Nghiên cứu tác dụng ức chế vi khuẩn và đánh giá hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa của hạt bí ngô

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA HẠT BÍ NGÔ HÀ NỘI – 2023 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG ỨC CHẾ VI KHUẨN VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG POLYPHENOL, HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA HẠT BÍ NGƠ Người thực : Lê Thị Phương Oanh Mã số sinh viên : 645673 Lớp : K64CNSHA Khoa : Công nghệ sinh học Người hướng dẫn : PGS.TS Nguyễn Thanh Hải : TS Nguyễn Thị Thanh Hà Bộ môn : CNSH Thực vật HÀ NỘI – 2023 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi, có hỗ trợ từ Giảng viên hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Thanh Hải TS Nguyễn Thị Thanh Hà Các số liệu, hình ảnh, bảng biểu kết đề tEthanol trung thực, khách quan; chưa cơng bố cơng trình nghiên cứu trước Tôi cam đoan tài liệu tham khảo sử dụng khố luận trích dẫn cách đầy đủ, đồng thời ghi rõ ràng nguồn gốc danh mục tài liệu kham khảo khoá luận theo quy định nhà trường Nếu phát có gian lận nào, tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm nội dung báo cáo Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Lê Thị Phương Oanh i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy cô môn Cơng nghệ sinh học thực vật tồn thể thầy cô khoa Công nghệ sinh học xây dựng chương trình đào tạo phù hợp, giúp em có hội học tập mơi trường bổ ích tạo điều kiện để em học hỏi, nghiên cứu hồn thành khố luận tốt nghiệp Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS.TS Nguyễn Thanh Hải TS Nguyễn Thị Thanh Hà tận tình hướng dẫn, ln quan tâm, ủng hộ tạo điều kiện tốt để em hồn thành khố luận tốt nghiệp Trong suốt thời gian làm khoá luận với hướng dẫn thầy cô, em không học hỏi học, kinh nghiệm quý giá liên quan đến trình nghiên cứu mà cịn trau dồi thêm nhiều kĩ năng, kiến thức bổ ích sống Tiếp theo, em xin gửi lời cảm ơn đến tất anh chị, bạn em địa điểm thực tập – Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, khoa Thú y nhiệt tình giúp đỡ, đồng hành động viên em suốt thời gian làm khoá luận Cuối cùng, em xin gửi tới gia đình, bạn bè người yêu thương em lời cảm ơn sâu sắc Cảm ơn ln dành quan tâm, sẵn sàng chia sẻ, đặt niềm tin tuyệt đối để em có động lực tinh thần tốt suốt trình học tập, nghiên cứu Kính chúc thầy cơ, gia đình người thật nhiều sức khoẻ, hạnh phúc thành công! Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Sinh viên Lê Thị Phương Oanh ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ix TÓM TẮT KHÓA LUẬN x PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa đề tài PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu hạt bí ngơ 2.1.1 Đặc điểm 2.1.2 Phân bố 2.1.3 Thành phần hóa học 2.1.4 Tác dụng 2.2 Nhu cầu sử dụng thuốc có nguồn gốc thảo dược tự nhiên giới 2.3 Tình hình nghiên cứu tác dụng dịch chiết hạt bí ngô 2.3.1 Nghiên cứu nước 2.3.2 Nghiên cứu nước 10 PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.1.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 11 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu 11 3.1.3 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 11 3.2 Phương pháp nghiên cứu 12 iii 3.2.1 Phương pháp chiết xuất dược liệu 12 3.2.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết dược liệu vi khuẩn 17 3.2.3 Phương pháp xác định hàm lượng polyphenol 19 3.