Khóa luận tốt nghiệp ghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ dược liệu rau má, rau sam, trầu không, khế

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ DƯỢC LIỆU RAU MÁ, RAU SAM, TRẦU KHÔNG, KHẾ Người thực Mã sinh viên Lớp Khoa Người hướng dẫn Bộ mơn : : : : : HỒNG ĐỨC THỌ 620543 K62CNSHB CÔNG NGHỆ SINH HỌC PGS.TS NGUYỄN THANH HẢI TS NGUYỄN THỊ THANH HÀ : CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT HÀ NỘI – 2021   LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan số liệu, hình ảnh kết báo cáo trung thực, khách quan chưa công bố cơng trình khoa học Tơi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực khóa luận tốt nghiệp cảm ơn thơng tin trích dẫn, tài liệu tham khảo rõ nguồn gốc danh mục tài liệu tham khảo khóa luận Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Hoàng Đức Thọ i   LỜI CẢM ƠN Trải qua tháng làm việc liên tục, có nhiều khó khăn dịch bệnh phải dãn cách việc tạo điều kiện giúp sức học viện, khoa thầy cô cuối đề tài khóa luận tốt nghiệp em hoàn thành tới ngày bảo vệ hội đồng Trước tiên em chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Chủ nhiệm khoa Cơng nghệ Sinh học, tồn thể Thầy, Cơ môn Công nghệ Sinh học Thực vật, môn Nội – Chẩn – Dược – Độc chất giúp đỡ em q trình thực khóa luận Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS.Nguyễn Thanh Hải, cô TS.Nguyễn Thị Thanh Hà, anh chị, bạn đồng nghiệp theo sát tận tình hướng dẫn dạy cho em suốt thời gian thực đề tài Sau cùng, khóa luận khép lại kết thúc năm học tập, rèn luyện học viện, (em) xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới bố mẹ, gia đình, quý thầy cô, bạn bè bên cạnh ủng hộ, động viên q trình hồn thiện thân trường thân yêu này! Tôi (em) xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày … tháng … năm 2021 Sinh viên Hoàng Đức Thọ ii   MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x TÓM TẮT KHÓA LUẬN xi PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH – YÊU CẦU PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 CƠ SỞ CỦA VIỆC DÙNG THUỐC THẢO DƯỢC 2.2 MỘT SỐ THÀNH TỰU TRONG NGHIÊN CỨU THUỐC THẢO DƯỢC 2.3 CÁC DƯỢC LIỆU SỬ DỤNG 2.3.1 Cây Trầu không 2.1.2 Cây Rau má 2.1 Cây Rau sam 2.1.4 Cây Khế 2.4 CƠ SỞ CỦA VIỆC SỬ DỤNG DUNG MÔI TRONG CHIẾT XUẤT DƯỢC LIỆU 10 2.5 TỔNG QUAN VỀ POLYPHENOL 11 2.6 HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA 12 PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 3.2 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 16 iii   3.2.1 Dược liệu 16 3.2.2 Vi khuẩn 16 3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.3.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu 16 3.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết dược liệu vi khuẩn 18 3.3.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol dược liệu 20 3.3.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 21 3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22 4.1 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 22 3.1.1 So sánh đường kính vịng vô khuẩn dịch chiết dược liệu nồng độ khác 22 3.1.2 So sánh tác dụng ức chế vi khuẩn dịch chiết trầu không sử dụng dung môi khác 27 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 28 4.2.1 Kết xác định khả chống oxy hóa chất chuẩn VTME (Alpha tocopherol) 28 4.2.2 Kết xác định khả chống oxy hóa dịch chiết rau má, rau sam, khế trầu không 30 4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 31 4.3.1 Kết xây dựng đồ thị chuẩn hàm lượng chlorogenic acid gia tăng giá trị mật độ quang đo phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu 31 iv   4.3.