tên DENV-1 DENV-2) [23] Kiểu huyết thứ ba thứ tư phát vùng đô thị Philippin Thái Lan vào năm 1954 [25], [60] 1.1.2.1 Virus Dengue Virus Dengue thuộc chi Flavivirus, họ Flaviviridae, thuộc nhóm virus gây bệnh thông qua động vật chân khớp, gồm typ huyết DENV-1, DENV-2, DENV3 DENV-4 Các DENV kiểu huyết khác từ 25 đến 40% cấp độ axit amin phân tách thành kiểu gen với khác biệt khoảng 3% [42] Nhiễm loại huyết DENV tạo kháng thể đặc hiệu chống lại loại huyết Khi kháng thể từ lần lây nhiễm suy giảm, lần lây nhiễm thứ phát kiểu huyết khác gây nhiều triệu chứng nặng Các 59 Tayone W C Tayone J C., Hashimoto M (2014), "Isolation and structure elucidation of potential Anti-Dengue metabolites from Tawa-Tawa (Euphorbia hirta Linn.)", Walailak Journal of Science and Technology, 11(10), pp 825– 832 60 Tian Yu-Shi (2018), "Dengue Virus and Its Inhibitors: A Brief Review", 61 Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 63(3), pp 191-206 Tran Thi Phuong Thao Nguyen Quang Co, Ho Ngoc Anh, Nguyen Thi Luu, Vu Thi Bich Hau, Nguyen Thi Thu Thuy, Tran Van Chien, Nguyen The Anh, Thanh Q Bui … (2022), "Anti-Dengue Screening on Several Vietnamese 62 Medicinal Plants: Experimental Evidences and Computational Analyses", Chemistry & Biodiversity, 19(7), pp Tran Thi Phuong Thao Nguyen Thi Dung, Pham Thi Ninh, Tran Van Chien, Ho Ngoc Anh, Vu Thi Bich Hau, Nguyen Thi Thu Thuy , (2022), "Phytochemistry of the unpolar extract of Carica papaya leaves and its antidengue activity", 63 64 Vietnam Journal of Chemistry, 60(6), pp 777-783 Vanessa Loaiza-Cano Laura Milena Monsalve-Escudero, Carlos da Silva Maia Bezerra Filho, Marlen Martinez-Gutierrez,, and Damião Pergentino de Sousa (2021), "Antiviral Role of Phenolic Compounds against Dengue Virus: A Review", Biomolecules, 11(1), pp 11E Vivek Dhar Dwivedi Indra Prasad Tripathi, Sarad Kumar Mishra (2016), "In silico evaluation of inhibitory potential of triterpenoids from Azadirachta indica against therapeutic target of dengue virus, NS2B-NS3 protease", Journal of 65 66 67 vector borne disease 53(2), pp 156-161 WHO (2012), "Global strategy for dengue prevention and control 2012-2020", WHO Press, pp World Health Organization Regional Office for South-East Asia, Comprehensive Guideline for Prevention and Control of Dengue and Dengue Haemorrhagic Fever Revised and expanded edition 2011: WHO Regional Office for South-East Asia Xiaorong Yang Mikkel B M Quam , Tongchao Zhang , Shaowei Sang (2021), "Global burden for dengue and the evolving pattern in the past 30 years", Journal of travel medicine, 28(8), pp 146 Nguồn Website 68 Pacific WHO Western, "Dengue in Viet Nam", Retrieved, from https://www.who.int/vietnam/vi/health-topics/dengue 69 Sức khỏe & Đời sống (2023), "Năm 2022, nước ghi nhận 360 nghìn trường hợp mắc sốt xuất huyết", Retrieved 14/05/2023, from 44 https://suckhoedoisong.vn/nam-2022-ca-nuoc-ghi-nhan-hon-360-nghin-truonghop-mac-sot-xuat-huyet-169230102095648904.htm 70 Viện Khoa học Thống kê (2021), "Dịch tễ học sốt xuất huyết mối liên quan đến môi trường, khí hậu", Retrieved 14/05/2023, from https://vienthongke.vn/dich-te-hoc-sot-xuat-huyet-va-moi-lien-quan-den-moi- 71 truong-khi-hau/ WHO (2023), "Dengue and severe dengue", Retrieved, from https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severedengue 45 PHỤ LỤC Danh mục phụ lục Phụ lục Phiếu giám định tên khoa học 46 Phụ lục Phiếu giám định tên khoa học 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58