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa 22 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 28 4.1 Kết đường kính vịng vơ khuẩn loại dịch chiết hạt bí ngơ trước sau tác dụng nhiệt 29 4.1.1 Kết đường kính vịng vơ khuẩn loại dich chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt 29 4.1.2 Kết đường kính vịng vơ khuẩn loại dịch chiết hạt bí ngơ xử lý nhiệt 37 4.1.3 So sánh kết đường kính vịng vơ khuẩn loại dịch chiết hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt 45 4.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol tổng số dịch chiết dược liệu 46 4.2.1 Kết hàm lượng polyphenol tổng số dịch chiết hạt bí ngơ 46 4.3 Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngơ 47 4.3.1 Kết xác định khả chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngơ 47 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52 5.1 Kết luận 52 5.2 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC 57 iv DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Sự thay đổi giá trị OD theo nồng độ chất chuẩn acid chlorogenic 21 Bảng 3.2: Hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn VTME xác định theo phương pháp sử dụng DPPH nồng độ khác (AA%) 24 Bảng 3.3: Hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn trolox xác định theo phương pháp sử dụng ABTS nồng độ khác (AA%) 27 Bảng 4.1: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ aceton chưa tác dụng nhiệt 30 Bảng 4.2: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ DW chưa tác dụng nhiệt 30 Bảng 4.3: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ ethanol chưa tác dụng nhiệt 31 Bảng 4.4: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ ethyl acetat chưa tác dụng nhiệt 33 Bảng 4.5: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ methanol chưa tác dụng nhiệt 34 Bảng 4.6: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ hexan chưa tác dụng nhiệt 35 Bảng 4.7: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ aceton tác dụng nhiệt 39 Bảng 4.8: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ ethanol tác dụng nhiệt 40 Bảng 4.9: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ hexan tác dụng nhiệt 41 Bảng 4.10: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ methanol tác dụng nhiệt 42 Bảng 4.11: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ DW tác dụng nhiệt 43 Bảng 4.12: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ ethyl acetat tác dụng nhiệt 44 Bảng 4.13: Khả chống oxy hóa dịch chiết đo thuốc thử DPPH 47 Bảng 4.14: Khả chống oxy hóa dịch chiết đo thuốc thử ABTS 49 v DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Cây hạt bí ngơ Hình 3.1: Li tâm lọc loại bỏ cặn dược liệu dung mơi hữu 13 Hình 3.2: Lọc dược liệu dung môi nước cất lần 13 Hình 3.3: Máy quay chân không 14 Hình 3.4 A: Dầu dịch chiết với dung môi hữu 15 Hình 3.5: Dịch chiết dược liệu thu sau hồ cao 15 Hình 3.6: Dịch chiết dược liệu pha loãng nồng độ khác 16 Hình 3.7: Dược liệu hạt bí ngơ sơ chế 17 Hình 3.8: Khuẩn lạc G philus mơi trường ni cấy MHA 17 Hình 3.9 Nhỏ dược liệu nồng độ khác môi trường nuôi cấy khuẩn (MHA) 18 Hình 3.10: Khả kháng khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ 19 Hình 3.11: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hàm lượng polyphenol tổng số, sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu's phenol 20 Hình 3.12: Mối tương quan nồng độ acid chlorogenic (mg/ml) với mức độ gia tăng giá trị đo mật độ quang 21 Hình 3.13 Sự thay đổi màu sắc dung dịch Folin-Ciocalteu tạo hàm lượng polyphenol axit cholorogenic (chất chuẩn) nồng độ khác (mg/ml) 22 Hình 3.14: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hoạt tính chống oxy hóa sử dụng thuốc thử DPPH 23 Hình 3.15: Mối tương quan hàm lượng chất chuẩn