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol dịch chiết rau má, khế, rau sam, trầu không 33 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 KẾT LUẬN 35 KIẾN NGHỊ 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36  v   DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết nước nóng từ dược liệu trầu khơng, rau má, rau sam, khế nồng độ khác 22 Bảng 4.2: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết ethanol từ dược liệu trầu không, rau má, rau sam, khế nồng độ khác 23 Bảng 4.3: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết methanol từ dược liệu trầu không, rau má, rau sam, khế nồng độ khác 24 Bảng 4.4: Hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn VTME (AA%) xác định theo phương pháp sử dụng thuốc thử DPPH nồng độ khác 29 Bảng 4.5: Hoạt tính chống oxy hóa quy đổi theo VTME (mg) dược liệu (hàm lượng mg/100 mg dược liệu) chiết xuất dung môi khác 30 Bảng 4.6: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn chlorogenic acid (mg/ml) 32 Bảng 4.7: Hàm lượng polyphenol dược liệu quy đổi theo chlorogenic acid (mg/100 mg dược liệu) chiết xuất dung môi khác 33 vi   DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 2.1 : Cây trầu không dùng làm dược liệu Hình 2.2: Cây rau má sử dụng làm dược liệu Hình 2.3: Cây rau sam sử dụng thí nghiệm Hình 2.4: Lá khế sử dụng thí nghiệm 10 Hình 2.5: Cấu trúc số polyphenol 12 Hình 2.6: Cơ chế trung hịa gốc tự hoạt chất chống oxy hóa 13 Hình 2.7: Cấu trúc phân tử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 14 Hình 3.1: Máy quay chân khơng RE-501 Rotary evaporator, công ty Zhengzhou Keda, Trung Quốc (ảnh chụp phịng thí nghiệm) 18 Hình 3.2: Thang chuẩn độ đục McFarland dịch nuôi vi khuẩn 19 Hình 3.3: Sơ đồ mơ tả phương pháp trộn vi khuẩn vào mơi trường dinh dưỡng (ảnh chụp phịng thí nghiệm) 19 Hình 3.4: Ống khâu đồng có đường kính 10 mm 20 Hình 3.5: Máy quang phổ so màu 722 Ultra Violet - Visibility Spectrum, công ty Jinghua, Trung Quốc (ảnh chụp phịng thí nghiệm) 20 Hình 4.1: Ảnh chụp tạo dịch chiết trầu không – methanol tác dụng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 ([A]: Quan sát đen chụp đen 25 Hình 4.2: Các dịch chiết dược liệu [A] rau má – ethanol; [B] rau sam – methanol [C] khế - nước nóng khơng tạo vịng vơ khuẩn vi khuẩn E coli ATCC 25922 (ảnh phải: chụp đen, ảnh trái: chụp đèn soi ngược) 26 Hình 4.3: Sự thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo chất chuẩn VTME nồng độ khác (từ trái sang: cốc đối chứng, phản ứng VTME nồng độ từ mg/ml đến 0,45 mg/ml) 28 vii   Hình 4.4: Tác dụng làm chuyển màu thuốc thử DPPH trầu không so với ống đối chứng (từ trái sang phải: cốc đối chứng, cốc dịch chiết trầu khơng - nước nóng, ethanol, methanol) 31 Hình 4.5: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dược liệu thấp không làm đổi màu thuốc thử DPPH máy không phát thay đổi màu so với ống đối chứng 31 Hình 4.6: Sự thay đổi màu sắc tạo hệ nồng độ chất chuẩn chlorogenic acid tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteu (từ trái sang: cốc đối chứng âm , chlorogenic