Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dược liệu cam thảo glycyrhiza uralensis fisch

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXI HĨA CỦA DƢỢC LIỆU CAM THẢO Glycyrrhiza uralensis Fisch HÀ NỘI – 2021 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƢỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA DƢỢC LIỆU CAM THẢO Glycyrrhiza uralensis Fisch Ngƣời thực : Đỗ Thị Hồng Anh Mã sinh viên : 637010 Lớp : K63CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Ngƣời hƣớng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thanh Hải : TS Nguyễn Thị Thanh Hà Bộ môn : CNSH Thực vật HÀ NỘI - 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu, hình ảnh kết báo cáo trung thực, khách quan chƣa đƣợc công bố cơng trình khoa học Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp đƣợc cảm ơn thơng tin trích dẫn, tài liệu tham khảo đƣợc rõ nguồn gốc danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Đỗ Thị Hồng Anh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em muốn gửi lời cảm ơn tới Ban giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô môn Công nghệ sinh học thực vật tồn thể thầy khoa Công nghệ sinh học tạo điều kiện để em học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Thanh Hải TS Nguyễn Thị Thanh Hà theo sát, quan tâm giúp đỡ, tận tình dẫn tạo điều kiện tốt nhƣ truyền đạt cho em nhiều kiến thức kinh nghiệm quý báu Em không học thêm đƣợc nhiều kiến thức liên quan đến ngành học mà học đƣợc nhiều kĩ có ích sống Em xin gửi lời cảm ơn đến anh, chị, bạn em- phịng thí nghiệm Bộ môn Nội- Chẩn- Dƣợc- Độc chất, Khoa Thú Y ln nhiệt tình giúp đỡ đồng hành em suốt thời gian vừa qua Cuối em xin dành lời cảm ơn đến gia đình bạn bè, ngƣời tạo móng chỗ dựa tinh thần vững cho em suốt trình học tập nghiên cứu Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2022 Sinh viên Đỗ Thị Hồng Anh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu cam thảo 2.2 Nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dƣợc tự nhiên thề giới 2.3 Tình hình nghiên cứu tác dụng dịch chiết cam thảo 2.3.1 Nghiên cứu nƣớc 2.3.2 Nghiên cứu nƣớc 2.4 Tổng quan chủng vi khuẩn 2.4.1 Nhóm vi khuẩn Gram dƣơng 2.4.2 Nhóm vi khuẩn gram âm 11 2.5 Tổng quan polyphenol 12 2.5.1 Giới thiệu chung polyphenol 12 2.5.2 Cơ chế hoạt động hợp chất chống oxy hóa polyphenol 14 2.5.3 Thành phần pholyphenol cam thảo 16 2.6 Hoạt tính chống oxy hóa 16 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Vật liệu nghiên cứu 18 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 18 3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu 18 iii 3.1.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 18 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 3.2.1 Phƣơng pháp chiết xuất dƣợc liệu 19 3.2.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết dƣợc liệu vi khuẩn 22 3.2.3 Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng polyphenol 23 3.2.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 25 3.2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 PHẦN IV KẾT QUẢ 28 4.1 Kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn loại dich chiết cam thảo chƣa vàng 28 4.1.1 Kết đƣờng kính vịng vô khuẩn loại dich chiết cam thảo chƣa 28 4.1.2 Kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn loại dich chiết cam thảo vàng 32 4.1.3 So sánh kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn loại dich chiết cam thảo chƣa vàng 34 4.2 Kết xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số dịch chiết dƣợc liệu 35 4.2.1 Kết xây dựng đồ thị chuẩn hàm lƣợng acid chlorogenic gia tăng giá trị mật độ quang đo 35 