VTM E (mg/ml) khả loại bỏ gốc tự DPPH 24 Hình 3.16: Sự thay đổi màu sắc dung dịch DPPH tạo hoạt tính chống oxy hóa VTME (chất chuẩn) nồng độ khác (mg/ml) 25 vi Hình 3.17: Cơ chế phản ứng chuyển màu xác định hoạt tính chống oxy hóa sử dụng thuốc thử ABTS 26 Hình 3.18: Mối tương quan hàm lượng chất chuẩn trolox (mg/ml) khả bắt gốc tự ABTS2+ 27 Hình 3.19: Sự thay đổi màu sắc dung dịch ABTS tạo hoạt tính chống oxy hóa chất chuẩn trolox nồng độ khác (mg/ml) 28 Hình 3.20: Máy quang phổ so màu 722 Ultra Violet - Visibility Spectrum, công ty Jinghua, Trung Quốc 28 Hình 4.1: Đánh giá ảnh hưởng DMSO theo nồng độ (hình A) pH DMSO (hình B) đến phát triển vi khuẩn 29 Hình 4.2: Vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngô chưa tác dụng nhiệt ethanol vi khuẩn S aureus nồng độ 2g/ml 32 Hình 4.3: Vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt ethanol vi khuẩn Sal nồng độ 2g/ml 32 Hình 4.4: Vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt -ethyl acetat vi khuẩn G philus 33 Hình 4.5: Vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngô chưa tác dụng nhiệt methanol vi khuẩn B sub 34 Hình 4.6: Vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt -hexan vi khuẩn G philus nồng độ g/ml 35 Hình 4.7: Biểu hoạt tính kháng khuẩn khơng tn theo quy luật nồng độ (đường kính vịng vô khuẩn nồng độ < nồng độ 1; 0.5 g/ml) 37 Hình 4.8: Dịch chiết hạt bí ngơ tác dụng nhiệt khơng có hoạt tính kháng khuẩn E coli ATCC 85922, E coli ATCC 35218, P seudo, Sal 38 Hình 4.9: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - aceton vi khuẩn B sub nồng độ g/ml 39 Hình 4.10: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - ethanol vi khuẩn B sub nồng độ g/ml 40 vii Hình 4.11: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - hexan vi khuẩn B sub nồng độ 0,5 g/ml 41 Hình 4.12: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - methanol vi khuẩn B sub 42 Hình 4.13: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - DW vi khuẩn B sub 43 Hình 4.14: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - ethyl acetat vi khuẩn B sub nồng độ 0,5 g/ml 44 Hình 4.15: Polyphenol dịch chiết hạt bí ngơ nồng độ 100 mg/ml 47 Hình 4.16: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dược liệu hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt nồng độ 200mg/ml không làm đổi màu thuốc thử DPPH 48 Hình 4.17: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngô xử lý nhiệt nồng độ 200 mg/ml làm đổi màu thuốc thử DPPH 49 Hình 4.18: Hoạt tính chống oxy hố dịch hạt bí ngô chưa tác dụng nhiệt với dung môi hexan nồng độ 200 mg/ml 49 Hình 4.19: Hoạt tính chống oxy hố dịch hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt với dung môi DW nồng độ 200 mg/ml 50 viii dịch chiết g/ml, đường kính vịng vơ khuẩn B sub mang giá trị 4,12 ± 0,55 mm G philus 2,10 ± 2,10 mm Bảng 4.12: Đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ ethyl acetat tác dụng nhiệt Dung mơi Vi khuẩn Kích thước đường kính vịng vơ khuẩn (mm) 0.25 (g/ml) 0.5 (g/ml) (g/ml) (g/ml) 1,25 ± 1,25 x 1,80 ± 1,80 3,20 ± 0,11 B sub 5,14 ± 0,28 5,57 ± 0,26 5,02 ± 0,37 5,13 ± 0,29 G philus 4,10 ± 0,12 4,31 ± 0,02 4,84 ± 0,09 4,31 ± 0,61 S aureus Ethyl acetat ATCC 25023 Ghi chú: Giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn giá trị x: khơng xuất đường kính vịng vơ khuẩn Dịch chiết hạt bí ngơ tác dụng nhiệt với dung mơi ethyl acetat thể hoạt tính kháng khuẩn S aureus ATCC 25023, B sub G philus Đối với B sub G philus, giá trị đường kính vịng vơ khuẩn có thay đổi nhẹ theo nồng độ Cụ thể, đường kính vịng vơ khuẩn B