acid nồng độ từ 0,1 đến 0,1 mg/ml) 32 Hình 4.7: Polyphenol dịch chiết trầu khơng làm chuyển màu thuốc thử Folin-Ciocalteu (từ trái sang: côc đối chứng, cốc dịch chiết trầu khơng - nước nóng, ethanol, methnol) 34  viii   DANH MỤC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ Biểu đồ 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) tạo dịch chiết trầu khơng với loại dung mơi nước nóng, ethanol, methanol nồng độ 1000mg/ml 27  Đồ thị 4.2: Đồ thị biểu đạt mối tương quan nồng độ chất chuẩn VTME khả loại bỏ gốc tự phản ứng với thuốc thử DPPH 29  Đồ thị 4.4: Mối tương quan hàm lượng chất chuẩn chlorogenic acid ( mg/100mg dược liệu) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value) 33  ix PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 3.1.1 So sánh đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết dược liệu nồng độ khác Bảng 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết nước nóng từ dược liệu trầu khơng, rau má, rau sam, khế nồng độ khác Vi khuẩn Dược liệu Nồng độ A B C D E 1000mg/ml 15.00±0.00 17.50±0.50 18.50±0.50 14.40±0.30 20.70±0.70 500mg/ml 14.00±0.00 16.75±0.25 15.25±0.25 14.35±0.15 18.65±0.25 250mg/ml 14.00±0.00 12.25±0.25 13.25±0.25 14.00±0.00 17.15±0.35 125mg/ml 12.75±0.25 12.00±0.00 11.75±0.25 13.50±0.30 15.65±0.35 1000mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 1000mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 1000mg/ml 10.00±0.00 15.25±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 15.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 13.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 12.25±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 Trầu không Rau má Rau sam Khế A: E coli ATCC 25922; B: B subtilis ATCC 6633; C: G stearothermophilus; D: P aeruginosa ATCC 9027ATCC 7953; E: S aureus ATCC 25023   22 Từ bảng ta thấy: Dịch chiết nước nóng dược liệu trầu khơng có tác dụng ức chế với tất vi khuẩn, dịch chiết khế có ức chế với vi khuẩn B subtilis ATCC 6633, rau sam rau má khơng cho kết đường kính vịng vơ khuẩn vi khuẩn Dược liệu ức chế vi khuẩn mạnh trầu không cho tác dụng tốt vi khuẩn S aureus ATCC 25023, cho tác dụng yếu vi khuẩn P aeruginosa ATCC 9027 Bảng 4.2: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết ethanol từ dược liệu trầu không, rau má, rau sam, khế nồng độ khác Vi khuẩn Dược liệu Nồng độ A B C D E 1000mg/ml 22.35±0.15 19.15±0.15 18.25±0.25 13.55±0.05 15.25±0.55 500mg/ml 16.50±0.50 17.75±0.25 15.70±0.50 13.10±0.40 13.45±0.25 250mg/ml 11.50±0.50 16.10±0.10 15.60±0.10 12.25±0.25 12.45±0.15 125mg/ml 10.00±0.00 12.75±0.75 15.10±0.10 11.85±0.35 10.00±0.00 Trầu không 1000mg/ml 10.00±0.00 14.00±0.50 13.25±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 14.00±0.50 12.50±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 13.50±0.50 12.50±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 13.50±0.50 12.25±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 Rau má 1000mg/ml 10.00±0.00 13.00±0.00 13.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 12.25±0.25 12.75±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 12.00±0.00 12.25±0.25 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 12.00±0.00 12.