4.2.2 Kết hàm lƣợng polyphenol tổng số dịch chiết cam thảo 37 4.3 Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết cam thảo 39 4.3.1 Kết xây dựng đồ thị chuẩn hàm lƣợng VTM E khả loại bỏ gốc tự DPPH 39 4.3.2 Kết xác định khả chống oxy hóa dịch chiết cam thảo 40 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 48 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm) dịch chiết dƣợc liệu cam thảo chƣa chủng vi khuẩn 29 Bảng 4.2: Đƣờng kính vịng vô khuẩn (mm) dịch chiết dƣợc liệu cam thảo vàng chủng vi khuẩn 33 Bảng 4.3: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic 36 Bảng 4.4: Hàm lƣợng polyphenol tổng số dƣợc liệu cam thảo trƣớc sau quy đổi theo mg CGA/100mg dƣợc liệu khô 37 Bảng 4.5: Hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn VTME xác định theo phƣơng pháp sử dụng DPPH nồng độ khác (AA%) 39 Bảng 4.6: Hàm lƣợng chất chống oxy hóa dịch chiết cam thảo sử dụng dụng môi khác 42 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Thân đoạn rễ cam thảo Hình 2.2: Các phân nhóm Flavonoid 13 Hình 2.3: Một số loại thực vật có khả chỗng oxy hóa 17 Hình 3.1: Dạng bột mịn dƣợc liệu A: Bột cam thảo chƣa 20 Hình 3.2: Dịch chiết dƣợc liệu đƣợc li tâm lọc loại bỏ cặn 20 Hình 3.3: Dƣợc liệu sau pha lỗng đƣợc bảo quản với dung tích 1ml ống Eppendorf 1,5ml 21 Hình 3.4: Khả ức chế vi khuẩn dịch chiết cam thảo chƣa sau 24h nuôi vi khuẩn 23 Hình 3.5: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol 25 Hình 3.6: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hoạt tính chống oxy hóa sử dụng thuốc thử DPPH 26 Hình 3.7: Máy quang phổ so màu 722 Ultra Violet - Visibility Spectrum, cơng ty Jinghua, Trung Quốc (ảnh chụp phịng thí nghiệm) 26 Hình 4.1: Đánh giá ảnh hƣởng DMSO (Hình A) pH (Hình B) đến phát triển vi khuẩn 28 Hình 4.2: Vịng vơ khuẩn dich chiết cam thảo chƣa sao-methanol chủng vi khuẩn S aureus ATCC 25923, B.sub, G philus 30 Hình 4.3: Khả kháng khuẩn dịch chiết cam thảo chƣa sao- ethanol nồng độ dịch chiết 2g/ml giảm so với dịch chiết nồng độ 1g/ml dịch chiết không khuyếch tán hết đƣợc vào môi trƣờng thạch 31 Hình 4.4: So sánh kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết dung môi cam thảo chƣa vàng chủng vi khuẩn nồng độ 1g/ml DMSO 34 vi Hình 4.5: Mối tƣơng quan nồng độ acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang 36 Hình 4.6: Polyphenol dịch chiết cam thảo vàng làm đổi màu thuốc thử Folin Ciocalteu nồng độ dịch chiết 100 mg/ml DMSO 38 Hình 4.7: Biểu đồ so sánh hàm lƣợng polyphenol dịch chiết dƣợc liệu cam thảo trƣớc sau vàng 38 Hình 4.8: Mối tƣơng quan hàm lƣợng chất chuẩn VTM E (mg/ml) khả loại bỏ gốc tự DPPH 39 Hình 4.9: Sự thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo hoạt tính chống oxi hóa VTME (chất chuẩn) nồng độ khác (mg/ml) 40 Hình 4.10: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dƣợc liệu cam chƣa nồng độ 20mgl/ ml làm đổi màu thuốc thử DPPH 40 Hình 4.11: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dƣợc liệu cam vàng nồng độ 20mgl/ ml làm đổi màu thuốc thử DPPH 41 Hình 4.12: Khả chống oxy hóa dịch chiết cam thảo chƣa cam thảo vàng- hexan nồng độ 100mg/ml làm đổi màu DPPH 41 Hình 4.13: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết cam thảo quy đổi theo hàm lƣợng VTME (mg/100 mg dƣợc liệu) 42 Hình 4.14: Khả chống oxy hóa dịch chiết cam thảo chƣa (culvet trái) cam thảo vàng (culvet phải) nồng độ 20mg/ml làm đổi màu DPPH 43 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Viết đầy đủ ATCC American Type Culture Collection DMSO Dimethyl Sulfoxide DPPH 1,1-Diphenyl-2-Picrylhydrazyl VTME Vitamin E DW Nƣớc nóng B subtilis Bacillus