sub dao động từ 5,02 5,07 mm, G philus tương tự dao động khoảng 4,10 - 4,84 mm 0.5 0,25 B sub - Ethyl acetat Hình 4.14: Kích thước vịng vơ khuẩn (mm) dịch chiết hạt bí ngơ tác dung nhiệt - ethyl acetat vi khuẩn B sub nồng độ 0,5 g/ml 44 Dựa vào bảng 4.7 - 4.12, nhận thấy có thay đổi hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ tác dụng nhiệt Dịch chiết dung môi hexan DW cho thấy hoạt tính kháng khuẩn hiệu Methanol, aceton, ethyl acetat thuộc nhóm dung mơi có dịch chiết mang hoạt tính kháng khuẩn hiệu Cụ thể: dịch chiết methanol biểu tác dụng ức chế chủng vi khuẩn, đường kính vịng vơ khuẩn vi khuẩn nồng độ g/ml đạt từ 3.75 - 4.83 mm; dịch chiết dung mơi aceton có hoạt tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn gram (+), đường kính vịng vơ khuẩn nồng độ mang giá trị từ 3.97 - 6.58 mm; đường kính vịng vơ khuẩn dịch chiết dung mơi ethyl acetat đạt 3.20 - 5.13 mm có tác dụng chủng vi khuẩn gram (+), trừ S aureus ATCC 25923 Tất dịch chiết mang tác dụng ức chế phát triển B sub tốt Dịch chiết dung môi ethanol mang hoạt tính kháng khuẩn có hiệu nhất, đường kính vịng vơ khuẩn nồng độ g/ml đạt từ 3.74 - 6.30 mm, so với dịch chiết dung mơi aceton nồng độ g/ml dịch chiết có giá trị đường kính vịng vơ khuẩn bé nồng độ 0,25; 0,5; g/ml lại mang giá trị lớn có tác dụng kháng khuẩn chủng vi khuẩn phổ biến nghiên cứu 4.1.3 So sánh kết đường kính vịng vơ khuẩn loại dịch chiết hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ trước sau xử lý nhiệt có thay đổi rõ ràng Mặc dù trước tác dụng nhiệt lên hạt bí ngơ dịch chiết với ethanol, hoạt tính kháng khuẩn thể E coli ATCC 85922, E coli ATCC 35218, P seudo Sal lớn tác dụng nhiệt lên hạt bí ngơ hoạt tính kháng khuẩn hồn tồn tác dụng vi khuẩn Tương tự đó, dịch chiết với dung mơi aceton làm hoàn toàn tác dụng kháng khuẩn P seudo sau xử lý nhiệt Cũng với dung môi ethanol, dịch chiết hạt bí ngơ xử lý nhiệt làm giảm tác dụng kháng khuẩn so với dịch chiết hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt Cụ thể, vi khuẩn 45 S aureus ATCC 25023 giảm khoảng 3.6 lần S aureus ATCC 25923 giảm khoảng 4.4 lần Dịch chiết dung môi methanol, DW làm giảm khơng đáng kể hoạt tính kháng khuẩn dược liệu sau xử lý nhiệt Trong đó, dịch chiết hạt bí ngơ xử lý nhiệt dung mơi hexan làm tăng giá trị đường kính vịng vơ khuẩn B sub nồng độ ethyl acetat làm giá trị đường kính vịng vô khuẩn nồng độ G philus từ 3.38 mm lên 4.31mm Điều lí giải dược liệu tiếp xúc với nhiệt độ cao số hợp chất có phân tử lớn bị bẻ gãy thành phân tử nhỏ hơn, dễ hấp thu có tác dụng mạnh Trong khí hoạt động kháng khuẩn dịch chiết hạt bí ngơ sau tác dụng nhiệt với dung môi hexan ethyl acetat vi khuẩn gram (+) tăng lên kết dung mơi vi khuẩn gram (-) lại giảm xuống Có thể giải thích hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết với dung mơi cao phụ thuộc vào tính tan thành phần tạo tác dụng có loại dược liệu dung môi khác phụ thuộc vào chất dược liệu (Cowan, 1999) Do chưa có đủ chứng chế tác động thay đổi cấu trúc hoạt chất có tác dụng kháng khuẩn hạt bí ngơ sau tác dụng nhiệt, giả thiết đưa hợp chất có tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn gram (+) vi khuẩn gram (-) khác 4.2 Kết xác định hàm lượng polyphenol tổng số dịch chiết dược liệu 4.2.1 Kết hàm lượng polyphenol tổng số dịch chiết hạt bí ngơ Hàm lượng polyphenol dịch chiết hạt bí ngơ trước sau xử lý nhiệt khơng xác định Các dịch chiết hạt bí ngơ đo khởi đầu từ nồng độ 20 mg/ml để xác định hàm lượng polyphenol, nồng độ gấp 6.5 lần so với nồng độ lớn 3.0mg/ml dãy chất chuẩn Tuy nhiên từ hình 