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 Rau sam 1000mg/ml 10.00±0.00 17.30±1.00 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 16.65±0.65 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 15.85±1.05 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 14.95±0.35 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 Khế   23 Số liệu bảng 4.2 cho ta thấy: Dịch chiết ethanol dược liệu trầu khơng có tác dụng ức chế tất vi khuẩn, với dịch chiết rau sam rau má có tác dụng B subtilis ATCC 6633 G stearothermophilus ATCC 7953, khế có tác dụng B subtilis ATCC 6633 Dược liệu tạo đường kính vịng vơ khuẩn lớn trầu không vi E coli ATCC 25922 Bảng 4.3: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết methanol từ dược liệu trầu không, rau má, rau sam, khế nồng độ khác Vi khuẩn Dược liệu Nồng độ A B C D E 1000mg/ml 19.75±0.25 24.50±0.50 20.00±1.00 16.35±0.15 18.80±0.20 500mg/ml 16.75±0.25 21.15±0.15 17.25±0.25 14.50±0.00 15.40±0.10 250mg/ml 15.85±0.15 18.55±0.55 16.25±0.25 13.95±0.25 14.40±0.20 125mg/ml 13.25±0.25 15.50±0.50 15.40±0.10 13.15±0.15 10.00±0.00 Trầu không 1000mg/ml 10.00±0.00 14.50±0.30 13.65±0.15 14.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 14.10±0.30 12.50±0.50 13.45±0.45 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 13.80±0.10 10.00±0.00 13.40±0.40 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 13.45±0.55 10.00±0.00 13.00±0.60 10.00±0.00 Rau má 1000mg/ml 10.00±0.00 14.80±0.40 10.00±0.00 13.95±0.45 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 14.30±0.30 10.00±0.00 13.50±0.30 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 14.05±0.15 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 13.75±0.05 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 Rau sam 1000mg/ml 10.00±0.00 18.50±0.50 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 500mg/ml 10.00±0.00 17.10±0.60 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 250mg/ml 10.00±0.00 15.50±1.50 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 125mg/ml 10.00±0.00 14.25±0.75 10.00±0.00 10.00±0.00 10.00±0.00 Khế   24 Từ bảng nhận thấy rằng: Dịch chiết methanol dược liệu trầu khơng tạo đường kính vịng vơ khuẩn tất vi khuẩn, dịch chiết rau má có tác dụng B subtilis ATCC 6633, G stearothermophilus ATCC 7953 P aeruginosa ATCC 9027, dịch chiết rau sam có tác dụng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633, P aeruginosa ATCC 9027, cị khế có tác dụng với B subtilis ATCC 6633 Dược liệu ức chế vi khuẩn mạnh trầu không cho tác dụng tốt vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 [B] [A] Hình 4.1: Ảnh chụp tạo dịch chiết trầu không – methanol tác dụng vi khuẩn B subtilis ATCC 6633 ([A]: Quan sát đen chụp đen [B]: Quan sát đèn soi ngược)   25 [A] [B] [C] Hình 4.2: Các dịch chiết dược liệu [A] rau má – ethanol; [B] rau sam – methanol [C] khế - nước nóng khơng tạo vịng vơ khuẩn vi khuẩn E coli ATCC 25922 (ảnh phải: chụp đen, ảnh trái: chụp đèn soi ngược)   26 3.1.2 So sánh tác dụng ức chế vi khuẩn dịch chiết trầu không sử dụng dung môi khác Chúng tiến hành so sánh dịch chiết dược liệu ưu việt vi khuẩn trầu không Để so sánh hiệu ức chế vi khuẩn dịch chiết với dung mơi khác nhau, chúng tơi so sánh đường kính vịng vơ khuẩn nồng độ cao Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) 1000 mg/ml 30 25 20 15 10 E coli B subtilis DW G stearothermophilus Ethanol P aeruginosa S aureus Mehanol   Biểu đồ 