subtilis E coli Eschrichia Coli G philus Geobacillus stearothermophilus Pseudo, P aeruginosa Pseudomonas aeruginosa S aureus Staphylococcus aureus CGA Acid chlorogenic viii 4.1.3 So sánh kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn loại dich chiết cam thảo chƣa vàng Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) Methanol Ethanol Aceton Ethyl acetat Hexan DW 16.00 14.00 12.00 10.00 8.00 6.00 4.00 2.00 0.00 ct ct chưa vàng ct ct chưa vàng ct ct chưa vàng ct ct chưa vàng ct ct chưa vàng ct ct chưa vàng S aureus ATCC 25023 S aureus ATCC 25923 E coli ATCC 25922 P seudo G philus B subtilis Tác dụng dịch chiết Cam thảo trước sau vàng chủng vi khuẩn Hình 4.4: So sánh kết đƣờng kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết dung môi cam thảo chƣa vàng chủng vi khuẩn nồng độ 1g/ml DMSO Theo đồ thị hình 4.5, thấy rõ thay đổi hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết dƣợc liệu cam thảo sau vàng Đa số dịch chiết dung mơi methanol, ethanol, aceton hoạt tính kháng khuẩn giảm hoàn toàn tác dụng (trên vi khuẩn G philus E coli) Với dịch chiết cam thảo vàng -ethyl acetat, khả kháng khuẩn có xu hƣớng tăng biểu qua kết chủng vi khuẩn S aureus ATCC 25923, P seudo, B subtilis Dịch chiết dƣợc liệu với dung môi DW cho thấy khả kháng khuẩn tăng lên chủng vi khuẩn: E coli ATCC 25922, P seudo, G philus B subtilis Đặc biệt sau vàng, dịch chiết dƣợc liệu có tác dụng ức chế phát triển vi khuẩn chủng vi khuẩn Gram (-) E coli ATCC 25922 (với dung môi methanol, ethanol, aceton, dw) P seudo (với dung môi methanol, ethanol, ethyl acetat, dw) điều lí giải dƣợc liệu tiếp 34 xúc với nhiệt độ cao số hợp chất có phân tử lớn bị bẻ gãy thành phân tử nhỏ hơn, dễ hấp thu có tác dụng mạnh Kết dịch triết dƣợc liệu sau với dung môi methanol, ethanol aceton vi khuẩn gram (-) tăng lên kết dung môi vi khuẩn gram (+) lại giảm xuống Trên thực tế, hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết với dung mơi cao phụ thuộc vào tính tan thành phần tạo tác dụng có loại dƣợc liệu dung môi khác phụ thuộc vào chất dƣợc liệu (Cowan, 1999) Do chƣa đủ chứng chế tác động thay đổi cấu trúc hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn cam thảo sau vàng, giả thiết đƣợc đƣa hợp chất có tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn gram (-) vi khuẩn gram (+) khác Điều tƣơng thích với nghiên cứu Misato Ota &cs (2017) cho thấy hàm lƣợng số chất rễ cam thảo tăng nhƣ isoliquiritin, isoliquiritigenin, glucoisoliquiritin, … sau sao, formononetin gancaonin L lại giảm Kết luận: Dƣợc liệu cam thảo có chứa hợp chất có khả kháng vi khuẩn nhƣ: S aureus (ATCC 25023,25923), B subtilis, G philus Một số hợp chất bền với nhiệt 4.2 Kết xác định hàm lƣợng polyphenol tổng số dịch chiết dƣợc liệu 4.2.1 Kết xây dựng đồ thị chuẩn hàm lƣợng acid chlorogenic gia tăng giá trị mật độ quang đo Kết đƣợc tập hợp bảng 4.3 thể hình 4.5 35 Bảng 4.3: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic Mức độ tăng mật độ quang 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 2.0 0.08±0 0.152±0.004 0.215±0.004 0.296±0.001 0.349±0.004 0.415±0.003 0.533±0.005 0.575±0.010 0.647±0.072 0.699±0.004 1.128±0.040 Mức độ gia tăng mật độ quang Nồng độ acid chlorogenic (mg/ml) 1.4 y = 0.5646x + 0.0774 R² = 0.9727 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 Nồng độ (mg/ml) Ghi chú: Mức độ gia tăng mật độ quang= OD Sample-OD Blank Hình 4.5: Mối tƣơng quan nồng độ acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang Kết cho thấy có mối tƣơng quan thuận hàm lƣợng axit chlorogenic mức độ tăng giá trị mật độ quang với hệ số xác định R² = 0,9727 p value