4.8 đây, tăng nồng độ dịch chiết lên tới 100 mg/ml (tương đương gấp khoảng 33 lần), màu sắc dịch chiết khơng nhận thấy có thay 46 đổi so với ống blank Ở thí nghiệm chưa nhận thấy hàm lượng polyphenol dịch chiết hạt bí ngơ, điều phương pháp nghiên cứu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu chưa phù hợp loại dược liệu Blank Methanol Ethanol Aceton Ethyl acetat Hexan DW Hình 4.15: Polyphenol dịch chiết hạt bí ngơ nồng độ 100 mg/ml 4.3 Kết xác định hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngơ 4.3.1 Kết xác định khả chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngơ Hoạt tính chống oxy hố dịch chiết hạt bí ngơ chưa hạt bí ngơ thô đo khởi đầu nồng độ 20mg/ml Dựa vào mức độ làm đổi màu thuốc thử tiến hành tăng nồng độ dịch chiết dược liệu để quan sát khả chống oxy hoá chúng Bảng 4.13: Khả chống oxy hóa dịch chiết đo thuốc thử DPPH Dung mơi Methanol Hoạt tính chống oxy hóa quy đổi theo mg VTME/100 mg dược liệu Hạt bí ngơ tác Hạt bí ngơ dụng nhiệt 0,017 ± 0,003 0,041 ±0,001 Ethanol ND 0,122 ±0,097 Aceton ND 0,031 ± 0,002 Ethyl acetat ND 0,020 ± 0,001 Hexan ND 0,021 ± 0,002 DW ND 0.075 ± 0.006 (Chú thích: ND: Not Detect) 47 Tại nồng độ đo khởi đầu 20mg/ml, dịch chiết hạt bí ngơ chưa trước sau xử lý nhiệt không làm đổi màu thuốc thử DPPH Tăng dần nồng độ đến 200mg/ml, dịch chiết hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt xuất giá trị hoạt tính chống oxy hố 0.017 ± 0.003 dung mơi methanol, dung mơi cịn lại không làm đổi màu thuốc thử không xác định giá trị Trong đó, dịch chiết dung mơi hạt bí ngơ xử lý nhiệt làm đổi màu thuốc thử (hình 4.12), đổi màu khơng nhiều nhận giá trị hoạt tính chống oxy hố khởi sắc cho thí nghiệm khảo sát Hoạt tính chống oxy hố dịch chiết hạt bí ngơ xử lý nhiệt đạt hiệu chiết dung môi ethanol 0.122 ± 0.097 mg VTME /100 mg dược liệu, dịch chiết dung môi DW 0.075 ± 0.006 mg VTME /100 mg dược liệu Tuy hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt, dịch chiết dung môi methanol mang giá trị mg VTME/100 mg dược liệu cao hạt bí ngơ có tác dụng nhiệt giá trị tăng đạt vị trí thứ (0.041 ±0.001 mg VTME/100 mg dược liệu) Các dịch chiết hạt bí ngơ có tác dụng nhiệt mang hoạt tính chống oxy hoá xếp theo chiều giảm dần dung môi aceton (0.031 ± 0.002 mg VTME/100 mg dược liệu) > hexan (0.021 ± 0.002 mg VTME/100 mg dược liệu) > ethyl acetat (0.020 ± 0.001 mg VTME/100 mg dược liệu) Qua dễ dàng nhận thấy phương pháp này, kết thu dịch chiết hạt bí ngơ hoạt tính chống oxy hố Control Aceton Ethyl acetat Ethanol Hexan DW Methanol Hình 4.16: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết dược liệu hạt bí ngơ chưa xử lý nhiệt nồng độ 200mg/ml không làm đổi màu thuốc thử DPPH 48 Control Ethyl acetat Hexan Aceton Methanol DW Ethanol Hình 4.17: Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết hạt bí ngơ xử lý nhiệt nồng độ 200 mg/ml làm đổi màu thuốc thử DPPH Bảng 4.14: Khả chống oxy hóa dịch chiết đo thuốc thử ABTS Dung mơi Hoạt tính chống oxy hóa quy đổi theo mg trolox/100mg dược liệu Hạt bí ngơ Hạt bí ngô thô Methanol ND ND Ethanol ND ND Aceton ND ND Ethyl acetat ND ND Hexan 0.012 ± 0.003 ND DW ND 0.007 ± 0.002 (Chú thích: ND: Not Detect) Control Sample Blank Hạt bí ngơ Sample Blank Hạt bí ngơ xử lý nhiệt Hình 4.18: Hoạt tính chống oxy hố dịch hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt với dung môi hexan nồng độ 200 mg/ml 49 Control Sample Blank Hạt bí ngơ Sample Blank Hạt bí ngơ xử lý nhiệt Hình 4.19: Hoạt tính chống oxy hố dịch hạt bí ngô chưa tác dụng nhiệt với dung môi DW nồng độ 200 mg/ml Tương tự