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) tạo dịch chiết trầu không với loại dung môi nước nóng, ethanol, methanol nồng độ 1000mg/ml   27 Từ biểu đồ 4.1 nhận thấy dược liệu trầu khơng chiết dung mơi nước nóng cho đường kính vịng vơ khuẩn lớn vi khuẩn S aureus ATCC 25023, ethanol cho kết tốt vi khuẩn E coli ATCC 25922 methanol vi khuẩn lại B subtilis ATCC 6633, G stearothermophilus ATCC 7953 P aeruginosa ATCC 9027 4.2 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 4.2.1 Kết xác định khả chống oxy hóa chất chuẩn VTME (Alpha tocopherol) Trong thí nghiệm chúng tơi sử dụng VTME (Alpha tocopherol) làm chất chuẩn để quy đổi khả chống oxy hóa dược liệu Để làm vậy, trước hết tiến hành thiết lập đồ thị chuẩn nồng độ VTME với khả oxy hóa DPPH Kết thu được tập hợp bảng 4.4 thể đồ thị 4.2 Hình 4.3: Sự thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo chất chuẩn VTME nồng độ khác (từ trái sang: cốc đối chứng, phản ứng VTME nồng độ từ mg/ml đến 0,45 mg/ml)   28 Bảng 4.4: Hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn VTME (AA%) xác định theo phương pháp sử dụng thuốc thử DPPH nồng độ khác Nồng độ OD thí ngiệm OD đối chứng âm AA% 0.05 0.840 0.028 8.63 0.1 0.776 0.025 15.68 0.2 0.630 0.026 30.95 0.35 0.415 0.045 51.58 Từ bảng số liệu tiến hành xây dựng đồ thị mối tương quan nồng độ khả loại bỏ gốc tự VTME từ làm sở Khả loại bỏ gốc tự (%) tính tốn hàm lượng chất chống oxy hóa mẫu thí nghiệm 60 50 y = 143.71x + 1.5614 R² = 0.9995 40 30 20 10 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ VTME Đồ thị 4.2: Đồ thị biểu đạt mối tương quan nồng độ chất chuẩn VTME khả loại bỏ gốc tự phản ứng với thuốc thử DPPH Kết cho thấy mối tương quan thuận hàm lượng VTME mức độ tăng giá trị mật độ quang tạo phản ứng với thuốc thử DPPH, hệ số xác định R² 0,9995 p value < 0,001 Tương quan sử dụng để quy đổi tương đương mức độ gia tăng giá trị mật độ quang tạo dịch chiết phản ứng với thuốc thử DPPH   29 4.2.2 Kết xác định khả chống oxy hóa dịch chiết rau má, rau sam, khế trầu không Để khảo sát khả chống oxy hóa dịch chiết dược liệu, tiến hành so sánh mức độ chống oxy hóa tạo dịch chiết nồng độ 100 mg/ml Kết thể Bảng 4.5 Bảng 4.5: Hoạt tính chống oxy hóa quy đổi theo VTME (mg) dược liệu (hàm lượng mg/100 mg dược liệu) chiết xuất dung môi khác Dung mơi Nước nóng Ethanol Methanol Rau sam 0.85±0.04 0.42±0.08 0.31±0.19 Rau má 0.85±0.26 ND 0.18±0.17 Khế 1.45±0.12 ND 1.49±0.23 Trầu không 4.53±0.10 4.10±0.09 4.50±0.01 ND: Not detect Từ bảng 4.5 nhận thấy dịch chiết trầu không tất dung môi cho hàm lượng chất chống oxy hóa cao so với loại dược liệu khảo sát cịn lại, Trong trầu khơng chiết nước nóng có hàm lượng hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất, tiếp đến methanol, ethanol Đối với dược liệu khác dung mơi nước nóng thứ tự dịch chiết khế, rau má, rau sam, dung môi methanol cho kết khế cao theo sau rau sam rau má Với dung môi ethanol rau sam cho kết hoạt tính chống oxy hóa, cịn hai dược liệu cịn lại mức thấp ngưỡng phát máy   30 Hình 4.4: Tác dụng làm chuyển màu thuốc thử DPPH trầu không so với ống đối chứng (từ trái sang phải: cốc đối chứng, cốc dịch chiết trầu khơng - nước nóng, ethanol, methanol) Hình 4.5: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dược liệu thấp không làm đổi màu thuốc thử DPPH máy không phát thay đổi màu so với ống đối chứng 4.