với DPPH, thuốc thử ABTS bị màu phản ứng với dịch chiết hạt bí ngơ chưa thơ Dịch chiết hạt bí ngơ tác dụng nhiệt với dung môi DW làm đổi màu thuốc thử nhiều đồng nghĩa với việc mang hoạt tính chống oxy hố cao với hạt bí ngơ chưa tác dụng nhiệt dịch chiết với dung mơi hexan cho thấy hoạt tính chống oxy hố Tất dịch chiết dung môi cịn lại khơng xác định hoạt tính chống oxy hố dược liệu Điều giải thích độ phân cực, hồ tan hoạt chất dịch chiết khác nên hoạt tính dược liệu so với dung môi khác biểu khác Bên cạnh đó, dạng thô, dịch chiết dược liệu cho thấy hoạt tính chống oxy hố so với dược liệu chưa sao, kết hoàn toàn giống với hướng thí nghiệm thực So với phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá thuốc thử DPPH, phương pháp sử dụng thuốc thử ABTS biểu nhiều giá trị không xác định hơn, giá trị không xác định hàm lượng chất chống oxy hố dịch chiết dược liệu q ít, khơng đủ để làm đổi màu thuốc thử, đo OD ống thí nghiệm, giá trị tương đương với ống đối chứng, làm cho trình xử lý liệu mang giá trị 0.00 chí âm Các nghiên cứu công bố trước cho thấy hạt bí ngơ xem loại 50 thực phẩm, thảo dược có hoạt tính chống oxy hố mạnh, có cơng dụng hữu hiệu chăm sóc da làm đẹp Tuy nhiên thí nghiệm khảo sát nhận thấy hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hố hạt bí ngơ chưa có mang giá trị hiệu cao Có thể q trình hoà cao thu dịch chiết loại bỏ dầu, mà hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hố lại nằm chủ yếu lượng dầu Nghiên cứu đặc điểm chống oxy hóa thành phần dầu hạt bí ngơ 12 giống bí ngơ thuộc lồi Cucurbita maxima Duch Cucurbita pepo L., sử dụng dung môi chiết xuất methanol 80% ethanol 50% (M Murkovic cộng sự, 1996) Kết cho thấy hạt giống thuộc loài C maxima đặc trưng hàm lượng axit béo cao so với hạt lồi C pepo Phân tích hoạt động chống oxy hố tạo phát hạt giống bí ngơ thuộc lồi C pepo thể đặc tính chống oxy hóa tốt hơn, dung môi chiết xuất sử dụng Ethanol 50% hiệu metanol 80% sử dụng làm chất chiết xuất Các giá trị hoạt động chống oxy hóa thu với 50% ethanol cao so với giá trị đạt với 80% metanol So với kết thí nghiệm đề tài nghiên cứu em, điểm tương đồng nghiên cứu tác dụng dung môi ethanol chiết xuất hạt bí ngơ hiệu so với dung môi khác khảo sát Điểm khác biệt rõ phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá, nghiên cứu M Murkovic cộng (1996) phân tích NP-HPLC/FLD với hexane/dioxan (96/4) làm chất rửa giải, với phát huỳnh quang 292/335 nm thay phương pháp thơng thường sử dụng thuốc thử DPPH ABTS Bên cạnh đó, phương pháp M Murkovic cộng (1996) khơng khảo sát hoạt tính kháng khuẩn dược liệu sử dụng dung mơi ethanol 50% methanol 80% chiết xuất thay sử dụng methanol, ethanol bổ sung thêm dung môi chiết xuất aceton, ethyl acetat, hexan DW, nghiên cứu có đa dạng yếu tố khảo sát 51 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 Kết luận Hạt bí ngơ có tác dụng kháng khuẩn phụ thuộc vào nồng độ, dung môi, chủng vi khuẩn Chưa xác định hoạt chất polyphenol hoạt tính chống oxy hóa chưa cao hạt bí ngơ Khi tác dụng nhiệt, làm giảm đáng kể tác dụng kháng khuẩn S aureus làm khả kháng khuẩn E coli ATCC 85922, E coli ATCC 35218, P seudo Sal làm xuất làm tăng giá trị hoạt tính chống oxy hố hạt bí ngơ Ở dạng trước sau tác dụng nhiệt, dịch chiết với dung môi ethanol cho thấy tác dụng kháng khuẩn vi khuẩn lớn phổ biến nhất, dịch chiết dung môi DW hiệu  Dịch chiết hạt bí ngơ với dung mơi ethanol cho thấy khả ức chế vi khuẩn có hiệu nhất, đặc biệt đối S aureus Khi tác dụng nhiệt, dịch chiết với dung môi mang hoạt tính chống oxy hố lớn 5.2 Kiến nghị Do