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG POLYPHENOL CỦA CÁC DỊCH CHIẾT DƯỢC LIỆU 4.3.1 Kết xây dựng đồ thị chuẩn hàm lượng chlorogenic acid gia tăng giá trị mật độ quang đo phản ứng với thuốc thử FolinCiocalteu Trong thí nghiệm xác định hàm lượng polyphenol, sử dụng chlorogenic acid làm chất chuẩn để quy đổi hàm lượng polyphenol dược liệu Để làm vậy, trước hết tiến hành thiết lập đồ thị tương quan nồng độ chlorogenic acid với gia tăng giá trị mật độ quang, đánh giá đo giá trị OD dung dịch tạo sau phản ứng với thuốc   31 thử Folin-Ciocalteu Kết thu được tập hợp bảng 4.6 thể đồ thị 4.3 Hình 4.6: Sự thay đổi màu sắc tạo hệ nồng độ chất chuẩn chlorogenic acid tác dụng với thuốc thử Folin-Ciocalteu (từ trái sang: cốc đối chứng âm , chlorogenic acid nồng độ từ 0,1 đến 0,1 mg/ml) Bảng 4.6: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn chlorogenic acid (mg/ml)   Nồng độ OD Thí ngiệm OD thí ngiệm Đối chứng âm 0.057 0.062 0.1mg/ml 0.211 0.183 0.14±0.016 0.2mg/ml 0.348 0.331 0.28±0.011 0.3mg/ml 0.473 0.41 0.38±0.034 0.4mg/ml 0.542 0.636 0.53±0.044 0.5mg/ml 0.697 0.69 0.63±0.01 0.6mg/ml 0.915 0.97 0.88±0.02 0.7mg/ml 0.96 0.987 0.91±0.01 0.8mg/ml 1.014 1.004 0.95±0.01 0.9mg/ml 1.263 1.224 1.18±0.02 1mg/ml 1.71 1.51 1.55±0.10 32 Mean Mức độ tăng giá tri mật độ quang (OD) 1.8 1.6 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 y = 1.4112x - 0.0318 R² = 0.9626 0.2 0.4 0.6 0.8 Nồng độ axit chlorogenic 1.2 Đồ thị 4.3: Mối tương quan hàm lượng chất chuẩn chlorogenic acid ( mg/100mg dược liệu) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang (OD value) Kết cho thấy có mối tương quan thuận hàm lượng axit chlorogenic mức độ tăng giá trị mật độ quang với hệ số xác định R² = 0,9626 p value < 0,05 Hàm tương quan sử dụng để quy đổi hàm lượng polyphenol mẫu thí nghiệm 4.3.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol dịch chiết rau má, khế, rau sam, trầu không Bảng 4.7: Hàm lượng polyphenol dược liệu quy đổi theo chlorogenic acid (mg/100 mg dược liệu) chiết xuất dung môi khác Dược liệu   Polyphenol (mg chlorogenic acid/ 100mg dược liệu) Nước nóng Ethanol Methanol Trầu khơng 4.67±0.42 5.47±0.22 6.57±0.18 Rau sam 0.85±0.14 0.37±0.02 0.67±0.09 Rau má 0.76±0.00 0.46±0.19 0.69±0.01 Khế 2.15±0.13 0.50±0.01 1.78±0.08 33 Từ bảng 4.7 nhận thấy dịch chiết trầu không methanol cho hàm lượng polyphenol cao nhất, tiếp đến ethanol nước nóng Ở ba dược liệu cịn lại nước nóng, methanol, ethanol Điều cho thấy dược liệu dung môi khác hàm lượng polyphenol chênh lệch điều xảy loại dược liệu khác     Hình 4.7: Polyphenol dịch chiết trầu không làm chuyển màu thuốc thử FolinCiocalteu (từ trái sang: côc đối chứng, cốc dịch chiết trầu không - nước nóng, ethanol, methnol)   34 PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trong nghiên cứu cho thấy dịch chiết dược liệu trầu không cho kết tác dụng ức chế vi khuẩn hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxi hóa cao phù hợp làm nguyên liệu cho nghiên cứu sản xuất dược phẩm thử nghiệm lầm sàng chữa bệnh nhiễm khuẩn gây ra, bảo vệ sức khỏe vật ni Ngồi nhận thấy khả kháng khuẩn chất chiết xuất từ dược liệu có tương quan chặt chẽ với hàm lượng polyphenol chúng, cho thấy hợp chất đóng phần vai trò khả ức chế vi khuẩn dược liệu Dung mơi sử dụng q trình chiết xuất đóng vai trị quan trọng thành phần