thời gian nghiên cứu ngắn chưa đủ điều kiện nên chưa thể khảo sát đa dạng loại dược liệu với dung môi cách chiết xuất cá phương pháp thực khác Tơi mong tương lai có nhiều nghiên cứu khả kháng khuẩn với dược liệu dung mơi khác để tìm bào chế thuốc kháng sinh có nguồn gốc thực vật Cần có nghiên cứu sâu sử dụng HPLC để xác định hàm lượng nhóm hoạt chất thực vật giải thích nhóm chất chịu trách nhiệm cho tác dụng chúng vi khuẩn Ngoài ra, cần thực tách chiết nghiên cứu hoạt tính dầu hạt bí ngơ để làm rõ khẳng định lần hàm lượng polyphenol hoạt tính chống oxy hố hạt bí ngơ 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Bùi Thị Tho (2003) “Thuốc kháng sinh nguyên tắc sử dụng chăn nuôi", NXB Hà Nội Bùi Thị Tho & Nguyễn Thị Thanh Hà (2009) Giáo trình Dược liệu Thú y Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Đỗ Tất Lợi (1999) Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội Lê Văn Cơ, Nguyễn Thị Xuân San, Nguyễn Thị Thanh & Ngũ Trường Nhân (2018) Khảo sát khả bắt goóc tự DPPH, ABTS số loài nấm linh chi đen (Amauroderma) thu hái tỉnh Đắk Lắk Tạp chí Y dược học Cần Thơ Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Hiền Nguyễn Ánh Tuyết, 2003 Thí nghiệm vi sinh vật học, Trang 130-160 Nhà xuất đại hoc quốc gia Nguyễn Minh Thông (2016) Luận án Tiến sĩ hoá lý thuyết hoá lý Nghiên cứu cấu trúc, khả chống oxy hoá số polyphenol dẫn xuất Fullerece (C60) phương pháp hố tính tốn Đại học HuếTrường Đại học Khoa học 5-105 Nguyễn Thị Thanh Hà, Lê Phương Hồng Thủy, Nguyễn Văn Thanh, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đào Văn Cường, Nguyễn Văn Cường, Nguyễn Huy Thái, Nguyễn Thanh Hải khảo sát hàm lượng polyphenol, hoạt tính chống oxy hóa kháng khuẩn vi khuẩn escherichia coliatcc 25922 số lồi thảo dược Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2021, 19(12): 16281639 Phạm Ngọc Khôi, Phùng Thanh Sơn (2017) Tối ưu hố quy trình chiết xuất khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng oxy hoá diếp cá (Houttuynia cordata) Trường Đại học Đồng Tháp Tạp chí Khoa học số 27 Trần Văn Khoa, Lê Trung Hiếu, Trần Thanh Minh, Hồ Xuân Anh Vũ & Trần Thị Văn Thi (2020) Ảnh hưởng hệ dung môi chiết đến hàm lượng tổng hợp chất phenol, tổng flavonoid hoạt tính chống oxy hoá cao 53 chiết từ nấm Ophiocordyceps Sobolifera Tạp chí Khoa học cơng nghệ trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 17(2):14-23 10 Sức khoẻ & đời sống (2016) Hạt bí ngơ ngừa ung thư Truy cập từ https://suckhoedoisong.vn/hat-bi-ngo-co-the-ngua-ung-thu169118529.htm 11 Viện diện liệu - Bộ Y Tế "Nghiên cứu phát triển dược liệu đông dược Việt Nam" Nhà xuất khoa học kĩ thuật, 2005 Tài liệu tiếng anh Abbas, M., Saeed, F., Anjum, F M., Afzaal, M., Tufail, T., Bashir, M S., … Suleria, H A R (2016) Natural polyphenols: An overview International Journal of Food Properties, 1699 doi:10.1080/10942912.2016.1220393 20(8), 1689– Ahmad Khan, M S., & Ahmad, I (2019) Herbal Medicine New Look to Phytomedicine, 3–13 doi:10.1016/b978-0-12-814619-4.00001-x Ates D.A and Erdourul Z.T., Antimicrobial activities of various medicinal and commercial plant extracts Turk J Biol., 27(1), 157- 162, (2003) Truy cập từ: https://citeseerx.ist.psu.edu/viewdoc/download?doi=10.1.1.545.6825&rep=r ep1&type=pdf Bhatt (2015): Herbs and Herbal Supplements, a New Nutritional Approach in Animal Nutrition Iranian Journal of Applied Animal Science 5(3): 497-516 Cowan M.M (1999) Plant products as antimicrobial agents Clinical Microbiology Reviews 12:564-82 C S Vidhya, M Loganathan, N Baskaran, S Bhuvana & R Meenatchi (2022): Evaluation