hoạt chất hoạt tính sinh học dịch chiết thu Trong nghiên cứu sơ loại dược liệu có dung mơi lý tưởng cho việc chiết xuất hoạt chất kháng khuẩn, polyphenol thành phần hoạt tính chống oxy hóa KIẾN NGHỊ Cần thêm nhiều nghiên cứu để sâu vào xác định hoạt chất dược liệu chịu trách nhiệm cho khả kháng khuẩn hàm lượng hợp chất polyphenol chất chống oxy hóa, cần khảo sát thêm với dung mơi khác (VD: hexan, chloroform, aceton, ethyl acetate, ) để tìm loại ưu việt với mục đích chiết xuất Trong đông y thường sử dụng thang thuốc để chữa bệnh nên cần nghiên cứu thêm tính hiệp đồng loại dược liệu mục đích sử dụng khác   35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Bùi Thị Tho Nguyễn Thanh Hải (2013) Nghiên cứu tác dụng diệt khuẩn in vitro dịch chiết tỏi (Allium sativum L.) E coli gây bệnh E coli kháng Ampicillin, Kannamycin, Tạp chí Khoa học Phát triển, số 11: 804-808 Bùi Thị Tho Nguyễn Thị Thanh Hà (2009) Giáo trình dược liệu học thú y, Hà Nội, Nhà xuất Nông nghiệp Cao Quốc Chánh Nguyễn Văn Hoan (2006) Cây khế, Hà Nội, NXB Nông nghiệp, 121 tr Đỗ Tất Lợi (2004) Những thuốc vị thuốc Việt Nam, Hà Nội, NXB Y học Giang Trung Khoa, Bùi Quang Thuật Ngô Xuân Mạnh (2017) Thành phần polypenol hoat tính chống oxy hóa chè Shan (Camellia sinensis var Shan), Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, tập 5: 509-518 Huỳnh Anh Duy Nguyễn Thị Tuyết Nhi (2018) Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học tác dụng kháng viêm in vitro khế (Averrhoa carambola L.), Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, tập 54: 72-76 Phạm Văn Chính (2008) Đại cương dược liệu, Huế, trường Đại học Nông lâm Huế.  Tô Nguyễn Phước Mai Nguyễn Văn Mười (2021) Ảnh hưởng diều kiện trích ly quay chân khơng đến đặc tính cao chiết từ vỏ bưởi da xanh (Citrus maxima (BURN.) MERR), tạp chí khoa học trường đại học Cần Thơ, tập số 51, số chuyên đề Công nghệ thực phẩm (2021): 21-31 Viện Dược liệu (2006) Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam, Hà Nội, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật 10 Vụ Khoa học Công nghệ - Bộ Y tế (2005) Dược liệu (dùng đào tạo dược sỹ trung cấp), Hà Nội, Nhà xuất Y học Tiếng Anh Masuda, T., Oyama, Y., Inaba, Y., Toi, Y., Arata, T., Takeda, Y., Nakamoto, K., Kuninaga, H., Nishizato, S., and Nonaka, A (2002) "Antioxydant related activities of ethanol extracts from edible and medicinal plants cultivated in Okinawa, Japan." Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 10: 652-661 S Mahesh and B Satish (2008) Antimicrobial activity of some important medicinal plant against plant and human pathogens World J Agric Sci 4: 839-43 Suda, I., Oki, T., Nishiba, Y., Masuda, M., Kobayashi, M., Nagai, S., Hiyane, R., and Miyashige, T (2005) Polyphenol contents and radical scavenging activity of extracts from fruits and vegetables cultivated in Okinawa, Japan Nippon Shokuhin Kagaku Kogaku Kaishi 10: 462-471 Thanh Van Nguyen and Hai Thanh Nguyen (2019) Study on antibacterial effects of several vietnamese medicine plants and their relationships with polyphenol contents Asian J Pharm Clin Res 12 (4): 257-265 Yan-Xi Zhou, Hai-Liang Xin, Khalid Rahman, Su-Juan Wang, Cheng Peng and Hong Zhang (2015) Portulaca oleracea L.: A review of phytochemistry and pharmacological effects Biomed Research International 2015, 11 pages   36