of in vitro antitumor activity of an aqueous extract of C Maxima seeds International Journal of Health Sciences DOI: 10.53730/ ijhs.v6nS2.6788 Fatos Rexhepi, Aziz Behrami, Cristina Samaniego-SÃ, Mohammad Samaniego-SÃ, da Silva & Carolina Krebs de Souza (2022) CHEMICAL TRANSFORMATION OF Pumpkin Seed Oil and Impact on Lipid Stability 54 During Heat Treatment: FTIR spectroscopy study Journal of Microbiology, Biotechnology and Food Science 11(6):5839-5839 Faraja D Gonelimali, Jiheng Lin, Wenhua Miao, Jinghu Xuan, Fedrick Charles1, Meiling Chen & Shaimaa R Hatab (2018) Antimicrobial Properties and Mechanism of Action of Some Plant Extracts Against Food Pathogens and Spoilage Microorganisms Frontiers in Microbiology Doi: 10.3389/fmicb.2018.01639 Gonelimali, F.D., J Lin, W Miao, J Xuan, F Charles, M Chen and S.R Hatab (2018) Antimicrobial properties and mechanism of action of some plant extracts against food pathogens and spoilage microorganisms Frontiers in Microbiology 9:1639 10 Kasote, D M., Katyare, S S., Hegde, M V., & Bae, H (2015) Significance of Antioxidant Potential of Plants and its Relevance to Therapeutic Applications International Journal of Biological Sciences, 11(8):982–991 doi:10.7150/ijbs.12096 11 Kotzekidou, P (2014) Bacillus Geobacillus stearothermophilus (Formerly Bacillus stearothermophilus) Encyclopedia of Food Microbiology, 129– 134 doi:10.1016/b978-0-12-384730-0.00020-3 12 Lee, J.-W., Ji, Y.-J., Yu, M.-H., Bo, M.-H H., Seo, H.-J., Lee, S.-P., & Lee, I.-S (2009) Antimicrobial effect and resistant regulation of Glycyrrhiza uralensison methicillin-resistantStaphylococcus aureus Natural Product Research, 23(2):101–111 doi:10.1080/14786410801886757 13 Medicinal plants and their traditional uses in different locations Juan José Maldonado Miranda, in Phytomedicine, 2021 https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128241097000145 14 M Murkovic, A Hillebrand, J Winkler, W Pfannhauser (1996) Variability of vitamin E content in pumpkin seeds (Cucurbita pepo L) Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und Forschung 202: 275-278 15 M Ziaul Amin, Tahera Islam Rity, M Rasel Uddin, Md Mashiar Rahman & M Jashim (2020) A comparative assessment of anti-inflammatory, antioxidant and anti-bacterial activities of hybrid and indigenous varieties of 55 pumpkin (Cucurbita maxima Linn.) seed oil Biocatalysis and Agricultural Biotechnology 28 Doi:10.1016/j.bcab.2020.101767 16 Niharika Sahoo, Padmavati Manchikanti & Satyahari Dey (2010) Review of Herbal Medicines: Standards and Regulations Fitoterapia 81(6):462-471 17 PAREKH, JIGNA, JADEJA, DARSHANA, CHANDA & SUMITRA (2005) Efficacy of aqueous and Methanol extracts of some medicinal plants on potential antibacterial activity Turkish Journal of Biology 29(4):203210 18 Priyanka Dash & Goutam Ghosh (2017) Amino acid profiling and antimicrobial activity of Cucurbita moschata and Lagenaria siceraria seed protein hydrolysates Natural 10.1080/14786419.2017.1359174 Product Research DOI: 19 Steve Yan, S., Pendrak, M L., Abela-Ridder, B., Punderson, J W., Fedorko, D P., & Foley, S L (2004) An overview of Salmonella typing Clinical and Applied Immunology Reviews, 4(3): 189– 204 doi:10.1016/j.cair.2003.11.002 56 PHỤ LỤC Hình 1: Dung dịch chuẩn McFarland mức khác để so sánh độ đục nồng độ vi khuẩn tương ứng với độ đục Hình 2: Thành tế bào vi khuẩn gram (+) gram (-) 57 (Nguồn: Nely Fany, 2009.) Hình 3: Bài báo nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố 17 loại hương liệu sử dụng thuốc thử DPPH thích “ND” 58